CN111455042A - 长链非编码rna mir210hg在诊治子痫前期中的应用 - Google Patents

长链非编码rna mir210hg在诊治子痫前期中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111455042A
CN111455042A CN202010409041.1A CN202010409041A CN111455042A CN 111455042 A CN111455042 A CN 111455042A CN 202010409041 A CN202010409041 A CN 202010409041A CN 111455042 A CN111455042 A CN 111455042A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir210hg
preeclampsia
expression
lncrna
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010409041.1A
Other languages
English (en)
Inventor
刘世国
张璐
刘文淼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affiliated Hospital of University of Qingdao
Original Assignee
Affiliated Hospital of University of Qingdao
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Affiliated Hospital of University of Qingdao filed Critical Affiliated Hospital of University of Qingdao
Priority to CN202010409041.1A priority Critical patent/CN111455042A/zh
Publication of CN111455042A publication Critical patent/CN111455042A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供lncRNA MIR210HG在子痫前期诊治中的应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。经研究发现，本发明首次证明了在PE孕妇胎盘组织MIR210HG表达上调。在PE孕妇胎盘滋养细胞HT8/SVneo敲低MIR210HG的表达，滋养层细胞表现出细胞增殖、迁移增加。本发明提出PE新致病机制，有望为诊断和治疗PE提供新靶点及理论依据，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

长链非编码RNA MIR210HG在诊治子痫前期中的应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及长链非编码RNA MIR210HG在诊治子痫前期中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
子痫前期(Pre-eclampsia,PE)是一种发生在妊娠期间的高血压疾病，影响着约5-8％的妊娠女性，PE/子痫与10-15％的孕产妇直接死亡有关。PE与母亲的子痫和HELLP综合征，以及胎儿的早产、宫内生长受限和围产期死亡相关。PE对产妇和分娩后后代的健康以及生活质量都有不利影响。有PE病史的女性，在以后的生活中患心血管并发症的风险增加2倍，患终末期肾病的风险增加5-12倍。近30年来，报道了多种与PE发病机制有关的因素，包括缺氧及氧化应激、子宫螺旋动脉重构、内皮功能失调、母体血管破坏、浅层滋养细胞侵袭和炎症等。尽管PE是全世界孕产妇和围产期发病率和死亡率的主要原因之一，但该病的发病机制仍不清楚。
近年来，长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)受到越来越多的关注。有研究发现lncRNA似乎与糖尿病、高血压、肾脏疾病、肝癌等多种疾病都有关联。既往研究已经证实lncRNAs可能参与PE的病理发展。有研究结果表明，lnc-H19可能通过转录后机制和印迹调控调控基因表达，通过下调miR-675并干扰节点信号，导致早发性重症PE中滋养细胞过度增殖。lnc-MEG3通过NF-κB和Bax/Bcl2信号通路参与滋养层细胞的凋亡，从促使子宫螺旋动脉重构失败，导致胎盘深层形成缺陷。然而，发明人发现，目前针对与子痫前期相关的lncRNAs报道仍然较少。因此，发现更多与子痫前期相关的lncRNAs，并对他们在疾病中所起的生物学功能进行研究，并深入探索其分子机制，则有助于对该疾病的早期诊断及治疗。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供长链非编码RNA MIR210HG在诊治子痫前期中的应用。本发明提供了一种与子痫前期发生发展相关的lncRNA，从而为子痫前期的诊断和治疗提供分子靶标，有助于实现患者的个性化诊疗，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供lncRNA MIR210HG作为分子标志物在制备检测、诊断或预测子痫前期进展的产品中的应用。
经试验证明，所述lncRNA MIR210HG在PE孕妇胎盘组织表达上调。
本发明的第二个方面，提供检测上述子痫前期分子标志物的物质在制备检测、诊断或预测子痫前期的进展的产品中的应用。
所述产品可以为试剂盒。
本发明的第三个方面，提供一种用于检测、诊断或预测子痫前期的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测子痫前期样品中lncRNA MIR210HG的物质；或基于免疫检测方法检测子痫前期样品中lncRNAMIR210HG调控的靶基因的表达情况的物质。
更进一步的，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述用于检测、诊断或预测子痫前期的进展的组合物。
