CN110215518B - PinX1及其靶分子在制备治疗肾癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PinX1和mir‑125a‑3p/VEGF在制备治疗肾癌的药物中的应用。本发明利用实验证明PinX1可作为mir‑125a‑3p/VEGF通路的上调调控因子调节mir‑125a‑3p/VEGF的表达进而抑制肾癌血管生成。同时促进PinX1和mir‑125a‑3p表达可抑制VEGF表达与分泌从而协同抑制肾癌血管生成。根据PinX1和mir‑125a‑3p在抗肾癌血管生成上的协同增效作用，可为临床治疗肾癌提供一种新的治疗方案。

Description

PinX1及其靶分子在制备治疗肾癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及PinX1及其靶分子在制备治疗肾癌的药物中的应用，具体涉及PinX1和mir-125a-3p/VEGF在制备治疗肾癌的药物中的应用。

背景技术

在全球范围内，肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常见的泌尿系统肿瘤类型。虽然由于预防，早期发现和治疗，RCC死亡率在过去二十年中有所下降，但它仍占约3％人类恶性肿瘤死亡率。因此，需要参与RCC进展的新的生物标志物以改进诊断实践并为RCC患者制定新的治疗策略。

PinX1首先在酵母双杂交筛选中鉴定为TRF1结合蛋白和内源性端粒酶抑制剂。此外，PinX1起到肿瘤的作用抑制因子，其表达在癌症组织中常常减少，这样的癌症包括乳腺癌，胃癌，卵巢癌，膀胱尿路上皮癌，淋巴瘤和肾癌。PinX1可以通过调节端粒抑制肿瘤生长，并可通过抑制MMP2和MMP9促进细胞迁移和侵袭，抑制MMP2和MMP9通过NF-κB依赖性转录来实现。但是，仍然需要进一步研究以阐明PinX1在癌症发展中发挥作用的分子机制。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类新发现的非编码单链小分子RNA，通常是由RNA聚合酶II转录。成熟的微小RNA保留在具有功能的复合体中，通过与靶mRNA的3’非翻译区结合(3untranslated region，3一UTR)结合，抑制mRNA的翻译或影响mRNA的稳定性而发挥作用。广泛参与机体的生长发育、细胞的代谢、增殖、分化、凋亡和肿瘤形成等生理和病理过程，已成为生命科学界研究的热点。新近研究发现，微小RNA在人类的多种疾病中，包括肿瘤的病理过程中发挥重要作用。微小RNA表达与多种癌症相关，微小RNA可以起“癌基因”或者“抑癌基因”的功能，大约50％已阐明的微RNA在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragile site)。这说明微小RNA在肿瘤发生、发展过程中起了至关重要的作用。

miRNA的表达具有时空特异性。在不同组织与不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达模式，这为肿瘤的基因诊断提供了一种新方法。

mir-125家族成员在不同的癌症中发挥作用，例如乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，肝癌和白血病。血管内皮生长因子(VEGF)在恶性肿瘤的发生、发展和转移中发挥重要作用，是治疗各种癌症的靶标。mir-125a/b可阻遏VEGF表达以抑制不同癌症(包括肝细胞癌、卵巢癌和胶质母细胞瘤)的肿瘤肿瘤生长和血管生成。

但是现有技术还未报道PinX1和mir-125在抑制肿瘤方面具有协同增效作用。

发明内容

为了填补现有技术空白，本发明提供了一种药物靶标，所述药物靶标包括PinX1，该药物靶标可用于开发治疗肾癌的药物。

进一步，所述药物靶标还包括mir-125-3p或其靶基因。

在本发明的具体实施方案中，所述靶基因是VEGF。

本发明还提供了一种药物，所述药物包括促进PinX1的试剂。

本发明所涉及的上述试剂包括促进PinX1本身或其上下游分子的表达或活性的试剂。

本发明所涉及的上述试剂种类不限，只要其能促进PinX1本身或其上下游分子的表达或活性即可，这样的试剂包括但不限于核酸、化合物、肽、肽模拟物、适体、抗体和天然物质，其特异结合PinX1基因或其上下游分子编码基因的表达调节区域。

