KR20230173037A - 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 연골 세포의 비대화 조절에 관여하는 신규한 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)에 관한 것으로, 연골세포 세포주 TC28a2의 비대 분화 동안 RUNX2가 번역 후 수준에서 조절되었고 많은 긴 비암호화 RNA(lncRNA) 중 두 개의 새로운 RUNX2 결합 lncRNA를 확인하여 본 발명에 이르렀다. 발굴된 특정 lncRNA의 발현 측정을 통해 골 관련 질환을 진단할 수 있으며, 더 나아가 발굴된 특정 lncRNA의 발현 억제를 통해 연골 세포의 비대 억제를 유도함으로써 관절 연골의 혈관화 또는 석회화를 효과적으로 억제할 수 있어 골 관련 질환의 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 관절 연골 세포의 비대 변화를 조절함으로써 골관절염을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물과 그의 용도에 관한 것이다.
골관절염(osteoarthritis; OA)은 뼈의 관절면을 감싸고 있는 관절 연골이 마모되어 연골 밑의 뼈가 노출되고, 관절 주변의 활액막에 염증이 생겨서 통증과 변형이 발생하는 질환으로, 흔히 퇴행성 관절염으로도 불리운다. 연골 세포의 기능 장애 및 활액 조직의 염증과 같은 조직 내에서 발생하는 여러 변화로 인해 관절 연골의 실질적인 손실이 나타나는 것이 특징이다.
관절 염증의 조절과 세포 치료를 이용한 손상된 관절 연골의 재생을 위한 유전자 치료 분야에서의 연구는 눈에 띄게 발전했지만, 비대 연골세포는 관절 연골의 파괴와 국소 석회화와 관련이 있는 골관절염을 치료하기 위해 관절 연골 세포의 비대 변화를 조절하거나 예방할 수 있는 연구는 여전히 부족한 실정이다.
본 발명자들은 다양한 생물학적 과정의 중요한 조절자인 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA) 중에서도 RNA 시퀀싱을 통해 정상 연골 세포의 비대 변화에 중요한 역할을 하는 두 가지 중요한 lncRNA를 발굴하였으며, RUNX2 단백질의 안정화에 필요할 뿐만 아니라 중간엽 줄기 세포(MSC)의 연골 분화 동안 비대 변화에도 관여하는 것을 확인하여 본 발명에 이르렀다.
본 발명의 일 목적은 골 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 골 관련 질환의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 골 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 골 관련 질환을 진단하는 기기를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 연골 세포의 비대(Chondrocyte hypertrophy)를 억제하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 골 관련 질환을 예방 또는 치료하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 골 관련 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세 사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서 내에 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 골 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 진단용 조성물은 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 긴 비암호화 RNA(lncRNA)는 일반적으로 단백질로 번역되지 않는 200개 이상의 뉴클레오티드 이상의 전사체로 정의되는 RNA 유형 중의 하나로, 구조적 특징과 세포내 위치에 따라 특징지어진다. RNA 시퀀싱을 통해서 수많은 전사체(Transcriptome)들이 발굴되고 있으나, 긴 비암호화 RNA의 역할과 기능에 대해서는 알려진 바가 적은 실정이다.
본 발명에서 상기 긴 비암호화 RNA(lncRNA)는 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있고, 구체적으로는 LINC02035 또는 LOC100130207를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 LINC02035(Long Intergenic Non-Protein Coding RNA 2035)는 lncRNA 클래스에 속하는 RNA 유전자에 해당하며, 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 LOC100130207는 lncRNA 클래스에 속하는 RNA 유전자에 해당하며, 서열번호 2로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 LINC02593(Long Intergenic Non-Protein Coding RNA 2593)은 lncRNA 클래스에 속하는 RNA 유전자에 해당하며, 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 LOC100287808은 ncRNA 클래스에 속하는 RNA 유전자에 해당하며, 서열번호 4로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 LMNTD2-AS1(LMNTD2 Antisense RNA 1)는 lncRNA 클래스에 속하는 RNA 유전자에 해당하며, 서열번호 5로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 HCG4B(HLA Complex Group 4B)는 lncRNA 클래스에 속하는 RNA 유전자에 해당하며, 서열번호 6으로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 LOC100287175는 lncRNA 클래스에 속하는 RNA 유전자에 해당하며, 서열번호 7로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 lncRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 lncRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA (Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA 올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 lncRNA의 정보는 공지되어 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 lncRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 진단용 조성물은, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 lncRNA의 발현 수준을 대조군과 비교하여 그 발현 수준의 증감 여부를 확인함으로써, 골 관련 질환을 진단할 수 있다.
본 발명에서 상기 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 보다 상세하게는 골 관련 질환, 특히는 골관절염을 판정하는 것으로서, 특히는 연골 세포의 비대 조절 이상으로 발생하는 질환을 판정하는 것을 말한다.
본 발명에서 상기 골 관련 질환은 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골화석증(osteopetrosis), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 거대세포종 (giant cell tumor), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer) 관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis) 및 연골석회화증(chondrocalcinosis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상일 수 있으나, 연골 세포의 비대 조절 이상으로 인한 질환에 해당한다면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 관절염은 뼈와 뼈 사이가 부드럽게 운동할 수 있도록 연골, 관절낭, 활막, 인대, 힘줄, 근육 등으로 구성되어 있는 관절에 염증이 생긴 것으로, 크게는 골관절염(퇴행성 관절염)과 류마티스 관절염으로 분류된다. 골관절염 (퇴행성 관절염)은 관절 연골이 닳아 없어지면서 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환으로 반복적인 작업이나 운동 등 연골을 오랜 세월동안 무리하게 사용하는 것, 비만으로 관절에 무리를 많이 주는 것, 관절 외상 등이 원인일 수 있다. 류마티스 관절염은 관절 활막의 지속적인 염증 반응을 특징으로 하는 만성 염증성 전신 질환으로 원인이 정확히 알려지지 않았으나 유전적 소인을 가지고 있는 사람이 흡연 등의 환경적 요인이나 치주염과 같은 감염원에 노출되어 자가항체를 만들어내고 염증반응을 유발하는 면역 반응이라는 가설이 있다.
본 발명에서 상기 연골 세포의 비대(Chondrocyte hypertrophy)는 골관절염의 특징 중 하나이며, 비대와 같은 변화를 겪는 연골 세포는 조직 리모델링 및 석회화에 관여하는 것으로 알려져 있다. 관절 연골은 크게 석회화 영역과 비석회화 영역의 두 층으로 나뉘는데, 연골의 석회화되지 않은 영역은 조직 항상성의 동적 특성을 결정할 수 있는 표면 영역을 포함한다. 일반적으로 석회화되지 않은 영역에 존재하는 연골 세포는 COL2A1 및 ACGN과 같은 연골 기질 단백질을 방출하는 반면, 석회화 영역에 존재하는 연골 세포는 RUNX2 및 COL10A14의 발현에서 구별되는 비대 형태를 나타낸다. 그러나, 석회화되지 않은 영역의 연골 세포는 골관절염 환경에서 RUNX2, COL10A1 및 MMP13과 같은 비대 마커에 대해 양성일 수 있으며, 이는 석회화되지 않은 영역에 존재하는 연골 세포의 비대 변화가 골관절염 진행에 크게 관련되어 있음을 시사하므로 관절 연골의 표면 영역 내 연골 세포의 비대 분화는 골관절염 발생의 주요 표현형 변화 중 하나일 수 있다. 또한, 전사 인자, 사이토카인 및 기질 단백질과 같은 여러 요인이 연골 세포 비대에 관여한다. 특히 RUNX2는 연골세포 비대 및 뼈 대사의 주요 조절자이며, RUNX2 과발현은 비대성 연골세포의 비대 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 목적상 상기 골 관련 질환의 진단용 조성물은 기존에 보고된 것과는 달리 RUNX2와 연관된 새로운 표적으로 연골 세포의 비대 조절과 관련한 골 관련 질환, 특히는 골관절염의 진단에 더욱 효과적이다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 조성물을 포함하는 골 관련 질환의 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 상기 키트는 본 발명의 상기 조성물을 사용하여 목적하는 개체에서 대조군에 비하여 lncRNA가 높은 수준으로 존재하는 경우 골 관련 질환, 특히는 골관절염이 있는 것으로 예측할 수 있다. 구체적으로는, LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 발현 수준이 대조군에 비하여 높은 수준으로 존재하는 경우에 연골 세포의 비대 조절에 이상이 있어 골 관련 질환, 특히는 골관절염이 있는 것으로 예측할 수 있다. 보다 구체적으로는, LINC02035 또는 LOC100130207 중 적어도 하나의 발현 수준이 대조군에 비하여 높은 수준으로 존재하는 경우에 연골 세포의 비대 조절에 이상이 있어 골 관련 질환, 특히는 골관절염이 있는 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서 상기 "대조군"은 정상 대조군일 수 있으며, 보다 구체적으로 골 관련 질환이 없는 것으로 확인된 환자의 혈청 샘플로부터 수득된 것일 수 있고, 골 밀도 검사, 초음파 및 CT를 실시하고 골 관련 질환이 없는 것으로 최종적으로 확인된 환자의 lncRNA의 발현 수준의 평균 내지 중간 값일 수 있다. 대조군에서의 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현량과 분석 대상이 되는 골 관련 질환 발병 환자 유래의 생물학적 시료에서의 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현량을 비교할 수 있으며, 상기 발현량의 유의한 변화 여부를 판단하여 골 관련 질환을 진단할 수 있다.