本发明的第四个方面，提供抑制lncRNA MIR210HG表达和/或活性降低的物质在制备子痫前期预防或治疗药物中的应用。
经研究发现，抑制lncRNA MIR210HG的表达促进了滋养层HTR8/SVneo细胞增殖及迁移作用。
本发明的第五个方面，提供一种用于预防或治疗子痫前期的药物组合物，其包含抑制lncRNA MIR210HG表达和/或活性降低的物质。
本发明的第六个方面，提供一种筛选治疗子痫前期的候选药物的方法，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有lncRNA MIR210HG的体系；和检测所述体系中lncRNA MIR210HG的表达；
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次证明了在PE孕妇胎盘组织lncRNA MIR210HG表达上调。在PE孕妇胎盘滋养细胞HT8/SVneo敲低MIR210HG的表达，表现出细胞增殖、迁移增加。上述技术方案提出PE新致病机制，有望为诊断和治疗PE提供新靶点及理论依据，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中MIR210HG在PE胎盘中的表达与ADAMTS7显著正相关图。(A)RNA-seq差异LncRNA火山图。(B)RNA-seq差异LncRNA热图。箭头所指为MIR210HG表达变化。(C)MIR210HG mRNA在PE组(n＝35)和对照组(n＝32)胎盘中的表达。
图2为本发明实施例1中滋养层细胞验证MIR210HG siRNA的敲低效率。*P<0.05。
图3为本发明实施例1中MIR210HG对滋养层HTR8/SVneo细胞增殖及迁移的作用。(A)细胞培养24hr后用CCK-8试剂检测。(B)transwell细胞迁移的代表性图片。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
需要说明的是，本发明的lncRNA MIR210HG核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面，只要可以实现lncRNA MIR210HG进行定量即可。
本发明的所述的lncRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于lncRNA MIR210HG所示的部分或全部序列。“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
具体地，可根据本发明所述的lncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
本发明中针对lncRNA MIR210HG基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。
所述的lncRNA MIR210HG芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的lncRNA芯片。
本发明提供的试剂盒，所述试剂盒可用于检测lncRNA MIR210HG的表达。所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
如前所述，目前针对与子痫前期相关的lncRNAs仍然较少，因此，发现更多与子痫前期相关的lncRNAs，并对他们在疾病中所起的生物学功能进行研究，并深入探索其分子机制，则有助于对该疾病的早期诊断及治疗。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供lncRNA MIR210HG作为分子标志物在制备检测、诊断或预测子痫前期进展的产品中的应用。
经试验证明，所述lncRNA MIR210HG在PE孕妇胎盘组织上调表达。因此，可将其作为子痫前期的诊断标志物。
本发明的又一具体实施方式中，提供检测上述子痫前期分子标志物的物质在制备检测、诊断或预测子痫前期的进展的产品中的应用。
所述产品可以为试剂盒。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测、诊断或预测子痫前期的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测子痫前期样品中lncRNA MIR210HG的物质；或基于免疫检测方法检测子痫前期样品中lncRNA MIR210HG调控的靶基因的表达情况的物质。
本发明的又一具体实施方式中，所述组合物包括采用液相杂交、Northern杂交、lncRNA芯片、原位杂交检测子痫前期样品中lncRNA MIR210HG的物质；采用酶联免疫吸附测定、胶体金检测、蛋白质芯片检测子痫前期样品中lncRNA MIR210HG调控的靶基因的表达情况的物质。
本发明的又一具体实施方式中，所述组合物包括特异性识别lncRNA MIR210HG的探针；或，特异性扩增lncRNA MIR210HG的引物。
本发明的又一具体实施方式中，特异性扩增lncRNA MIR210HG的引物序列如SEQID NO.1～2所示。
本发明的又一具体实施方式中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述用于检测、诊断或预测子痫前期的进展的组合物。
本发明的又一具体实施方式中，提供抑制lncRNA MIR210HG表达和/或活性降低的物质在制备子痫前期预防或治疗药物中的应用。
经研究发现，在PE孕妇胎盘滋养细胞HT8/SVneo敲低MIR210HG的表达，则HT8/SVneo细胞增殖和迁移增加，有利于子痫前期的预防和治疗。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于预防或治疗子痫前期的药物组合物，其包含抑制lncRNA MIR210HG表达和/或活性降低的物质；
本发明的又一具体实施方式中，所述抑制lncRNA MIR210HG表达和/或活性降低的物质包括有效量的lncRNA MIR210HG的抑制剂。所述抑制剂选自：以lncRNA MIR210HG或其转录本为靶序列、且能够抑制lncRNA MIR210HG表达或转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