在本发明的具体实施方案中，前面所述的试剂是PinX1过表达载体。

进一步，所述药物包括促进mir-125-3p的试剂。上述试剂种类不限，只要其能促进mir-125-3p表达或活性即可。这样的试剂包括mir-125mimic。

进一步，所述药物包括抑制VEGF的试剂。上述试剂种类不限，只要其能抑制VEGF表达或活性即可。这样的试剂包括化学物质、RNAi、反义寡核苷酸和天然提取物。

除了前面提到的所述试剂作为本发明的活性成分之外，本发明的药物可以使用药学适用的和生理学可接受的辅剂制备。辅剂可以包括赋形剂、崩解剂、甜味剂、粘合剂、包衣剂、膨胀剂(expander)、润滑剂、助流剂、香味剂、增溶剂等。为了给药，除活性成分之外，本发明的药物可以优选地使用至少一种药用载体配制。当药物配制为液体溶液时，其可以含有至少一种选自以下各项的药用载体：盐水溶液、无菌水、林格溶液、缓冲盐水、可注射白蛋白溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇和其混合物。如果需要，可以加入其他常规添加剂，包括抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。此外，可以进一步加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂以制备可注射制剂(如水溶液、悬浮液或乳状液等)、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。

本发明的药物可以以活性化合物的颗粒、粉末、包衣片剂、片剂、胶囊、栓剂、糖浆、果汁、混悬剂、乳剂、滴剂、可注射液体或缓释制剂的形式配制。本发明的药物可以根据常规方法通过静脉内、动脉内、腹内、肌肉内、胸骨内、经皮、鼻内、吸入、局部、直肠、口服、眼内或皮内途径施用。根据本发明的药物的活性成分有效量意为预防或治疗疾病所需的量。因此，有效量可以根据各种因素确定，包括疾病的类型、疾病的严重度、活性成分和组合物中含有的其他成分的类型和含量、制剂的类型、患者的年龄、重量、一般健康状况、性别和膳食、施用时间、施用途径、组合物的分泌率、治疗期和同时使用的药物。对于成人，组合物可以每天施用一次或数次。当每天施用一次或数次时，施用剂量可以是对于化合物0.1ng/kg-10g/kg，对于多肽、蛋白或抗体0.1ng/kg-10g/kg，和对于反义核苷酸、siRNA、shRNAi或miRNA0.01ng/kg-10g/kg，但本发明的范围不限于此。

本发明还提供了PinX1，和/或，mir-125-3p或其靶基因在制备治疗前面所述的药物中的应用。

进一步，所述靶基因包括VEGF。

本发明还提供了一种筛选治疗肾癌的药物的方法，所述方法包括检测药物处理前后PinX1，和/或，mir-125-3p或其靶基因的表达或活性；优选地，所述靶基因包括VEGF。

具体地，本发明提供了一种筛选治疗肾癌的药物的方法，包括步骤：

测试组中，在细胞的培养体系中添加测试药物，并观察所述测试组的肾癌细胞中PinX1，和/或，mir-125-3p或其靶基因的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试药物，并观察对照组的所述细胞中PinX1，和/或，mir-125-3p或其靶基因的表达和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的PinX1，和/或，mir-125-3p的表达和/或活性大于对照组，就表明该测试药物是对PinX1，和/或，mir-125-3p的表达和/或活性有促进作用的治疗肾癌的候选药物。

基因或蛋白的表达或活性水平可以通过选自由以下各项组成的组的任一项测量：反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，免疫组织化学，蛋白质印迹和流式细胞术(FACS)，但本发明的范围不限于此。

特别是，蛋白的表达水平可以通过抗原-抗体反应测量。更特别是，抗原-抗体反应可以根据本领域已知的定量或定性免疫测定方案进行。免疫测定形式可以包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、夹心测定、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、流式细胞术、荧光辅助的细胞分选(FACS)、酶底物显色测定和抗原-抗体聚集。

测定miRNA水平的方法包括Northern斑点杂交，原位杂交，RT-PCR和微阵列。这些方法在文献中有报道，例如Einat，Methods Mol.Biol.2006，342：139-157；Thompson etal.，Genes Dev.2006，20：2202-2207。