본 발명에서 "높은 수준"이란 정상 대조군에 비하여 측정 가능할 정도로 유의하게 고발현되는 것을 의미하며, 구체적으로는 예를 들어 정상 대조군에 비하여 20% 이상 발현되는 경우를 의미하고, 보다 구체적으로는 30%, 보다 더 구체적으로는 40%, 가장 구체적으로는 50% 이상 발현되는 경우를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 진단용 키트에서, lncRNA, 골 관련 질환 등에 관한 기재는 진단용 조성물에서 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산 서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로써, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수 (DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 골 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있고, 구체적으로는 LINC02035 또는 LOC100130207를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 골 관련 질환, 특히는 골관절염의 유무를 선별하기 위한 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란 인간을 포함하는 포유 동물로, 예를 들면, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 구체적으로는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "인간"은 골 관련 질환이 발생하였거나 그 발생이 의심되는 자로, 연골세포 비대 조절 이상에 따라 골 관련 질환, 특히는 골관절염의 적절한 치료가 필요하거나 예상되는 환자를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "생물학적 시료"는 골 관련 질환이 발생한 환자이거나 골 관련 질환의 발생이 의심되어 연골 세포 비대 조절 이상이 의심되는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈 (whole blood), 백혈구 (leukocytes), 말초혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층 (buffy coat), 혈장 (plasma) 및 혈청 (serum)을 포함하는 혈액, 객담 (sputum), 눈물 (tears), 점액 (mucus), 세비액 (nasal washes), 비강 흡인물 (nasal aspirate), 호흡 (breath), 소변 (urine), 정액 (semen), 침 (saliva), 복강 세척액 (peritoneal washings), 골반 내 유체액 (pelvic fluids), 낭종액 (cystic fluid), 뇌척수막 액 (meningeal fluid), 양수 (amniotic fluid), 선액 (glandular fluid), 췌장액 (pancreatic fluid), 림프액 (lymph fluid), 흉수 (pleural fluid), 유두 흡인물 (nipple aspirate), 기관지 흡인물 (bronchial aspirate), 활액 (synovial fluid), 관절 흡인물 (joint aspirate), 기관 분비물 (organ secretions), 세포 (cell), 세포 추출물 (cell extract) 또는 뇌척수액 (cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 lncRNA의 발현 수준을 측정하는 단계는 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay; RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에서, lncRNA, 발현 수준을 측정하는 제제, 골 관련 질환, 연골 세포의 비대 등에 대한 기재는 진단용 조성물에서 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 상기 방법은 상기 생물학적 시료에서 측정된 lncRNA의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높을 경우 상기 목적하는 개체에게 골 관련 질환이 있는 것으로 예측할 수 있다. 구체적으로는, LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 발현 수준이 정상 대조군보다 높은 경우에 연골 세포의 비대 조절 이상으로 인한 골 관련 질환, 특히는 골관절염이 있는 것으로 예측할 수 있다. 보다 구체적으로는, LINC02035 또는 LOC100130207 중 적어도 하나의 발현 수준이 대조군에 비하여 높은 수준으로 존재하는 경우에 연골 세포의 비대 조절에 이상이 있어 골 관련 질환, 특히는 골관절염이 있는 것으로 예측할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 골 관련 진단을 위한 진단기기에 관한 것이다.
본 발명의 상기 진단기기의 측정부는 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 대하여 lncRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 lncRNA의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 목적하는 개체는, 인간, 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 구체적으로 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료는 전혈 (whole blood), 백혈구 (leukocytes), 말초혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층 (buffy coat), 혈장 (plasma), 혈청 (serum), 객담 (sputum), 눈물 (tears), 점액 (mucus), 세비액 (nasal washes), 비강 흡인물 (nasal aspirate), 호흡 (breath), 소변 (urine), 정액 (semen), 침 (saliva), 복강 세척액 (peritoneal washings), 복수 (ascites), 낭종액 (cystic fluid), 뇌척수막 액 (meningeal fluid), 양수 (amniotic fluid), 선액 (glandular fluid), 췌장액 (pancreatic fluid), 림프액 (lymph fluid), 흉수 (pleural fluid), 유두 흡인물 (nipple aspirate), 기관지 흡인물 (bronchial aspirate), 활액 (synovial fluid), 관절 흡인물 (joint aspirate), 기관 분비물 (organ secretions), 세포 (cell), 세포 추출물 (cell extract) 및 조직 등으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 진단기기의 측정부에서 이용하는 제제는 lncRNA의 발현 수준을 측정하는 제제일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 진단기기의 측정부에서 상기 제제를 이용하여 상기 유전자의 발현 정도를 확인함으로써 골 관련 질환, 보다 구체적으로는 연골 세포에서 비대 조절에 이상이 생겨 발생한 골 관련 질환, 특히는 골관절염 유무를 예측할 수 있다.
본 발명의 골 관련 질환의 진단기기는, 상기 측정부에서 얻어진 상기 유전자의 발현 정도로부터 상기 목적하는 개체의 골 관련 질환, 특히는 골관절염 유무를 예측하여 출력하는 검출부를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 검출부는, 상기 측정부에서 얻어진 상기 유전자의 발현 정도가 대조군에서 측정된 lncRNA의 발현 수준보다 높은 경우 연골 세포의 비대 조절 이상으로 인한 골 관련 질환이 발병하였거나 발병할 가능성이 높은 것으로 정보를 생성하여 분류함으로써 골 관련 질환, 특히는 골관절염을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 검출부는, 상기 측정부에서 얻어진 상기 유전자의 발현 정도가 대조군에서 측정된 lncRNA의 발현 수준보다 높은 경우 연골 세포의 비대로 인한 골 관련 질환, 특히는 골관절염이 발병하였거나 발병할 가능성이 높은 것으로 정보를 생성하여 분류함으로써 골 관련 질환을 진단할 수 있다.
본 발명의 진단기기에서 진단의 대상이 되는 골 관련 질환은 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골화석증(osteopetrosis), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 거대세포종 (giant cell tumor), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer) 관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis) 및 연골석회화증(chondrocalcinosis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상일 수 있으나, 연골 세포의 비대 조절 이상으로 인한 질환에 해당한다면 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 연골 세포의 비대를 억제하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 조성물은 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)의 발현 수준을 감소시키는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 lncRNA는 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있고, 구체적으로는 LINC02035 또는 LOC100130207 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 lncRNA의 발현을 감소시키는 제제는 lncRNA 유전자, 구체적으로는 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA (short interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA) 및 리보자임 (ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 표적 단백질 또는 유전자인 lncRNA에 직간접적으로 작용하여 그의 활성 또는 발현이 저해되는 효과를 도출하는 수단에 해당하는 것으로 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 공지된 기술에 의하여 용이하게 도출 가능한 것이라면 이에 제한되지 아니하고 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스 뉴클레오티드"는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다. 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포주흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
본 발명에서 상기 "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 (knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고 뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀 (hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서 (dicer)에 의해 절단되면서 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고 뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 lncRNA에 특이적으로 작용하여 lncRNA의 유전자(예; mRNA 분자)를 절단하여 RNA 간섭 (RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 lncRNA의 발현을 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 (in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내 (in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR (polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트 (cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "리보자임 (ribozyme)"은 촉매 활성을 갖는 RNA 분자를 말한다. 다양한 활성을 갖는 리보자임이 공지되어 있으며, lncRNA 유전자의 리보자임은 공지된 또는 인공적으로 생성된 리보자임을 포함하며, 선택적으로 표적 특이적 RNA 절단 활성을 갖는 리보자임이 공지의 표준 기법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 연골 세포의 비대 또는 석회화를 억제함으로써 연골 세포의 비대 조절 이상이 예견되는 골 관련 질환의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.
본 발명의 상기 연골 세포 비대 억제용 조성물에서 lncRNA, 골 관련 질환 등에 대한 기재는 진단용 조성물에서 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 연골 세포의 비대 또는 석회화를 억제하는 골 관련 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)의 발현 수준을 감소시키는 제제를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 lncRNA는 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있고, 구체적으로는 LINC02035 또는 LOC100130207 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 상기 lncRNA의 발현 수준을 감소시킴으로써 연골 세포의 비대 또는 석회화를 억제시켜 골 관련 질환, 특히는 골관절염을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 연골 세포의 비대 또는 석회화를 억제하여 골 관련 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 기능이 있으며, 상기 골 관련 질환은 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골화석증(osteopetrosis), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 거대세포종 (giant cell tumor), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer) 관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis) 및 연골석회화증(chondrocalcinosis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상일 수 있고, 구체적으로 골관절염일 수 있으나, 연골 세포의 비대 조절 이상으로 인한 질환에 해당한다면 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 약학 조성물은 연골 세포의 비대를 억제함으로써 궁극적으로 연골 세포의 비대 조절 이상으로 석회화 등이 예견되는 골 관련 질환, 특히는 골관절염의 예방 또는 치료에 적용할 수 있다.
본 발명에서 상기 "예방"이란, 본 발명의 상기 조성물을 이용하여 골 관련 질환에 의해 기인된 증상을 차단하거나, 골 관절 질환으로의 진행을 억제 또는 지연시킬 수 있는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 "치료"란, 목적하는 질병의 완화 또는/및 개선을 위해 수행되는 일련의 활동을 의미한다. 본 발명의 목적상 치료는 골 관련 질환, 특히는 골관절염을 억제 또는 지연시키는 활동을 포함하며, 골 관련 질환, 특히는 골관절염으로 인해 발생한 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 골 관련 질환 치료용 약학 조성물에서 lncRNA, 골 관련 질환, 골관절염 등에 대한 기재는 진단용 조성물 및 연골 세포 비대 억제용 조성물에서 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 혼합되어 사용될 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서 (Elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하, 관절강 또는 직장이 포함된다. 비경구 투여, 구체적으로는 관절강 투여가 바람직하다.
본 발명의 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 상기 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1 일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 골 관련 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 스크리닝하는 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 후보물질의 처리하는 단계; 및 상기 생물학적 시료에서 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA) 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 스크리닝하는 방법에서, lncRNA, 골 관련 질환 등에 대한 기재는 진단용 조성물에서 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 상기 후보물질은 골 관련 질환, 특히는 골관절염을 극복하기 위한 억제 활성, 즉 lncRNA의 발현 수준을 골 관련 질환, 특히는 골관절염이 존재하지 않는 정상인에서의 발현 수준과 동등, 또는 유사한 정도의 수준으로 감소시킬 수 있는 활성이 존재하는지 여부에 대해 테스트하기 위한 약제를 의미하며, 단백질, 올리고 펩타이드, 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의의 분자를 포함한다. 이러한 후보물질은 천연물질뿐만 아니라, 합성 물질도 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 스크리닝하는 방법은 상기 후보물질의 처리 후에 측정된 lncRNA의 발현 수준이, 상기 후보물질의 처리 전에 측정된 lncRNA의 발현 수준에 비하여 감소된 경우, 상기 후보물질을 골 관련 질환 치료제로 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 연골 세포의 비대화 조절에 관여하는 신규한 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)에 관한 것으로, 발굴된 특정 lncRNA의 발현 정도를 측정함으로써 골 관련 질환을 진단할 수 있고, 더 나아가 발굴된 특정 lncRNA의 발현 억제를 통해 연골 세포의 비대 억제를 유도함으로써 관절 연골의 혈관화 또는 석회화를 효과적으로 억제할 수 있어 골 관련 질환의 예방 또는 치료에 매우 효과적이다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따라 연골 세포 비대 및 골관절염 진행 과정에서의 RUNX2의 역할에 대해 나타낸 도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 골관절염 환자로부터 분리된 연골의 사프라닌 O(SFO) 염색 및 면역 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 염증성 사이토카인(10ng/ml IL-1β, 50ng/ml IL-6, 또는 10ng/ml TNF-α)으로 처리되거나 처리되지 않은 TC28a2 세포에서의 IHH, RUNX2, COL10A1 및 PTGES mRNA 발현의 qRT-PCR 분석 결과와 COX2, IHH, RUNX2 및 COL10A1 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 비대 배지(hypertrophic medium)의 유무에 따라 TC28a2 세포에서 IHH, RUNX2, COL10A1 및 BGLAP mRNA 발현의 qRT-PCR 분석 결과와 COX2, IHH, RUNX2 및 COL10A1의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 비대 배지/TNF-α(10ng/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 siRNA로 형질감염된 TC28a2 세포에서 RUNX2, IHH, COL10A1, COL2A1 및 ACAN의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 OCN 프로모터의 활성과 OCN 프로모터 리포터 양을 보여주는 형광 이미지와 OCN 프로모터의 형광 기반 활성을 막대 그래프로 나타낸 도이다.