本发明的又一具体实施方式中，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.4～5所示。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物剂型为可注射埋植剂、乳剂、脂质体、微囊剂、微球剂、纳米粒等。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种筛选治疗子痫前期的候选药物的方法，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有lncRNA MIR210HG的体系；和检测所述体系中lncRNA MIR210HG的表达；
其中，若所述待筛选的药物可以抑制lncRNA MIR210HG的表达水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选药物是治疗子痫前期的候选药物。
所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
所述候选药物包括但不限于：针对lncRNA MIR210HG或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。
需要说明的是，本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对lncRNAMIR210HG的任何特定变体的基因表达进行定量。在一些实施方案中，其具有与lncRNAMIR210HG序列至少85％相同或相似的cDNA序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。
实施例1
试验过程：
1、研究对象
从2006年01月至2019年06月，产前诊断实验室收集的病历资料共200例，分为PE(PE)组和正常对照组，收集其病例资料、胎盘组织样本。
2、标本的收集
剖宫产娩出胎盘后，立即在无菌状态下于胎盘母体面中央取两块胎盘各约1cm×1cm×1cm大小及蜕膜组织少许，标本放入无菌Eppendorf管，15min内置于液氮中保存，以待RNA提取。采用Real-time PCR检测各组胎盘组织中MIR210HG mRNA水平。
根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa Prime
Script试剂盒(TaKaRa,大连,中国)。逆转录试剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。
引物信息：
Homo sapiens MIR210 host gene(MIR210HG),long non-coding RNA
NCBI Reference Sequence:NR_038262.1
Figure BDA0002492517850000101
扩增片段：150bp
5'-CTGCTGTGGAACTGGATGTTTTCAGGGAGCCCAGCCTTTCCTCATGTCAACACAGTTCACAATATAGTTTTCAAAGTACAGTTTAAAACTCAAAAGTAAACTTTTCAGCAACTCAAAGGTTTGCTGAGTGATCTGAAGCACTCTGGCCAC-3'(SEQ ID NO.3)。
3、HTR8/SVneo细胞转染siMIR210HG或对照，进行细胞功能学实验检测。
HTR8/SVneo细胞用DMEM/F12培养基培养；培养基中均含有5％的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素。5％CO2的37℃恒温培养箱中常规培养。每2-3天更换新鲜培养基，当细胞融合度达到80％-90％时传代。
MIR210HG的干扰序列即：
MIR210HG-homo-161(sense 5'-CAGGUGUGGUCAUAUCUUCTT-3'，SEQ ID NO.4)；
MIR210HG-homo-2165(sense 5'-AGCUGAGUCCAUCCCAAACTT-3'，SEQ ID NO.5)；及乱序对照(si-NC)均购自上海吉玛公司。将细胞HTR-8/SVneo按每孔2×105个细胞种于6孔培养板，待细胞贴壁后，于转染前6h吸弃原有培养基，换成无双抗培养基；取10μL脂质体稀释于240μL的OPTI-MEM中，温和吹打混匀室温下孵育5min；取100pmol siRNA，si-NC分别稀释于250μL OPTI-MEM中，吹打混匀室温下孵育5min；将孵育好的脂质体Lipo3000与siRNA或质粒稀释液混合，温和吹打混匀。于室温下继续孵育20min；将上述混合物均匀滴入事先加好1.5mL OPTI-MEM的6孔培养板中，轻轻混匀。37℃，5％CO2培养箱中继续培养6h后，换完全培养基。转染48h后，收集细胞提取RNA进行实时定量RT-PCR。
1)细胞增殖实验：接种相应处理的HTR8/SVneo细胞悬液于96孔板中，100μl/孔，每孔细胞数量为5000个。待细胞贴壁后饥饿4-6hr，换成含10％FBS的培养基继续培养24hr。培养结束前2-4hr，向每孔加入10μl CCK-8溶液，注意不要生成气泡将培养板在培养箱内孵育2-4hr(可间歇在酶标仪上测定，选择最佳的时间点)。用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)。
2)细胞Transwell迁移侵袭实验：在组织培养皿中将小室(Chemicon，8μm)平衡到室温(侵袭实验预先铺matrigel基质胶)。消化HTR8/SVneo细胞，用无血清的培养基重悬至2×105/ml，在每个小室中加入200μl内皮细胞的细胞悬液，正常培养6、9、12hr后检测迁移的细胞数目。小心移去小室内的细胞悬液，用棉签轻轻蘸去小室内侧的贴壁细胞，在干净的培养孔中加入500μl染色液，将小室浸入染色液中，染色20min用去离子水小心洗去底部非特异性着色。显微镜下观察迁移的细胞数目。
4、数据处理
实验数据皆用Graphpad prism 5.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾Student’s T检验、秩和检验和卡方检验。单因素分析中P<0.05的随后再使用多因素分析。