根据经典方法，细胞的总RNA可以通过在核酸提取缓冲液的环境中胞质匀浆化然后再离心获取。核酸被沉淀，DNA通过DNA酶作用再离心后去除。RNA通过标准化技术用凝胶电泳分离，再转移到硝酸纤维素膜，进行Northern斑点杂交等。RNA通过加热固定在膜上。通过与目标RNA互补的荧光标记的DNA或RNA探针来鉴定和定量。在成相膜上通过放射自显影方法也可以鉴定miRNA。扫描成相膜，可以对RNA转录子的水平精确定量。也可以用光成像计算机计算方法对杂交斑点进行RNA水平精确定量。

除了Northern和其他斑点杂交技术，RNA转录子水平还可以通过原位杂交来测定。这项技术是将整个细胞或组织固定在显微镜盖玻片上，利用含有放射线标记的探针或其他方式标记探针(例如cRNA探针)的溶液来测定细胞或组织的核酸。

miRNA水平也可通过对miRNA转录子逆转录，然后进行多聚酶链反应(RT-PCR)来检测。miRNA的水平可以通过和内参相比较来定量，内参可以是同一样本中看家基因的mRNA等。用作内参的适宜的看家基因包括肌球蛋白、3`磷酸甘油醛脱氢酶或人U6基因。在文献中有定量RT-PCR及其他相关技术的描述。在某些情况下，实时RT-PCR(qRT-PCR)检测miRNA比经典的组织活切或在癌症早期miRNA染色检测方法更加灵敏。qRT-PCR检测miRNA水平对于癌症的诊断、分类和预后评估来说是更灵敏和特异的方法。现有的发明，提供了用RT-PCR来检测个体(患有疾病，例如癌症的个体)miRNA水平的方法。在某些情况下，miRNA水平用qRT-PCR方法来检测。

在某些情况下，miRNA水平用此文描述的微阵列来检测。

上述方法中所述的核酸探针可用体外重组或化学合成的方法获得，这在文献中已有报道。另外，杂交探针可用不同的标记方法来标记，例如放射性同位素、荧光物质、报告系统酶、生物素和其他配体。这些可探测的标记物还可以偶联光学检测物质，进而可以用光化学方法来检测。标记和探测的探针在文献中也有报道。

用于检测miRNA的核酸探针可以在严格条件下和样本中的miRNA杂交。根据不同的方法，文献中的成熟技术可以改变条件，从而优化对特定样本中特定miRNA的检测。

总的来说，杂交物的稳定性依赖于离子浓度和温度。一般来说，杂交反应在低严谨性的条件下进行，然后在高严谨性的条件下洗涤。适度严谨性杂交是指允许核酸分子例如探针和互补核酸分子杂交的条件。杂交的核酸分子至少有60％的相似性，也包括70％，75％，80％，85％，90％，或95％的相似性。适度严谨性杂交条件等价于42℃在50％甲酰胺、5×Denhart`s溶液、5×SSPE、0.2％SDS条件下杂交，然后42℃用0.2×SSPE、0.2％SDS洗涤。高严谨性杂交条件可以是42℃在50％甲酰胺、5×Denhart`s溶液、5×SSPE、0.2％SDS条件下杂交，然后65℃用0.1×SSPE、0.1％SDS洗涤。

低严谨性杂交是指在与以下条件相当的杂交条件下杂交：10％甲酰胺、5×Denhart’s溶液、6×SSPE、0.2％SDS，22℃杂交，然后在37℃用1×SSPE、0.2％SDS清洗。Denhart’s溶液含有1％Ficoll、1％聚乙烯苯三酚和1％牛血清。20×SSPE(氯化钠、磷酸钠、EDTA)含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M EDTA。其他适当的中度严谨性和高严谨性杂交溶液和条件都为此领域内的人熟知，他们也报道过，例如：Sambrook et al，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd ed，ColdSping Harbor Press，Plainview，N.Y.(1989)；and Ausubel et al.，supra，1999)。

本发明的有益效果和优势：

本发明首次发现了PinX1可以通过调节miR-125a-3p/VEGF通路以抑制肾癌血管生成，由此可知PinX1、miR-125a-3p、VEGF均可作为治疗肾癌的药物靶标。

本发明发现PinX1和miR-125a-3p可以产生协同增效作用，同时促进两者表达，可显著抑制VEGF表达和分泌从而抑制肾癌血管生成，效果优于单独使用两者中的任一个。