도 6a 내지 도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 시퀀싱 데이터의 계층적 클러스터링으로 성장 배지(growth medium; GM) 또는 비대 배지(hypertrophic medium; HM)로 성장된 TC28a2 세포에서 추출한 RNA를 사용하여 RNA 시퀀싱 데이터를 생성한 히트맵과 Kegg 경로 분석에 따른 관련된 세포 신호 전달 경로에 대한 다이어그램을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 비대 배지/TNF-α를 처리하거나 처리하지 않은 TC28a2 세포에서 AKT, p-AKT, FOXO3A 및 p-FOXO3A의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 GM 그룹과 HM 그룹 사이에 차등적으로 발현된 RNA의 볼케이노 플롯(Volcano plot)을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 TC28a2 세포의 비대 분화 동안 차등적으로 발현된 lncRNA의 히트맵을 나타낸 도이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 pcDNA-mock 또는 pcDNA-RUNX2-FLAG 플라스미드 벡터로 형질감염된 TC28a2 세포에서 FLAG 및 RUNX2의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 pcDNA-RUNX2 벡터로 형질감염된 TC28a2 세포에서 얻은 RNA-IP 샘플을 사용하여 RUNX2의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10c는 본 발명의 일 실시예에 따른 pcDNA-RUNX2 벡터로 형질감염된 TC28a2 세포에서 RNA-IP를 수행하고, IgG 대조군에 비교하여 lncRNA의 RNA-IP-qPCR 배수 차(fold enrichment)에 대한 결과를 막대그래프로 나타낸 도이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 lncRNA를 표적으로 하는 siRNA(100nM)로 형질감염된 TC28a2 세포에서 각 lncRNA 발현의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비대 배지/TNF-α(10ng/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 각 siRNA로 형질감염된 TC28a2 세포에서 RUNX2의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 11c는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 siRNA를 형질감염시켰을 때 TC28a2 세포에 비대 배지 또는 TNF-α 처리에도 불구하고 초기 및 후기 단계 모두에서 RUNX2 단백질의 양을 변화시키지 않은 그룹의 교차점을 다이어그램으로 나타낸 도이다.
도 11d는 본 발명의 일 실시예에 따른 RUNX2 활성에 대한 LINC02035 또는 LOC100130207의 녹다운 효과를 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 비대 배지/TNF-α(10ng/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 siRNA-형질감염 TC28a2 세포에서 IHH, COL10A1 및 MMP13의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12b 및 도 12c는 본 발명의 일 실시예에 따라 OCN 프로모터의 활성 및 OCN 프로모터 리포터 양을 보여주는 형광 이미지와 OCN 프로모터의 형광 기반 활성을 막대그래프로 나타낸 도이다.
도 12d는 본 발명의 일 실시예에 따라 비대 배지/TNF-α(10ng/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 siRNA-형질감염 TC28a2 세포에서 COL2A1 및 ACAN의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 OA 환자로부터 얻은 손상되지 않았거나 손상된 연골 조직에서 분리된 1차 연골세포에서 수행된 RNA 제자리 혼성화(in situ hybridization) 결과를 관찰한 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 비대 배지 또는 TNF-α(10ng/ml)로 처리된 TC28a2 세포의 세포질 및 핵에서 lncRNA LINC02035 및 LOC100130207의 분포를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG132를 처리하거나 처리하지 않은 TC28a2 세포에서 RUNX2의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 16a 및 도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비대 배지 또는 TNF-α 처리가 TC28a2 세포에서 RUNX2 단백질의 유비퀴틴화에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 IP/웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 17a 및 도 17b는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 골수 유래 MSC의 연골 분화 동안 SOX9, COL2A1, RUNX2 및 COL10A1 mRNA의 qRT-PCR 분석 결과와 SOX9, COL2A1, RUNX2 및 COL10A1의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 17c는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 골수 유래 MSC의 연골 분화 동안 LINC02035 및 LOC100130207 lncRNA의 qRT-PCR 분석결과를 나타낸 도이다.
도 18a는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 표적화 siRNA로 형질감염된 인간 골수 유래 MSC의 연골 분화 동안 LINC02035 및 LOC100130207, RUNX2 및 COL10A1 발현의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 18b는 본 발명의 일 실시예에 따른 사프라닌 O 및 알시안 블루에 의한 프로테오글리칸 염색 및 RUNX2에 대한 면역 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 18c는 본 발명의 일 실시예에 따른 LINC02035 또는 LOC100130207을 표적으로 하는 siRNA로 형질감염된 인간 골수 유래 MSC의 연골 분화 동안 SOX9, COL2A1, RUNX2 및 COL10A1의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 19a 및 19b는 본 발명의 일 실시예에 따른 in vivo 상에서의 조직학적 분석을 위하여 인간 골수 유래 중간엽줄기세포(hMSC)에 각 siRNA(대조군, LINC02035 및 LOC100130207)로 형질감염시켜 연골 분화를 유도한 뒤 누드 마우스에 이식하는 과정을 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스로부터 생성된 조직을 분리하여 사프라닌 O 및 H&E 염색 결과와 함께, RUNX2 및 IgG에 대한 면역 조직화학 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 골관절염 환자로부터 분리된 연골의 사프라닌 O(SFO) 염색 및 면역 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 염증성 사이토카인(10ng/ml IL-1β, 50ng/ml IL-6, 또는 10ng/ml TNF-α)으로 처리되거나 처리되지 않은 TC28a2 세포에서의 IHH, RUNX2, COL10A1 및 PTGES mRNA 발현의 qRT-PCR 분석 결과와 COX2, IHH, RUNX2 및 COL10A1 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 비대 배지(hypertrophic medium)의 유무에 따라 TC28a2 세포에서 IHH, RUNX2, COL10A1 및 BGLAP mRNA 발현의 qRT-PCR 분석 결과와 COX2, IHH, RUNX2 및 COL10A1의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 비대 배지/TNF-α(10ng/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 siRNA로 형질감염된 TC28a2 세포에서 RUNX2, IHH, COL10A1, COL2A1 및 ACAN의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 OCN 프로모터의 활성과 OCN 프로모터 리포터 양을 보여주는 형광 이미지와 OCN 프로모터의 형광 기반 활성을 막대 그래프로 나타낸 도이다.
도 6a 내지 도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 시퀀싱 데이터의 계층적 클러스터링으로 성장 배지(growth medium; GM) 또는 비대 배지(hypertrophic medium; HM)로 성장된 TC28a2 세포에서 추출한 RNA를 사용하여 RNA 시퀀싱 데이터를 생성한 히트맵과 Kegg 경로 분석에 따른 관련된 세포 신호 전달 경로에 대한 다이어그램을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 비대 배지/TNF-α를 처리하거나 처리하지 않은 TC28a2 세포에서 AKT, p-AKT, FOXO3A 및 p-FOXO3A의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 GM 그룹과 HM 그룹 사이에 차등적으로 발현된 RNA의 볼케이노 플롯(Volcano plot)을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 TC28a2 세포의 비대 분화 동안 차등적으로 발현된 lncRNA의 히트맵을 나타낸 도이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 pcDNA-mock 또는 pcDNA-RUNX2-FLAG 플라스미드 벡터로 형질감염된 TC28a2 세포에서 FLAG 및 RUNX2의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 pcDNA-RUNX2 벡터로 형질감염된 TC28a2 세포에서 얻은 RNA-IP 샘플을 사용하여 RUNX2의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10c는 본 발명의 일 실시예에 따른 pcDNA-RUNX2 벡터로 형질감염된 TC28a2 세포에서 RNA-IP를 수행하고, IgG 대조군에 비교하여 lncRNA의 RNA-IP-qPCR 배수 차(fold enrichment)에 대한 결과를 막대그래프로 나타낸 도이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 lncRNA를 표적으로 하는 siRNA(100nM)로 형질감염된 TC28a2 세포에서 각 lncRNA 발현의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비대 배지/TNF-α(10ng/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 각 siRNA로 형질감염된 TC28a2 세포에서 RUNX2의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 11c는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 siRNA를 형질감염시켰을 때 TC28a2 세포에 비대 배지 또는 TNF-α 처리에도 불구하고 초기 및 후기 단계 모두에서 RUNX2 단백질의 양을 변화시키지 않은 그룹의 교차점을 다이어그램으로 나타낸 도이다.
도 11d는 본 발명의 일 실시예에 따른 RUNX2 활성에 대한 LINC02035 또는 LOC100130207의 녹다운 효과를 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 비대 배지/TNF-α(10ng/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 siRNA-형질감염 TC28a2 세포에서 IHH, COL10A1 및 MMP13의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12b 및 도 12c는 본 발명의 일 실시예에 따라 OCN 프로모터의 활성 및 OCN 프로모터 리포터 양을 보여주는 형광 이미지와 OCN 프로모터의 형광 기반 활성을 막대그래프로 나타낸 도이다.
도 12d는 본 발명의 일 실시예에 따라 비대 배지/TNF-α(10ng/ml)를 처리하거나 처리하지 않은 siRNA-형질감염 TC28a2 세포에서 COL2A1 및 ACAN의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 OA 환자로부터 얻은 손상되지 않았거나 손상된 연골 조직에서 분리된 1차 연골세포에서 수행된 RNA 제자리 혼성화(in situ hybridization) 결과를 관찰한 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 비대 배지 또는 TNF-α(10ng/ml)로 처리된 TC28a2 세포의 세포질 및 핵에서 lncRNA LINC02035 및 LOC100130207의 분포를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 MG132를 처리하거나 처리하지 않은 TC28a2 세포에서 RUNX2의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 16a 및 도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 비대 배지 또는 TNF-α 처리가 TC28a2 세포에서 RUNX2 단백질의 유비퀴틴화에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 IP/웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 17a 및 도 17b는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 골수 유래 MSC의 연골 분화 동안 SOX9, COL2A1, RUNX2 및 COL10A1 mRNA의 qRT-PCR 분석 결과와 SOX9, COL2A1, RUNX2 및 COL10A1의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 17c는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 골수 유래 MSC의 연골 분화 동안 LINC02035 및 LOC100130207 lncRNA의 qRT-PCR 분석결과를 나타낸 도이다.