研究结果：
1、MIR210HG在PE中表达增加，
分析RNA-seq的结果，共识别到近6000个已知或未知的LncRNA，其中显著差异基因26个，表达上调21个，下调5个(图1A&B)。通过相关性分析发现MIR210HG与ADAMTS7在PE胎盘中的表达呈显著正相关(r2＝0.88，P＝0.018)。进一步在30余例通过qPCR对胎盘样本中证实了MIR210HG表达的升高(图1C)。
2、随后选用正常滋养细胞(即HTR8/SVneo细胞株)作为实验研究对象，设计MIR210HG的干扰序列，以lipo3000为转染载体将已设计有效的干扰序列转入细胞后通过敲低滋养细胞中MIR210HG的表达来模拟PE疾病的发生，发展及预后等过程。有结果看见MIR210HG被有效敲低(图2)。
3、敲低MIR210HG促进HTR8/SVneo细胞增殖和迁移。
利用siRNA沉默HTR8/SVneo细胞中MIR210HG的表达，CCK8实验显示敲低MIR210HG促进细胞增殖(图3A)。Transwell实验也表明敲低MIR210HG促进HTR8/SVneo细胞迁移(图3B)。
综上所述，本发明首次发现在PE孕妇胎盘组织MIR210HG表达上调。在PE孕妇胎盘滋养细胞HT8/SVneo敲低MIR210HG的表达，表现出细胞增殖、迁移增加。本发明提出PE新致病机制，有望为诊断和治疗PE提供新靶点及理论依据。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛大学附属医院
<120> 长链非编码RNA MIR210HG在诊治子痫前期中的应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgctgtgga actggatgtt ttc 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtggccagag tgcttcagat c 21
<210> 3
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgctgtgga actggatgtt ttcagggagc ccagcctttc ctcatgtcaa cacagttcac 60
aatatagttt tcaaagtaca gtttaaaact caaaagtaaa cttttcagca actcaaaggt 120
ttgctgagtg atctgaagca ctctggccac 150
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagguguggu cauaucuuct t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agcugagucc aucccaaact t 21

Claims (10)

1.lncRNA MIR210HG作为分子标志物在制备检测、诊断或预测子痫前期进展的产品中的应用。
2.检测lncRNA MIR210HG的物质在制备检测、诊断或预测子痫前期的进展的产品中的应用。
3.一种用于检测、诊断或预测子痫前期的进展的组合物，其特征在于，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测子痫前期样品中lncRNAMIR210HG的物质；或基于免疫检测方法检测子痫前期样品中lncRNA MIR210HG调控的靶基因的表达情况的物质。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括采用液相杂交、Northern杂交、lncRNA芯片、原位杂交检测子痫前期样品中lncRNA MIR210HG的物质；采用酶联免疫吸附测定、胶体金检测、蛋白质芯片检测子痫前期样品中lncRNA MIR210HG调控的靶基因的表达情况的物质；
优选的，所述组合物包括特异性识别lncRNA MIR210HG的探针；或，特异性扩增lncRNAMIR210HG的引物；
进一步优选的，特异性扩增lncRNA MIR210HG的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3或4所述用于检测、诊断或预测子痫前期的进展的组合物。
6.抑制lncRNA MIR210HG表达和/或活性降低的物质在制备子痫前期预防或治疗药物中的应用。
7.一种用于预防或治疗子痫前期的药物组合物，其特征在于，其包含抑制lncRNAMIR210HG表达和/或活性降低的物质。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制lncRNA MIR210HG表达和/或活性降低的物质包括lncRNA MIR210HG的抑制剂；
优选的，所述抑制剂选自：以lncRNA MIR210HG或其转录本为靶序列、且能够抑制lncRNA MIR210HG表达或转录的干扰分子，包括：shRNA、siRNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；
进一步优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.4～5所示；
优选的，所述药物组合物还包含至少一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。
9.一种筛选治疗子痫前期的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有lncRNA MIR210HG的体系；和检测所述体系中lncRNAMIR210HG的表达。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系；
所述候选药物包括：针对lncRNA MIR210HG或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物或小分子化合物。