本发明的研究成果为临床治疗肾癌提供了一种新的治疗策略。

附图说明

图1显示利用Real-time PCR检测PinX1对miR-125a-3p表达影响的结果图；

图2显示利用Western blot检测PinX1和miR-125a-3p对VEGF表达影响的结果图；

图3显示利用ELISA检测PinX1和miR-125a-3p对VEGF分泌的影响的结果图；

图4显示利用血管形成分析检测PinX1和miR-125a-3p对血管生成的影响的结果图。

具体实施方式

除非另有说明，应理解，本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方式而不意在构成限制。在本说明书和下面的权利要求书中，参考许多术语，这些术语具有以下定义：

如本文使用的，术语″肽模拟物″是指抑制PinX1蛋白的结合结构域诱导PinX1活性的肽或非肽。

如本文使用的，术语″适体″是指具有稳定的3维结构并且可以以高亲和力和特异性结合靶标的单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)。因为适体针对靶分子具有独特的高亲和力(一般是pM水平)和特异性，其与单克隆抗体相当，并且特别是，其用作替代性抗体的可能性高，以致适体常称为“化学抗体”。

用于本发明的″抗体″可以是通过PinX1注射产生的抗体或可商购的抗体。此外，抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和能够结合表位的片段。多克隆抗体可以如下产生。将PinX1注射入动物；从所述动物采集血液样品；并且随后从血液分离含有抗体的血清。该多克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的任意方法纯化，并且可以从任何动物宿主产生，包括山羊、兔、绵羊、猴、马、猪、牛、狗等。单克隆抗体可以使用任何通过连续培养细胞系提供抗体分子的生产的技术产生。该技术包括但不限于杂交瘤技术、人B-细胞系杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术。

关于本文中的筛选方法使用的术语“测试药物”意为用于筛选以检测其是否影响基因的表达水平或其是否影响蛋白的表达或活性的未知候选物质。

如本文所用，术语“反义”意图指具有核苷酸碱基序列和亚基-至-亚基骨架的寡聚体，其使反义寡聚体与RNA中的目标序列通过Watson-Crick碱基配对而杂交，以在目标序列内形成RNA：寡聚体异源双链体，通常是与mRNA。寡聚体可与目标序列具有精确的序列互补性或与其接近的互补性。这些反义寡聚体可阻断或抑制mRNA的翻译，和/或修饰mRNA加工以产生该mRNA的剪接变体。因此，本发明的反义寡核苷酸是与VEGF基因的mRNA互补的反义寡核苷酸。

如本文所用，术语“RNAi”是指RNA干扰(RNA interference，RNAi)，是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

RNAi试剂可以是小干扰RNA分子，通常是一条理论上可以形成小发夹(smallhairpin)结构的单链脱氧寡核苷酸(shRNA)，其长度一般不会超过100个核苷酸，典型的不会超过75个核苷酸；或者是一条15-30bp的双链脱氧寡核苷酸(siRNA)，最典型的是20-23bp。

在一些应用中，RNAi试剂也可以是编码shRNA或者siRNA的模板DNA。这些模板DNA可能存在于载体，比如质粒载体或病毒载体等载体中；也可以不存在与载体中，只是一段编码shRNA或者siRNA的模板DNA加一个控制其转录的常见启动子序列片段。

在本发明中，抑制VEGF的RNAi为针对VEGF的小干扰RNA；优选地，所述小干扰RNA含有至少一个修饰的核苷酸基团(修饰方式可以参照反义寡核苷酸部分)；更优选地所述修饰的核苷酸基团为二甲氧基修饰的核苷酸基团和/或短肽修饰的核苷酸基团。

本文所用的术语“治疗”指减少症状的严重性和/或频率、消除症状和/或根本原因、预防症状的发生和/或它们的根本原因、以及改善或消除损伤。例如，通过给予本发明的药物来治疗患者包含易发展癌症的患者(例如，由于基因倾向、环境因素等引起的高风险)和/或有癌症复发风险的癌症幸存者中的药物预防，以及通过抑制紊乱或疾病或使之消退以双重治疗癌症患者。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围内

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1研究PinX1对miR-125a-3p及其靶基因表达的调控作用

1、Western blot

按照以前描述的方法进行(参考文献：21)，anti-PinX1抗体(NBP2-32265；NovusBiologicals,LLC),anti-GAPDH抗体(sc-32233,Santa Cruz,Dallas,TX,USA),anti-VEGF抗体(19003-1-AP,Proteintech Group,Wuhan,China)在Western blot中使用。使用ECL试剂，利用Tanon 5200自动化学发光成像分析系统检测蛋白质条带(tanon，上海，中国)。

2、PinX1过表达或敲除的稳定转染细胞系构建

PinX1过表达(货号：D02001)或敲除(货号：D01001)的慢病毒购自上海吉玛公司，通过将上述慢病毒转染宿主细胞786-O和ACHN中并利用嘌呤霉素(2mg/mL)筛选两周即可获得PinX1过表达稳定转染细胞系(PinX1OE)或PinX1敲除稳定转染细胞系(PinX1KD)。

3、RNA提取、反转录PCR、qRT-PCR

使用TRIzol提取RNA，使用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(VazymeBiotech,Nanjing,China)合成cDNA。在ABI-7500上利用UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit(CWBIO,Beijing,China)进行qRT-PCR。

实验中使用的引物序列如下：

GAPDH

正向引物：5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3'(SEQ ID NO.1)；反向引物：5'-CCATGGGTGGAATCATATTGGAA-3'(SEQ ID NO.2)；

PinX1

正向引物：5'-AGTAAGAAGACTCCCGAGGGC-3'(SEQ ID NO.3)，反向引物：5'-TTACGTTCCACCTGCGTCTC-3'(SEQ ID NO.4)。

4、统计分析

统计分析使用统计软件20.0进行(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)和GraphPadPrism 7。不成对t检验是用于确定组间差异的统计显著性。数据表示为平均值±标准差。p<0.05被认为具有统计学意义。

5、结果

(1)Real-time PCR结果显示，PinX1敲除(PinX1KD)的细胞中，miR-125a-3p水平显著下降(图1)；Western blot结果显示，稳定转染细胞系786-O和ACHN中，miR-125a-3p过表达降低了PinX1敲除诱导的VEGF表达，抑制miR-125a-3p部分恢复了VEGF表达(图2A-B)。

(2)ELISA分析结果显示，PinX1敲除促进786-O and ACHN细胞中VEGF分泌，而通过mir-125a-3p mimic重新表达mir-125a-3p部分降低了PinX1敲除诱导的VEGF分泌(图3A-B)；抑制mir-125a-3p在稳定过表达PinX1的细胞系786-O和ACHN中增加了VEGF分泌(图3C-D)。在稳定过表达PinX1的细胞系786-O和ACHN中，通过mir-125a-3p mimic(上海吉玛，货号：B02001)重新表达mir-125a-3p进一步抑制了VEGF分泌(图3E-F)。

实施例2研究PinX1与miR-125a-3p对肿瘤血管生成的影响

1、血管形成实验

在稳定过表达PinX1(PinX1^OE)和稳定转染空载体(vector)的786-O细胞和ACHN细胞中，稳定敲除PinX1(PinX1^sh)和稳定转染空载体(vector)的786-O细胞和ACHN细胞中，转染mir-125a-3p mimics或作为对照的con-mimics，24小时后取细胞培养上清液，将上清液加入已接种于基质胶的HUVEC细胞中，培养2-4小时后，随后在显微镜下检测其形成的血管数量，并进行统计分析。

2结果

血管形成分析结果显示，过表达mir-125a-3p部分降低了干扰PinX1表达导致增加的HUVECs形成的血管数量(图4A)。

过表达mir-125a-3p进一步降低了PinX1过表达导致降低的HUVECs形成的血管数量(图4B)。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> PinX1及其靶分子在制备治疗肾癌的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaggtcggag tcaacggatt tg 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatgggtgg aatcatattg gaa 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtaagaaga ctcccgaggg c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttacgttcca cctgcgtctc 20

Claims (1)

1.一种筛选治疗肾癌的药物的方法，其特征在于，所述方法包括检测药物处理前后PinX1和mir-125a-3p的表达或活性；mir-125a-3p的靶基因为VEGF。

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