도 18a는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 표적화 siRNA로 형질감염된 인간 골수 유래 MSC의 연골 분화 동안 LINC02035 및 LOC100130207, RUNX2 및 COL10A1 발현의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 18b는 본 발명의 일 실시예에 따른 사프라닌 O 및 알시안 블루에 의한 프로테오글리칸 염색 및 RUNX2에 대한 면역 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 18c는 본 발명의 일 실시예에 따른 LINC02035 또는 LOC100130207을 표적으로 하는 siRNA로 형질감염된 인간 골수 유래 MSC의 연골 분화 동안 SOX9, COL2A1, RUNX2 및 COL10A1의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 19a 및 19b는 본 발명의 일 실시예에 따른 in vivo 상에서의 조직학적 분석을 위하여 인간 골수 유래 중간엽줄기세포(hMSC)에 각 siRNA(대조군, LINC02035 및 LOC100130207)로 형질감염시켜 연골 분화를 유도한 뒤 누드 마우스에 이식하는 과정을 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스로부터 생성된 조직을 분리하여 사프라닌 O 및 H&E 염색 결과와 함께, RUNX2 및 IgG에 대한 면역 조직화학 염색 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
인간 연골 조직, 일차 연골 세포, TC28a2 세포 및 MSC의 준비
본 발명의 발명자들은 연세대학교 의과대학 IRB(Institutional Review Board)(2019-1374-002)의 승인을 받아 슬관절 전치환술(total knee arthroplasty)을 받은 3명의 골관절염 환자로부터 연골 조직 샘플을 수득하였다. 원발성 연골 세포를 분리하기 위해 멸균 조건에서 관절 표면에서 연골 조직을 면도하고 가능한 한 많은 조각으로 다진 다음 인산완충식염수(PBS)로 3회 세척하였다. 그 후 슬라이스 조직을 2% 콜라게나아제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 0.5% dispase(Sigma-Aldrich)가 Dulbecco's Modified Eagle's high-glucose 배지 (DMEM-HG; Invitrogen)에서 37℃ 및 5% CO2 조건 하에 4 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포 현탁액을 40μm 세포 여과기에 통과시켜 불순물을 제거하고 10% 소태아혈청(FBS; Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 1% 항생제-항진균 용액을 함유하는 DMEM-HG 배지에서 세포를 37℃ 및 5% CO2 조건 하에 배양하였다. 정상 인간 연골형성 세포주(TC28a2)는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 상기에서와 동일한 조건에서 배양하였다. 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 연세대학교 의과대학 IRB(2017-0308-001)의 승인을 받아 성인 3명의 후장골능에서 수득하였다. 골수에서 분리된 MSC는 세포 배양 플레이트에 부착능을 기반으로 선별되었으며, 모든 배양된 세포(98%)가 CD90 및 CD105에 대해 양성이고 CD34 및 CD45에 대해 음성임을 확인하였다. MSC는 10% FBS 및 1% 항생제-항진균 용액을 함유하는 DMEM-low glucose(LG; Invitrogen) 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건 하에 배양되었다.
시약 및 분화 방법
IL-1β(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA),TNF-α(R&D Systems Inc.) 및 IL-6(Koma Biotech, Seoul, South Korea)를 사용하여 연골 세포에 염증 환경을 조성했습니다. IL-1β 및 TNF-α는 이전에 발표된 연구를 기반으로 10ng/ml의 농도로 사용하였고 IL-6은 이전 연구에 따라 50ng/ml의 농도로 사용하였다. MG-132(프로테아좀 억제제; Sigma-Aldrich)를 사용하여 RUNX2가 정상 연골세포에서 번역 후 수준에서 조절되는지 여부를 확인하고자 하였다. 연골 세포의 비대 분화를 유도하기 위해 다른 그룹에서 발표한 논문에 기술된 분화 배지 조성을 참조하였다(Yahara Y, Takemori H, Okada M et al. Pterosin B prevents chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis in mice by inhibiting Sik3. Nat Commun 2016; 7:10959.). 간단히 말해서, TC28a2 세포는 1% FBS, 1% 인슐린 트랜스페린 셀레늄-A(ITS, Invitrogen), 100ng/ml BMP-2(R&D Systems Inc.), 10ng/ml GDF-5(PeproTech, Rosemont, IL, USA), 1μM 3,3,5-Triodo-L 티로닌(T3)(Sigma-aldrich), 50μg/ml L(+)-아스코르브산(Sigma-Aldrich), 10nM 덱사메타손(Sigma-Aldrich), 10mM β-글리세로포스페이트(Sigma-Aldrich) 및 1% 항생제-항진균제 용액이 보충된 DMEM-HG에서 배양하였다. 비대 배지(hypertrophic medium)는 5일 동안 2일마다 교체해주었다. MSC의 시험관 내 연골 분화를 유도하기 위해 마이크로 매스 배양 방법이 사용되었다. MSC를 트립신 처리하고 1 x 107cells/ml의 밀도로 DMEM-HG에 재현탁시켰다. 세포는 10 μl 부피에서 웰당 1 x 105 세포로 24-웰 플레이트의 개별 웰 중앙에 점으로 표시되었다. 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 부착시킨 후, 1% 항생제 항진균 용액, 1% 인슐린 트랜스페린 셀레늄-A(ITS;Invitrogen), 50mg/ml 아스코르브산(Sigma-Aldrich), 40㎍/ml L-프롤린 (Sigma-Aldrich) 및 10ng/ml TGF-b3(R&D Systems Inc.)가 보충된 DMEM-HG로 구성된 연골 형성 배지를 사용하였다. 연골 형성 배지는 14일 동안 2일마다 교체해주었다. Safranin O 및 alcian blue 염색을 수행하여 MSC의 연골 형성 가능성과 프로테오글리칸 합성을 평가했다. 연골 형성 펠릿을 PBS로 세척하고 약 24시간 동안 10% 포르말린에 고정하였다. 고정 후 펠렛을 에탄올로 탈수하고 탈수된 펠렛을 파라핀 포매하여 절편하였다. 마이크로매스 섹션을 탈파라핀화하고 사프라닌 O(아세트산 용액 중 1%, Sigma-Aldrich) 또는 알시안 블루(70% 에탄올 중 0.3%, Sigma-Aldrich)로 30분 동안 염색한 뒤 스테인드 펠릿 섹션을 장착하고 현미경으로 측정하였다.
IHC
관절 연골 조직은 상온에서 10% 포르말린으로 고정하였고, 포르말린으로 고정된 시편은 파라핀에 포매하였다. 파라핀 포매 절편을 탈파라핀화하고, 재수화하고, PBS로 세척하고, 조직 절편을 사용하여 연골 조직의 파괴를 평가하고 인간 연골 조직에서 연골 세포 비대 관련 마커 단백질을 검출하였다. 준비된 조직 샘플을 4μm 두께로 슬라이스하고 anti-IHH(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-RUNX2(Santa Cruz Biotechnology) 또는 anti-COL10A1(Santa Cruz Biotechnology) 항체를 이용하여 IHH, RUNX2 또는 COL10A1 레벨을 각각 탐지하였다. 항-IHH, 항-RUNX2 또는 항-COL10A1 항체-탐침 조직에서 각 표적 단백질을 시각화하기 위해 샘플을 아미노에틸카르바졸(AEC; Abcam, Cambridge, UK)로 염색하였다. 염색된 조직은 VS120 가상현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였고 절편의 이미지는 OlyVIA 2.5 프로그램(Olympus)을 이용하여 분석하였다.
qPCR
qPCR은 기존의 공지된 방식으로 수행하였으며, 제조업체의 지침에 따라 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA(총 RNA 1μg)는 Omniscript 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 역전사되었다. 본 연구에 사용된 프라이머 세트는 Bioneer(대전, 대한민국)에서 검증 및 구입하였다. 이 때 사용된 프라이머 세트는 아래의 표 1과 같다. 3번(n = 3)의 유전자 발현 변화를 측정하여 평균 값으로 계산하였고, 내부 대조군인 ACTB(β-액틴)로 정규화하였다.
유전자 | 프라이머 시퀀스(5'→3') | 서열번호 |
IHH | Cat. No- P101104 V (RNA accession: NM_002181.3) https://www.bioneer.co.kr/sirna-customorder.html | - |
RUNX2 | Cat. No- P229954 V (RNA accession: NM_001015051.3)https://www.bioneer.co.kr/sirna-customorder.html | - |
COL10A1 | Cat. No- P261909 V (RNA accession: NM_000493.3)https://www.bioneer.co.kr/sirna-customorder.html | - |
PTGES | Cat. No- P327048 V (RNA accession: NM_004878.4) https://www.bioneer.co.kr/sirna-customorder.html | - |
BGLAP | Cat. No- P128146 V (RNA accession: NM_199173.5)https://www.bioneer.co.kr/sirna-customorder.html | - |
LINC02593 | CCGAGCTTCAGAGGAGAGG (sense, NR_026874.2) | 서열번호 8 |
CTCCCAGATCGTGAGCTTTC (antisense) | 서열번호 9 | |
IGFL2-AS1 | GGTGCCGAAGACCTGAGAC (sense, NR_135234.1) | 서열번호 10 |
GGCCACTTCTTCATTCTTGTTGG (antisense) | 서열번호 11 | |
HCG4B | GTCATTCACCGGCCTAGCTC (sense, NR_001317.3) | 서열번호 12 |
GAGTATTGGGACCGGAGCAC (antisense) | 서열번호 13 | |
LINC02035 | GAAGCAAGCCAGAAAGCCTG (sense, NR_024618.1) | 서열번호 14 |
GTGGTGCAGAGCCATGAAAG (antisense) | 서열번호 15 | |
LOC100287175 | GATCAGTCTCTCTGCGCCTC (sense, NR_149003.1) | 서열번호 16 |
GTGTCTCTTGGCCCTGTACC (antisense) | 서열번호 17 | |
LMNTD2-AS1 | CAGGCACTCACCTACCTGAC (sense, NR_147607.1) | 서열번호 18 |
CCTGGAGCAGAGGGAATACTTG (antisense) | 서열번호 19 | |
LOC100287808 | ACTGGGAACTCAAGGCACAG (sense, NR_149004.1) | 서열번호 20 |
AGATTCGGCTCAAAGGAGGC (antisense) | 서열번호 21 | |
LOC100130207 | GCACAACAGGACAAAGGAAGG (sense, NR_149025.1) | 서열번호 22 |
CAGATCGCCGTTTGCTTGG (antisense) | 서열번호 23 | |
H19 | AAGAAATGGTGCTACCCAGC (sense, NR_002196.2) | 서열번호 24 |
GTGCAGTGGTTGTAAAGTGC (antisense) | 서열번호 25 | |
OBSCN-AS1 | CTCCTCGATGCCGTACTTG (sense, NR_073154.1) | 서열번호 26 |
CCACGTTCCTATGTGAGGTG (antisense) | 서열번호 27 | |
FOXD2-AS1 | CCTCCTACCAATTACACGCC (sense, NR_026878.1) | 서열번호 28 |
GTACACACAGGTCGCTATGG (antisense) | 서열번호 29 | |
LOC101927811 | TTAAACGAGCCCTGGATCTG (sense, NR_110119.1) | 서열번호 30 |
CCCGAAACAGACTTCTGAAC (antisense) | 서열번호 31 | |
ARHGAP5-AS1 | ATCGCTCGCCAACTACAGAC (sense, NR_027263.1) | 서열번호 32 |
TGGCTTCTCGCTCCACTTTC (antisense) | 서열번호 33 | |
A2M-AS1 | GGGTAGCATAGTGCCCAAGG (sense, NR_137424.1) | 서열번호 34 |
TTTATTGGAGAGGGCCGCTG (antisense) | 서열번호 35 | |
LOC100129034 | TTGCTGATGACGCAGAGGTC (sense, NR_027406.1) | 서열번호 36 |
GGACATTATTGCCGCCGTTC (antisense) | 서열번호 37 | |
TSC22D1-AS1 | GAGAGCGAGCTTCGGAAAGG (sense, NR_038381.1) | 서열번호 38 |
TTCCTTTGAACGGCGTCGG (antisense) | 서열번호 39 | |
LOC90246 | CTCCCAACCTCACCTGTGC (sense, NR_026954.1) | 서열번호 40 |
TAGCAGGGCTTTGGATGTGC (antisense) | 서열번호 41 | |
SNAP25-AS1 | AGCACCCTAACGACAACAGTC (sense, NR_040710.1) | 서열번호 42 |
AGAACCCAGCTCCATTCATCC (antisense) | 서열번호 43 | |
LIFR-AS1 | TTACAGGTGTCTGTGCGGTG (sense, NR_103554.1) | 서열번호 44 |
TCCAGTCAATCCTTGGCATCC (antisense) | 서열번호 45 | |
MKLN1-AS | ATCTCAGGGTTTCCCACGTC (sense, NR_125364.1) | 서열번호 46 |
ACTGTCCAGGCTTTCAGGAG (antisense) | 서열번호 47 | |
LINC02015 | ACAGCCGGGAAGAAAATTGT (sense, NR_110826.1) | 서열번호 48 |
CCAGAAGTTCATGGCAGCAG (antisense) | 서열번호 49 | |
SOX9 | Cat. No- P232240 V (RNA accession: NM_000346.3) https://www.bioneer.co.kr/sirna-customorder.html |
- |
COL2A1 | Cat. No- P298511 V (RNA accession: NM_001844.4)https://www.bioneer.co.kr/sirna-customorder.html | - |
β-ACTIN | GTCCTCTCCCAAGTCCACACA (sense, NM_001101.3) | 서열번호 50 |
GGGCACGAAGGCTCATCATTC (antisense) | 서열번호 51 |
웨스턴 블롯 분석
TC28a2 세포 또는 MSC를 PROPREPTM 단백질 추출 용액(iNtRON Biotechnology, Seongnam, South Korea)에서 용해시켰다. 단백질 농도는 Bio Rad Protein Assay(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 결정되었다. 약 20-30 μg의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE; Sigma-Aldrich)으로 분석했다. 분리된 단백질을 멤브레인으로 옮기고 5% 탈지유(BD, Sparks, MD, USA)로 실온에서 1시간 동안 블로킹하고 막을 항체들[COX2(1:1000; BD Biosciences, San Jose, CA, USA), IHH(1:1000; Santa Cruz Biotechnology), RUNX2(1:1000; Santa Cruz Biotechnology), COL10A1(1: 1000; Abcam, Cambridge, UK), COL2A1(1:1000; Santa Cruz Biotechnology), ACAN(1:1000; Santa Cruz Biotechnology), MMP13(1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 유비퀴틴(1:1000; Santa Cruz Biotechnology), SOX9(1:1000; Santa Cruz Biotechnology), FLAG(1:1000; Sigma-Aldrich) 및 HSP90(1:5000; Santa Cruz Biotechnology)]과 함께 밤새 인큐베이팅하였다. 로딩 컨트롤 역할을 하는 β-액틴(1:5000; Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체도 동일하게 진행하였다.
인간 OCN pGreenZeo 분화 리포터 분석
OCN 프로모터/인핸서가 활성인 copGFP를 안정적으로 발현하는 TC28a2 세포를 확립하기 위해 humanOCN pGreenZeo 분화 리포터용 렌티바이러스 플라스미드 벡터를 구입하였다(System Biosciences, LLC; SBI SR1003PA-1). 인간 OCN pGreenZeo 분화 리포터로 렌티바이러스 입자를 얻기 위해 한 플레이트 당 5 x 106 세포의 밀도로 HEK293T 세포를 T75 플라스크에 접종하였다. 부착된 세포는 CalFectin 포유류 세포 형질감염 시약(SignaGen Laboratories, Frederick, MD, USA)을 사용하여 psPAX2(http://www.addgene.org/12260/) 및 pMD2.G(http://www.addgene.org/12259/)가 있는 인간 OCN pGreenZeo 분화 리포터용 렌티바이러스 플라스미드로 형질감염시켰다. 배지는 형질감염 약 6시간 후에 교체해주었다. 형질감염된 세포를 2일 동안 유지하고, 상청액을 수득하여 -70℃에서 보관하였다. OCN pGreenZeo 분화 리포터의 렌티바이러스로 형질도입된 TC28a2 세포에서 GFP 활성을 모니터링하기 위해 세포를 비대 분화 또는 염증 조건(hypertrophic differentiation or inflammatory condition)에서 1 x 105 세포 밀도로 6웰 플레이트에 접종하였다. 비대 분화 또는 염증 유도 5일 후 형광 현미경을 사용하여 copGFP 신호를 관찰하였다. 정량 분석을 위해 수동 용해 완충액(passive lysis buffer; Promega, Madison, WI, USA)을 세포로 처리하고 4℃에서 5분 동안 배양하였다. 전체 용해물을 미세원심분리 튜브로 옮기고 원심분리하여 상청액을 수득하였다. 각 용해물 샘플의 총 단백질 농도를 결정한 후, 형광 플레이트 판독기를 사용하여 360 nm/465 nm(excitation/emission)에서 형광을 측정하였다.
RNA 시퀀싱 및 데이터 분석
RNA 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위해 분화 5일째에 성장 배지(n = 2) 또는 비대 배지(n = 3)로 처리된 TC28a2 세포에서 총 RNA를 추출하였다. 이때, 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 TRIzol(Invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA의 전체 품질은 분광광도법을 사용하여 검증하였다. 저품질 및 어댑터 시퀀스를 제거하기 위해 분석 전에 시퀀서에서 raw read를 읽고 처리된 리드를 HISAT2 v2.1.0을 사용하여 Homosapiens로 정렬하였다. 이때, Homo sapiens(hg19)의 참조 게놈 서열과 주석 데이터는 NCBI에서 다운로드한 다음, 알려진 전사체의 전사체 어셈블리를 StringTie v2.1을 사용하여 처리하였다.
이러한 결과에 기초하여 전사체 및 유전자 발현 수준은 샘플당 FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped) 값 또는 리드 카운트로 계산하였다. 발현 프로필은 차등적으로 발현된 유전자(differentially expressed gene; DEG)의 수를 결정하는 것과 같은 추가 분석을 수행하는 데 사용되었다. StringTie를 사용하여 리드 카운트에서 유전자의 상대적 존재비(relative abundance)를 측정했다. 샘플에서 하나 이상의 리드 카운트 값이 있는 유전자는 제외하였고, 필터링된 데이터는 log2로 변환되었고 RLE 정규화를 수행하였다. 차등 발현 데이터의 통계적 유의성은 DESeq2 nbinomWaldTest 및 배수 변화(fold change)를 사용하여 결정되었으며, 여기서 null hypothesis는 그룹 간에 차이가 존재하지 않는 것이다. FDR(False Discover Rate)은 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p-값을 조정하여 제어했으며, DEG 세트의 경우 유사성 척도로 완전한 연결 및 유클리드 거리를 사용하여 계층적 클러스터링 분석을 수행하였다. g:Profiler를 사용하여 DEG에 대한 유전자 온톨로지 분석을 수행하고 KEGG 경로(https://www.genome.jp/kegg/) 데이터베이스를 기반으로 KEGG 경로 분석을 수행하였다. 샘플 간의 유사성을 시각화하기 위해 다차원 스케일링(MDS) 방법을 사용했으며, 비유사성의 척도로 유클리드 거리(Euclidean distance)를 적용하였다. 계층적 클러스터링 분석은 배수 변화 ≥ 2 및 원시 P < 0.05에 만족하는 차등적으로 발현된 전사체의 발현 패턴을 표시하기 위해 유사성 척도로서 완전한 연결(complete linkage) 및 유클리드 거리를 사용하여 수행되었다. 차등적으로 발현된 유전자의 모든 데이터 분석 및 시각화는 R(버전 3.6.1; www.r-project.org)을 사용하여 수행되었고, RNA 시퀀싱 데이터는 수탁 번호 GSE199847인 GEO 데이터베이스에서 사용 가능하다.
RNAi
본 발명에서 사용된 모든 siRNA는 Bioneer로부터 구입하였으며 사용된 siRNA에 대한 정보는 아래의 표 2와 같다. TC28a2 세포 또는 MSC를 6웰 플레이트에서 70-80% 융합 성장을 얻기 위해 플레이팅하고 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 각 siRNA의 100nM으로 형질감염시켰다. 형질감염 6시간 후, 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 다음날, 세포를 플레이트에서 분리하고, 계수하고, 각 실험에 적절한 세포 밀도로 다시 접종하였다.
siRNAs | Dose(nM) | 타겟 시퀀스(5'→3') |
Negative control | 100 | Sense: CCUACGCCACCAAUUUCGU (서열번호 52) Antisense: ACGAAAUUGGUGGCGUAGG (서열번호 53) |
LINC02035 | 100 | Sense: CAGGAUUGAGGAAUCUGUA (서열번호 54) Antisense: UACAGAUUCCUCAAUCCUG (서열번호 55) |
LOC100130207 | 100 | Sense: CAGAACUGCCAGCAGACUA (서열번호 56) Antisense: UAGUCUGCUGGCAGUUCUG (서열번호 57) |
LINC02593 | 100 | Sense: GAUUACAGAGUCAUUCAUU (서열번호 58) Antisense: AAUGAAUGACUCUGUAAUC (서열번호 59) |
LOC100287808 | 100 | Sense: CAAUUACCUCCAGCAUAU (서열번호 60) Antisense: UAUAUGCUGGAGGUAAUUG (서열번호 61) |
LMNTD2-AS1 | 100 | Sense: CUGACUUGCUGAAACUACA (서열번호 62) Antisense: UGUAGUUUCAGCAAGUCAG (서열번호 63) |
HCG4B | 100 | Sense: CUGCAAAGAAGGAACACUA (서열번호 64) Antisense: UAGUGUUCCUUCUUUGCAG (서열번호 65) |
LOC100287175 | 100 | Sense: GCAGCCUCCUCUUGUUCCU (서열번호 66) Antisense: AGGAACAAGAGGAGGCUGC (서열번호 67) |
IGFL2-AS1 | 100 | Sense: GACUCUCUUCAUAUGGACU (서열번호 68) Antisense: AGUCCAUAUGAAGAGAGUC (서열번호 69) |
RNA-IP
RNA-IP는 RUNX2 단백질과 본 발명에서 새롭게 발굴된 lncRNA 사이의 잠재적인 상호작용을 확인하기 위해 수행되었다. pcDNA3.1-RUNX2 벡터로 형질감염시킨 TC28a2 세포(1 x 107)를 각 실험에 사용하였다. RUNX2 결합 RNA-IP는 RiboCluster Profiler RIP 분석 키트 프로토콜(MBL International Corporation, Woburn, MA, USA)을 사용하여 수행되었다. 제조사에서 제공하는 디티오트레이톨(DTT; Sigma)이 첨가된 용해 완충액을 사용하여 세포를 용해시킨 후, 제조사에서 제공한 DTT가 첨가된 세척 완충액에 단백질 G와 아가로스 비드(Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 용해물을 미리 제거하였다. 미리 제거된 용해물을 RUNX2 항체(Santa Cruz Biotechnology) 또는 IgG 고정 비드를 포함하는 준비된 튜브로 옮겼습니다. 밤새 배양한 후, RUNX2 항체 또는 IgG-고정된 단백질 G 아가로스 비드 RNA/단백질 복합체를 분리하여 단백질 및 PUM1-결합 RNA를 추출하였다. 용출된 RNA는 qPCR로 분석하였다. RUNX2 항체 결합 RNA는 제조업체의 지침에 따라 키트를 사용하여 분리 및 정제되었다.
RUNX2 활성에 대한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)
RUNX2의 활성 측정은 제조사의 지침에 따라 인간 런트 관련 전사 인자 2(human runt-related transcription factor 2; Cloud-Clone Corp., Katy, TX, USA)용 ELISA 키트를 사용하여 수행되었다. TC28a2 세포는 제조업체의 지침에 따라 분석 전에 용해되었고, 사용된 샘플 또는 제조업체에서 제공한 표준을 항체가 미리 코팅된 플레이트로 옮기고 샘플을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 각 샘플을 흡인한 후, 준비한 검출 시약 A를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 검출 시약 B를 첨가하고 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트의 용액을 흡인하고 제조업체에서 제공한 세척 완충액으로 세척 후, 기질 용액을 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 20분 동안 다시 인큐베이션하였다. 정지액(stop solution)을 첨가한 후, 플레이트는 450 nm에서 분광광도계 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 판독되었다. 모든 샘플과 표준은 3회 테스트하였다.
lncRNA인 LINC02035 및 LOC100130207 in situ hybridization
제조사의 지침에 따라 RNAscope 2.5 HD Assay-RED 키트(Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA)를 사용하여 LINC02035 및 LOC1001303207의 세포 위치 및 in situ 사진을 관찰하였다. 샘플 준비를 위해 슬관절 전치환술을 받은 골관절염 환자로부터 얻은 관절 연골 조직을 멸균 조건에서 관절 표면에서 면도하고 손상되지 않은 부분과 손상된 부분으로 나눈 후 완전히 다졌다. 그런 다음 손상되지 않은 연골이나 손상된 연골에서 각각 1차로 연골세포를 분리하고 세포를 37℃에서 밤새 5% CO2 인큐베이터에서 4웰 유리 챔버 슬라이드(Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA)에서 배양하였다. 다음날, 세포는 RNA in situ 혼성화 분석에 즉시 사용되었고 결과를 검증하기 위해 표준 양성 대조군(Hs-PPIB, ACD-313901) 및 음성 대조군(DapB, ACD-310043) 프로브를 사용하였다. LINC02035(Hs-LINC02035, ACD 519 1116341-C1) 및 LOC100130207(Hs-LOC100130207-C1, ACD-1116351-C1. Advanced Cell Diagnostics에서 구입)의 제자리 교잡을 위한 프로브도 제조되었으며, 각 프로브의 염기서열 정보는 다음과 같습니다(Hs-LINC02035-C1 [Cat. No. 1116341; accession no. NR_024618.1; No. of pairs 20; target region 1451-2476] 및 Hs-LOC100130207-C1 [C Cat. No. 1116351; accession no. NR_149025.1; No. of pairs 20; Target region 645-1765]). RNA in situ 혼성화에 대한 모든 실험 절차는 제조업체의 지침에 따라 엄격하게 수행되었으며, 4-웰 유리 챔버 슬라이드에 접종된 세포를 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고, 슬라이드를 실온에서 15분 동안 퍼옥시다제 차단 용액으로 처리하였다. 그 후, 각 슬라이드에 100℃에서 15분 동안 회수 용액을 처리하였다. 하이브리드화 단계는 Advanced Cell Diagnostics에서 제공한 오븐에서 40℃에서 2시간 동안 수행하였다. 세척 단계 후, 샘플을 신호 증폭 용액과 함께 다음과 같이 인큐베이션하였다: 40℃에서 30분 동안 Amp1, 40℃에서 15분 동안 Amp2, 40℃에서 30분 동안 Amp3, 40℃에서 15분 동안 Amp4, 실온에서 30분 동안 Amp5, 실온에서 15분 동안 Amp6. 그런 다음 샘플을 Fast Red A 및 B 용액과 함께 배양하여 각 표적 lncRNA-양성 포인트를 시각화하고 대조염색을 위해 헤마톡실린과 함께 배양하였다. 결과는 표준 현미경을 사용하여 관찰하였다.
RNA 세포내 분획화
TC28a2 세포에서 세포질 및 핵 RNA의 분획은 제조업체의 지침에 따라 RNA Subcellular Isolation Kit(Active Motif, Inc., Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. TC28a2 세포로부터 분리된 세포질 및 핵 RNA를 역전사하고, 본 발명에서 발굴한 각 lncRNA의 발현 수준을 qPCR로 평가하였다. 세포질 및 핵 RNA의 백분율을 얻기 위해 전체 세포 RNA[입력의 % = 100 x [2(Ct total RNA - Ct RNA fraction)]]에 대해 데이터 정규화를 수행하였다.
IP
pcDNA3.1-RUXN2 또는 LINC02035 또는 LOC100130207을 표적으로 하는 siRNA로 형질감염된 TC28a2 세포의 용해물을 준비하고, 준비된 용해물은 단백질 A/G 아가로스 비드(Santa Cruz Biotechnology) 및 RUNX2에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 배양하였다. 용해물과 RUNX2 항체가 결합된 비드를 원심분리 후 용해 완충액으로 3회 세척하였다. 2x SDS 샘플 염료를 이용하여 비드로부터 복합체를 분리하고 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 모든 멤브레인을 RUNX2(Santa Cruz Biotechnology), ubiquitin(Santa Cruz Biotechnology) 또는 HSP90(Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체와 함께 12시간 동안 인큐베이션한 다음, HRP가 결합된 이차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다.
Safranin O, H&E 및 IHC 염색
중간엽줄기세포(hMSC)에 siRNA(siLINC02035 또는 siLOC100130207)를 각각 형질 감염(transfection)시키고, 그룹 당 3 개의 3D mass (3 x 105 세포/1 mass)로 연골 분화(Chondrogenic differentiation) [(DMEM-HG supplemented with 1% antibiotic-antimycotic solution, 1% Insulin Transferrin Selenium-A (ITS; Invitrogen), 50 mg/mL ascorbic acid (Invitrogen) 및 10 ng/mL TGF-b3 (R&D Systems)]를 14 일 동안 유도한 뒤 연골 펠렛을 피브린 겔(fibrin gel, 20ul/3 mass)과 섞어, 마취된 누드 마우스의 등 아래 피부를 약 5mm 정도 절개하여 mass를 이식하고 봉합하였다. 이식 7 일 후에 조직학적 분석을 위해 생성된 조직을 분리하였다. 분리된 조직을 포르말린에 24 시간 고정하고, 파라핀 포매(paraffin embedding)하였다. 파라핀 블럭을 6 um의 두께로 잘라 슬라이드에 붙이고, 슬라이드는 safranin-O(1% in 1% acetic acid)/fast green(0.02% in D.W.), H&E 염색을 수행하였다. 면역 조직 화학적 염색(immunohistochemistry; IHC)을 위해 antigen retrieval을 유도한 후, RUNX2(Santa Cruz, sc-390351), IgG(BD Bioscience, 555746)를 4 ℃에서 오버나이트 인큐베이션을 하였다. HRP polymer mouse/rabbit 항체(2차 항체)를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, AEC substrate kit(abcam)를 이용하여 최종 염색하고, 현미경으로 관찰하였다.
통계학적 분석
모든 실험은 적어도 3명의 기증자의 샘플을 사용하여 3중으로 수행되었으며, 두 그룹 간의 차이를 평가하기 위해 스튜던트 t-검정이 사용되었다. 3개 이상의 그룹 간의 차이의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(ANOVA) 및 사후 Bonferroni 수정을 사용하여 계산되었고, 각 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시하였다. 모든 테스트에서 P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었으며, 상호작용 강도는 RPISeq(http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/index.html)를 사용하여 예측하였다.
슬관절 전치환술을 시행한 골관절염 환자의 연골 조직에 대한 배제 기준은 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 자가면역질환, 강직성 척추염, 암, 장기 코르티코스테로이드 치료 이력이었다.
본 발명에서의 모든 통계학적 분석은 분산 분석 (ANOVA) 또는 GraphPad Prism6 소프트웨어를 사용한 Student's t-test를 적용하였으며, 각 데이터는 평균 ± 표준 편차로 계산되었다. P - 값 (p - value)이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험결과
1.RUNX2와 연골 세포 비대와의 관계
RUNX2 전사 인자는 도 1a에서 보는 바와 같이 연골 세포의 비대 변화의 중심 조절자이며, 연골 기질의 분해에 관여하는 것으로 알려져 있다. 연골 세포의 비대 변화와 연골 기질의 분해에서 RUNX2의 조절 역할을 확인하기 위해 먼저 면역 조직 화학(IHC)을 수행하여 OA 환자로부터 얻은 연골 조직에서 RUNX2를 포함한 비대 마커를 검출한 결과, 연골 세포 비대 마커 IHH, RUNX2 및 COL10A1은 손상된 연골 조직에서 높게 검출된 반면, 정상 연골 조직에서는 거의 검출되지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 1b 참조). 시험관 내 환경에서 연골세포 비대의 변화를 관찰하기 위해 정상 연골 세포주인 TC28a2 세포를 사용하였고 시험관 내 골관절염 환경을 모방하기 위해 염증성 사이토카인인 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)를 사용하였다. 염증성 사이토카인이 PTGES(염증 마커 COX2)와 비대 마커인 IHH 및 COL10A1의 mRNA와 단백질 수준을 상향 조절한다는 것을 확인하였으며, 흥미롭게도 RUNX2 단백질의 양은 염증성 사이토카인에 의해 상향 조절되었지만 mRNA 수준은 변하지 않았다(도 2a 및 도 2b 참조). 비대 배지(hypertrophy medium; HM)를 사용하여 연골세포 비대에 특화된 시험관내(in vitro) 환경을 조성하였고, 마찬가지로 비대 배지는 TC28a2 세포에서 연골 세포 비대의 마커인 IHH 및 COL10A1의 mRNA와 단백질 수준을 모두 상향 조절한 반면, 비대 배지는 RUNX2의 단백질 수준을 개선했지만 mRNA 수준은 변화시키지 않는 것을 확인하였다(도 3a 및 도 3b 참조).
RUNX2가 연골 세포의 비대 변화와 기능적으로 연관되어 있는지 여부를 보다 명확히 하기 위해, 본 발명자들은 비대 및 염증 환경에서 siRNA 매개 녹다운(KD) 실험을 수행하였고, 그 결과 RUNX2의 녹다운 시 비대 배지 또는 TNF-α 처리로 유발된 연골 기질 단백질인 COL2A1 및 ACAN의 손실로부터 연골 세포를 보호한다는 것을 확인하였다. 또한, RUNX2의 녹다운 시 IHH 및 COL10A1 마커의 상향 조절을 억제하였다(도 4 참조).
뼈의 조골세포에서 생성되는 단백질인 오스테오칼신(OCN)이 연골 조직의 기질 석회화에 관여하는 것으로 알려져 있어서, 연골 세포의 OCN 활성이 비대 배지 또는 TNF-α 처리에 의해 조절되는지 여부를 확인하고자 인간 OCN pGreenZeo(copGFP) 분화 리포터 분석을 수행하였다. TC28a2 세포는 OCN 프로모터 및 copGFP를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었고 제오마이신으로 선별한 후 리포터 분석에 사용하였다. 그 결과, 비대 배지 또는 TNF-α를 처리한 TC28a2 세포에서 강한 copGFP 신호가 검출되었으며, 증가된 copGFP 신호가 RUNX2의 siRNA 매개 KD에 의해 크게 감소되는 것을 확인하였다(도 5a 및 도 5b 참조). 상기 내용을 종합하면, RUNX2가 연골 세포의 비대 변화의 마스터 조절자임을 다시 한번 확인하였다.
2. LncRNA와 RUNX2 단백질 간의 상호작용
연골 세포 비대와 관련된 분자 메커니즘을 확인하기 위해 비대 배지에서 성장한 TC28a2 세포에서 추출한 RNA를 사용하여 RNA 시퀀싱 분석을 수행하였다. 히트맵을 통해 성장 배지 또는 비대 배지에서 성장한 TC28a2 세포 사이에서 나타나는 차별화되는 전사체를 표시하였다(도 6a 참조). 비대 분화 배지에서 성장한 TC28a2 세포에서 총 1,707개의 전사체가 상향 조절(log2 [fold-change] > 2, FDR < 0.05)되는 것을 확인하였고, 987개의 전사체가 하향 조절(log2 [fold-change] < -2, FDR < 0.05)되는 것을 확인하였다(도 6b 참조). KEGG 경로 분석을 통해 환경 정보 처리(environmental information processing) 및 대사(metabolism)와 관련된 경로가 차등적으로 조절된 세포 신호 전달 경로로 상당한 비율을 차지하는 것을 확인하였다(도 6c 참조). KEGG 경로 분석 중 PI3K-AKT 및 FOXO 신호 전달 경로가 RUNX2 단백질의 안정성에 관여하기 때문에 이의 변화에 중점을 두었다. 비대 배지 또는 TNFα로 처리된 TC28a2 세포에서 AKT 인산화가 증가하는 반면 FOXO3A 인산화는 감소한다는 것을 확인하였다(도 7 참조). 이러한 결과는 RUNX2가 연골 세포의 비대 분화 동안 번역 후 수준에서 조절될 수 있음을 의미하는 것이다.
차등적으로 발현된 전사체 중 2,181개의 단백질 코딩 유전자와 223개의 lncRNA를 스크리닝하여 RNA 시퀀싱 분석을 수행하였고, 도 8을 참조하면 대조군과 비대 그룹 사이에서 lncRNA 및 단백질 코딩 mRNA의 발현에 차이가 있음을 알 수 있다. 여기서, LcnRNA는 단백질, DNA 또는 RNA에 물리적으로 결합하여 표적 단백질의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. RUNX2는 상기에서 실험한 결과에서 확인하였듯이 번역 후 수준에서 조절되는 것으로 나타났으며, lncRNA의 차등 발현이 RNA 시퀀싱 결과에서 관찰되었기에 본 발명자들은 수많은 lncRNA 중에서 RUNX2 단백질의 안정화에 관여하는 특정 lncRNA를 발굴하고자 하였다. 히트맵은 4배 이상 상향 조절되거나 비대 분화 동안 발현 수준이 가장 크게 감소한 21개의 차등적으로 발현된 lncRNA를 도 9에 나타내었다. 그런 다음 상향 조절된 lncRNA 중 RUNX2와 상호 작용할 수 있는 lncRNA를 예측하기 위해 컴퓨터 알고리즘(RPISeq; RNA-Protein Interaction Prediction)을 수행하였다. 0.5 이상의 값이 기록되는 경우에 분석된 RNA와 단백질 간 결합 가능성이 양성인 것으로 해석하였다 (http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/about.php#basic). 그러나, 분석된 대부분의 lncRNA는 아래의 표 3과 같이 양성으로 확인되었다.
Rank | LncRNA name | RF classifier | SVM classifier |
1 | SNAP25-AS1 | 0.95 | 0.99 |
2 | ARHGAP5-AS1 | 0.95 | 0.95 |
3 | LIFR-AS1 | 0.9 | 0.99 |
4 | LINC02035 | 0.9 | 0.98 |
5 | MKLN1-AS | 0.9 | 0.97 |
6 | HCG4B | 0.95 | 0.9 |
7 | LOC100130207 | 0.9 | 0.95 |
8 | LINC02015 | 0.9 | 0.94 |
9 | LOC101927811 | 0.85 | 0.96 |
10 | A2M-AS1 | 0.85 | 0.93 |
11 | LOC90246 | 0.85 | 0.92 |
12 | TSC22D1-AS1 | 0.8 | 0.96 |
13 | IGFL2-AS1 | 0.85 | 0.9 |
14 | LOC100287808 | 0.85 | 0.77 |
15 | OBSCN-AS1 | 0.85 | 0.69 |
16 | LOC100129034 | 0.8 | 0.68 |
17 | FOXD2-AS1 | 0.95 | 0.48 |
18 | LINC02593 | 0.8 | 0.47 |
19 | LMNTD2-AS1 | 0.8 | 0.45 |
20 | H19 | 0.7 | 0.34 |
21 | LOC100287175 | 0.55 | 0.3 |
이에 따라, RUNX2에 결합할 수 있는 lncRNA를 식별하기 위해 RNA-면역침전(RNA-IP)을 수행하였고, RUNX2를 인코딩하는 벡터를 TC28a2 세포에 형질감염시키고, RUNX2에 대한 IP 결과를 확인하였다(도 10a 및 도 10b 참조). 그 결과, TC28a2 세포에서 염증 반응 동안 RUNX2 단백질에서 총 8개의 lncRNA가 축적되는 것을 확인할 수 있었다(도 10c 참조).
3. 연골 세포에서 RUNX2와 상호작용하는 신규한 LncRNA 발굴
RUNX2 결합 lncRNA가 RUNX2 단백질의 안정성에 기능적으로 기여할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 각 lncRNA에 대해 siRNA 매개 녹다운 실험을 수행하였다. 이때 사용된 각 siRNA의 KD 효율은 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 통하여 확인하였다(도 11a 참조). TC28a2 세포는 비대 배지 또는 TNF-α로 처리되었으며, 각 lncRNA가 녹다운되었을 때 RUNX2 단백질의 양적 변화를 웨스턴블롯팅하여 그 결과를 도 11b에 나타내었다. 특히, LINC02035 또는 LOC100130207에 대해 siRNA로 형질감염된 TC28a2 세포는 비대성 또는 염증성 조건에서도 RUNX2 단백질 수준의 증가를 나타내지 않은 것을 확인하였다(도 11c 참조). 추가 분석을 위해 LINC02035 또는 LOC100130207에 대해 siRNA로 형질감염된 TC28a2 세포에서 RUNX2 활성을 측정하였고, 그 결과 RUNX2 활성이 이 두 lncRNA의 녹다운에 의해 유의하게 감소되었음을 확인할 수 있었다(도 11d 참조). 이와 같은 결과는 LINC02035 및 LOC100130207이 연골 세포에서 RUNX2와 기능적으로 상호 작용하는 것을 시사한다. 다음으로, LINC02035 또는 LOC100130207이 연골 세포 비대 마커의 증가와 연골 기질 단백질의 분해에 관여하는지 확인하고자 하였다. 도 12a를 참조하면 웨스턴 블로팅 결과 상기 두가지 lncRNA의 녹다운 시 비대성 또는 염증성 조건에서 IHH, COLA10A1 및 MMP13과 같은 비대 마커의 상향 조절을 억제한다는 것을 확인하였다(도 12a 참조). 또한, OCN의 프로모터 활성은 이들 두 lncRNA의 녹다운에 의해 각 조건에서 증가하지 않았다(도 12b 및 도 12c 참조). 또한, 이 두 lncRNA의 녹다운 시 연골 세포 비대와 염증 반응에 의해 파괴되는 연골 기질 단백질 COL2A1과 ACAN의 감소를 방지할 수 있음을 알 수 있다(도 12d 참조). 이러한 결과를 통하여, 다양한 lncRNA 중에서도 특히 LINC02035 및 LOC100130207의 녹다운 시 비대 및 염증 반응으로부터 연골 세포를 보호할 수 있음을 확인하였다.
4. LINC02035 및 LOC100130207의 효과 확인(1) - RUNX2 단백질 안정화
본 발명자들은 새롭게 발굴한 lncRNA인 LINC02035 및 LOC100130207의 분자 메커니즘을 검증하기 위해 환자로부터 유래된 일차 연골세포를 사용하여 in situ 분석을 수행하였다. 그 결과, LINC02035와 LOC100130207 모두 골관절염(OA) 환자의 무릎 연골에서 분리된 연골 세포에서 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 13 참조). 이에 TC28a2 세포에서 상기 두 lncRNA가 작용하는 부위를 밝히기 위해 두 lncRNA의 세포내 국소화 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 14의 맨 왼쪽 그래프를 살펴보면 LINC02035와 LOC100130207이 정상 연골세포의 핵과 세포질에 고르게 분포되어 있음을 확인하였던 반면, 도 14의 중간과 오른쪽 그래프를 살펴보면 TC28a2 세포가 비대 배지 또는 TNF-α로 처리된 후 두 lncRNA 모두 핵에 우선적으로 분포되었고 세포질에는 더 적은 정도로 분포되는 것을 확인하였다. 연골 세포의 비대 변화 동안 RUNX2가 번역 후 수준에서 조절되는지 여부를 확인하고자 TC28a2 세포에 프로테아좀 억제제 MG132를 처리하였다. 그 결과 RUNX2의 단백질 수준이 MG132 처리에 의해 용량 의존적으로 증가함을 확인하였으며(도 15 참조), 이는 골관절염 또는 비대성 연골세포에서 RUNX2의 상향 조절이 번역 후 수준에서 발생함을 시사하는 것이다. 두 lncRNA가 연골세포의 비대 분화과정에서 RUNX2 단백질의 안정화와 염증반응에 관여하는지 알아보기 위해 RUNX2 단백질의 유비퀴틴화를 확인하기 위해 IP를 시행하였다. 먼저 연골 세포의 비대 분화 또는 염증 반응 동안 RUNX2 단백질의 유비퀴틴화가 어떻게 조절되는지 조사한 결과, 비대 배지 또는 TNF-α 처리에 의해 RUNX2의 유비퀴틴화가 감소됨을 확인하였다(도 16a 참조). 그러나 RUNX2 단백질의 유비퀴틴화는 세포가 비대 배지 또는 TNF-α로 처리되었음에도 불구하고 LINC02035 또는 LOC100130207을 표적으로 하는 siRNA로 형질감염된 TC28a2 세포에서 분명히 증가하는 것을 알 수 있다(도 16b 참조). 이러한 결과는 비대 분화 동안 상향 조절된 lncRNA와 연골 세포의 염증 반응이 모두 RUNX2 단백질의 안정화에 기여함을 시사한다.
5. LINC02035 및 LOC100130207의 효과 확인(2) - 연골세포 비대 억제
중간엽 줄기 세포(MSC)는 손상된 연골 조직을 재생하는 큰 잠재력을 가지고 있다는 것이 이미 알려져 있지만 이들의 임상 적용에는 큰 한계가 있다. 특히, 연골세포 비대는 연골내 골화에 필수적인 과정으로, 연골세포가 안정된 특성을 유지하는 관절 연골의 재생에 문제가 될 수 있다. 따라서 성공적인 연골 재생은 비대 표현형이 없는 연골성 MSC(chondrogenic MSCs)를 사용하여 달성할 수 있다. 먼저 연골 형성 및 비대 마커에 대한 mRNA 및 단백질의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 확인한 결과 chondrogenic(SOX9 and COL2A1)과 hypertrophic marker(COL10A1)의 mRNA와 단백질 수치는 분화기간 동안 뚜렷하게 증가하였으나 RUNX2에서는 분화기간 동안 단백질 수치가 지속적으로 상향 조절되는 반면 mRNA 수치는 분화의 후기 단계에서 기저 수준으로 다시 감소하는 경향을 보였다(도 17a 및 도 17b 참조). 흥미롭게도 LINC02035와 LOC100130207의 발현 수준은 RUNX2의 mRNA 패턴이나 단백질 수준에 관계없이 분화 후기 단계에서만 상향 조절됨을 확인하였다(도 17c 참조). 두 lncRNA가 MSC의 연골 분화에서 비대 표현형에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가하기 위해 siRNA를 사용하여 LINC02035 및 LOC100130207을 녹다운시키고, 관련 표현형을 확인하였다. 두 lncRNA가 각각의 siRNA에 의해 잘 감소되었음을 확인하였고, COL10A1의 mRNA 수준도 감소하였지만 RUNX2의 mRNA 수준은 변하지 않았음을 확인하였다(도 18a 참조). 사프라닌 O(safranin O)와 알시안 블루(alcian blue)로 염색한 결과, 두 lncRNA의 녹다운 시 글리코아미노글리칸(glycosaminoglycan)의 합성에 유의한 영향을 미치지 않았으나, RUNX2의 단백질은 siRNA-형질 감염된 그룹에서는 거의 발현되지 않은 것을 확인하였다(도 18b 참조). 흥미롭게도 각 siRNA로 형질전환된 연골 매스(chondrogenic mass)의 크기는 대조군보다 컸다. 웨스턴 블롯 결과, LINC02035 또는 LOC100130207의 녹다운 시 비대 마커 RUNX2 및 COL10A1의 상향 조절을 억제한 반면 연골 형성 마커 SOX9 및 COL2A1의 단백질 수준은 siRNA-형질감염 그룹에서 거의 변하지 않았음을 확인하였다(도 18c 참조). 이러한 결과는 LINC02035 및 LOC100130207이 비대 표현형(hypertrophic phenotype) 없는 MSC 유래 chondrogenic mass를 유도하기 위한 새로운 치료 표적이 될 수 있음을 시사하는 것이다.
6. LINC02035 및 LOC100130207의 효과 확인(3) - in vivo 실험 수행
두 lncRNA의 억제에 의한 연골 세포 비대 예방 효과를 in vivo 상에서 확인하기 위하여, siRNA를 각각 중간엽줄기세포(hMSC)에 형질 감염시켜, siNC 대조 그룹, siLINC02035 그룹, siLOC100130207 그룹 각각에 대하여 3 개의 3D mass (3 x 105 세포/1 mass)로 연골 분화를 14 일 동안 유도하였다(도 19a 및 도 19b 참조). 이를 마취된 누드 마우스에 이식하고, 7일 후에 조직학적 분석을 위해 생성된 조직을 분리하여 safranin-O 및 H&E 염색을 수행하였다. 면역 조직 화학적 염색 결과, 대조군 siNC 그룹에서의 RUNX2 발현량에 비해 lncRNA가 억제된 두 그룹(siLNC02035 및 siLOC100130207)에서 연골세포 비대화 마커인 RUNX2의 발현이 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 20 참조). 이는 in vivo 상에서 silncRNA인 siLNC02035 및 siLOC100130207의 연골 세포 비대를 억제하는 효과를 재확인한 것으로, 실질적으로 이의 유효성분을 이용함으로써 비대 억제를 통한 관절염의 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
상기 내용을 종합하면, 관절 연골의 변성 및 염증 반응 외에도 관절 연골에 존재하는 연골 세포의 비대 변화도 골관절염의 특징 중의 하나로, 본 발명의 조성물은 연골 세포 비대와 같은 변화를 예방하거나 지연시킴으로써 추가 골관절염 진행을 막고, 더 나아가 골관절염 질환을 치료할 수 있다. 특히, 신규한 lncRNA인 LINC02035 및 LOC100130207은 RUNX2 단백질 안정화에 크게 기여하므로 골관절염의 진단을 넘어 RUNX2 매개 연골세포 비대를 조절하여 골관절염의 진행을 늦추거나 예방할 수 있는 골관절염의 새로운 치료 표적이 될 수 있을 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (22)
- 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 골 관련 질환의 진단용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 lncRNA는 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 조성물. - 제 2항에 있어서,
상기 lncRNA는 LINC02035 또는 LOC100130207인, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 lncRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 골 관련 질환은 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골화석증(osteopetrosis), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 거대세포종 (giant cell tumor), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer) 관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis) 및 연골석회화증(chondrocalcinosis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 골 관련 질환은 연골 세포의 비대성 변화(hypertrophic change)의 조절 이상으로 발생하는 것인, 조성물. - 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 골 관련 질환의 진단용 키트.
- 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서, 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 골 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 생물학적 시료에서 측정된 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 높을 경우, 상기 목적하는 개체에게 연골 세포의 비대 조절 이상으로 인한 골 관련 질환이 있는 것으로 예측하는 것인, 방법. - 제 8항에 있어서,
상기 lncRNA는 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 방법. - 제 8항에 있어서,
상기 골 관련 질환은 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골화석증(osteopetrosis), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 거대세포종 (giant cell tumor), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer) 관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis) 및 연골석회화증(chondrocalcinosis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인, 방법. - (a) 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에 대하여 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)의 발현 수준을 측정하는 측정부; 및
(b) 상기 측정부에서 측정된 lncRNA의 발현 수준으로부터 상기 목적하는 개체의 골 관련 질환의 발병 또는 발병 가능성 여부를 출력하는 검출부;를 포함하는 골 관련 질환의 진단기기. - 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)의 발현 수준을 감소시키는 제제를 포함하는, 연골 세포의 비대(Chondrocyte hypertrophy) 억제용 조성물.
- 제 13항에 있어서,
상기 lncRNA는 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 조성물. - 제 13항에 있어서,
상기 발현 수준을 감소시키는 제제는 lncRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 조성물. - 제 13항에 있어서,
상기 조성물은 관절 연골의 혈관화 또는 석회화를 억제하여 초기 염증 반응의 조절이 가능한, 조성물. - 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA)의 발현 수준을 감소시키는 제제를 포함하는, 골 관련 질환 치료용 약학 조성물.
- 제 17항에 있어서,
상기 lncRNA는 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 조성물. - 제 17항에 있어서,
상기 골 관련 질환은 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골화석증(osteopetrosis), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 거대세포종 (giant cell tumor), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer) 관련 골재흡수 질병, 골절(fracture), 골용해(osteolysis) 및 연골석회화증(chondrocalcinosis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인, 조성물. - 제 17항에 있어서,
상기 골 관련 질환은 연골 세포의 비대성 변화(hypertrophic change)의 조절 이상으로 발생하는 것인, 조성물. - 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 후보물질의 처리하는 단계; 및
상기 생물학적 시료에서 LINC02035, LOC100130207, LINC02593, LOC100287808, LMNTD2-AS1, HCG4B 및 LOC100287175로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNAs; lncRNA) 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 골 관련 질환 치료제를 스크리닝하는 방법으로,
상기 골 관련 질환은 연골 세포의 비대성 변화(hypertrophic change)의 조절 이상으로 발생하는 것인, 방법. - 제 21항에 있어서,
상기 스크리닝하는 방법은 상기 후보물질의 처리 후에 측정된 lncRNA의 발현 수준이, 상기 후보물질의 처리 전에 측정된 lncRNA의 발현 수준에 비하여 감소된 경우, 상기 후보물질을 골 관련 질환 치료제로 선별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
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