CN202010409041.1A 2020-05-14 2020-05-14 长链非编码rna mir210hg在诊治子痫前期中的应用 Pending CN111455042A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010409041.1A CN111455042A (zh) 2020-05-14 2020-05-14 长链非编码rna mir210hg在诊治子痫前期中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010409041.1A CN111455042A (zh) 2020-05-14 2020-05-14 长链非编码rna mir210hg在诊治子痫前期中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111455042A true CN111455042A (zh) 2020-07-28

Family

ID=71679412

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010409041.1A Pending CN111455042A (zh) 2020-05-14 2020-05-14 长链非编码rna mir210hg在诊治子痫前期中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111455042A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109750038A (zh) * 2018-12-29 2019-05-14 烟台毓璜顶医院 一种长非编码rna及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用
CN114214290A (zh) * 2021-12-27 2022-03-22 吉林大学 一种重组腺病毒ADV-lncRNA Gm44275及其构建方法和应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109750038A (zh) * 2018-12-29 2019-05-14 烟台毓璜顶医院 一种长非编码rna及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用
CN109750038B (zh) * 2018-12-29 2021-08-31 烟台毓璜顶医院 一种长非编码rna及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用
CN114214290A (zh) * 2021-12-27 2022-03-22 吉林大学 一种重组腺病毒ADV-lncRNA Gm44275及其构建方法和应用
CN114214290B (zh) * 2021-12-27 2023-12-01 吉林大学 一种重组腺病毒ADV-lncRNA Gm44275及其构建方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Browne et al. MicroRNA-378-mediated suppression of Runx1 alleviates the aggressive phenotype of triple-negative MDA-MB-231 human breast cancer cells
JP5690588B2 (ja) 肝細胞癌のサブタイプを決定し、肝癌幹細胞を検出するための方法
ES2653851T3 (es) Biomarcadores transcriptómicos para evaluación de riesgo individual en insuficiencia cardíaca de nueva aparición
JP2010510769A (ja) 食道癌の診断ならびに患者の生存の予後および改善のための方法および組成物
JP2009535642A (ja) 非アルコール性脂肪性肝炎（ｎａｓｈ）を診断及び予測する方法
CN111455042A (zh) 长链非编码rna mir210hg在诊治子痫前期中的应用
CN108949969B (zh) 长链非编码rna在结直肠癌中的应用
CN105483275B (zh) mir-1299及其成熟miRNA的新用途
CN108165631B (zh) 一种骨肉瘤的生物标志物syt12及其应用
CN111979315A (zh) 环状tp63作为肺鳞癌诊断或治疗靶点的应用
CN107496923B (zh) 一种与肾透明细胞癌相关的生物标志物
CN105734155B (zh) 软骨母细胞型骨肉瘤致病基因及其应用
KR102505618B1 (ko) 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
WO2018145371A1 (zh) Erh基因在制备膀胱癌诊治产品中的应用
CN113564172A (zh) 一种液体活检肿瘤细胞dna适配体
CN108728531B (zh) 生物标志物cbx8在子痫前期诊治中的应用
CN108085393B (zh) 肾透明细胞癌相关生物标志物及其应用
KR20210024918A (ko) 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
CN111471682A (zh) miR-23a作为诊断和治疗胃癌伪管生成标志物的应用
CN106924758B (zh) 一种用于多发性骨髓瘤的生物标志物
CN107184983B (zh) 一种肺腺癌的诊治靶标
US10316319B2 (en) Composition for diagnosis of liver metastasis of colorectal cancer and the use thereof
CN105597109B (zh) 原发骨肉瘤的诊治分子标记
CN110215518B (zh) PinX1及其靶分子在制备治疗肾癌的药物中的应用
CN110592218B (zh) 一种诊治乳腺癌的生物标志物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination