阿尔茨海默诊治用标志物FAM170A
技术领域
本发明涉及生物技术领域,涉及阿尔茨海默诊治用标志物FAM170A。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是慢性神经系统变性疾病,起病隐匿、进行性加重。早期常见的临床表现主要为近事记忆障碍,随着疾病进展,会出现语言功能障碍、定向力障碍(易迷路),情感迟钝、淡漠,情绪改变,不能自理以及行为改变等。随着患者病情的恶化,会逐渐与家庭、社会脱离,身体机能也会丧失,最终死亡。尽管其进展速度各异,但从诊断到死亡的一般生存期是3-9年(Henry W.Querfurth MD,Ph.D.,and FrankM.LaFerla,Ph.D.Alzheimer’s disease[J].The new engl and journal ofmedicine.2010,2010(362):329-44.)。阿尔茨海默病已明确的病因很少,由遗传因素引起的约占70%(Ballard C,Gauthier S,Corbett A,Brayne C,Aarsland D,JonesE.Alzheimer's disease[J].The Lancet.2011,377(9770):1019-31.),其他因素可能有头部外伤、抑郁和高血压等。
阿尔茨海默病基本病程根据认知功能和相关机能的损害可以分为四个阶段,痴呆前期、痴呆早期、中期和晚期。其病因目前已知的有遗传因素和多种假说,遗传因素导致的AD发病年龄较早,多早于65岁,称为家族性AD(Familial Alzheimer's Disease,FAD)。关于阿尔茨海默病的病因的多种假说,包括胆碱能学说、淀粉样蛋白假说、tau蛋白假说等等。阿尔茨海默病的病理表现是Aβ沉积导致的老年炎性斑(Senile Plaques,SP)和tau蛋白的高度磷酸化引起的神经原纤维缠结(Neurofibrillary Tangles,NFTs)以及神经元的损伤和丢失。
阿尔茨海默的诊断主要依据病史、神经心理评估以及血液学检查并排除其他可能的疾病。目前除了某些药物或治疗方法可以暂时缓解症状进展外,没有治愈和逆转其进程的有效方法。目前,能够诊断AD的生物标志物种类较少,灵敏性及特异性也不理想,仅有少数几种能作为辅助诊断方法应用于临床,如β-淀粉样蛋白、tau蛋白、AD相关的神经丝蛋白(Alzheimer-associated neuronal thread protein,AD7c-NTP)(Tapiola T,AlafuzoffI,I-Ierukka S-K,et al.Cerebrospinal fluidβ-amyloid 42and tau proteins asbiomarkers of Alzheimer-type pathologic changes in the brain[J].Arch Neurol,2009,66(3):382-389),它们在AD患者的脑脊液中表达明显异常,但由于脑脊液采集的有创性,限制了其应用,而血液中的这些标志物能否作为生物标志物应用于AD的诊断尚存在争议,目前仅作为AD的危险因素评估使用。因此,迫切需要提高AD早期诊断水平,在疾病早期给予有效干预和治疗。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的之一在于提供一种与阿尔茨海默发生发展相关的基因标志物。
本发明的目的之二在于提供阿尔茨海默的生物标志物在阿尔茨海默临床诊断和治疗中的应用。
本发明的目的之三在于提供阿尔茨海默的生物标志物在筛选治疗阿尔茨海默的药物中的应用。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面提供了一种试剂,所述试剂能够检测样本中FAM170A基因或其表达产物的水平。
进一步,所述试剂包括:
特异性识别FAM170A基因的探针;或
特异性扩增FAM170A基因的引物;或
特异性结合FAM170A基因编码的蛋白的特异性结合剂。
进一步,特异性扩增FAM170A的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
本发明的第二方面提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明的第三方面提供了一种芯片,所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明的第四方面提供了一种核酸膜条,所述核酸膜条包括本发明第一方面所述的试剂。
本发明的第五方面提供了一种组合物,所述组合物包括FAM170A的抑制剂,和/或药学上可接受的载体。所述抑制剂是指任何可降低FAM170A蛋白的活性、降低FAM170A基因或蛋白的稳定性、下调FAM170A基因或蛋白的表达、减少FAM170A蛋白有效作用时间、或抑制FAM170A基因的转录和翻译的物质,这些物质均可用于本发明,作为对于下调FAM170A有用的物质,从而可用于预防或治疗阿尔茨海默。例如所述的抑制剂包括核酸抑制物,蛋白抑制剂,蛋白水解酶,蛋白结合分子;所述药学上可接受的载体和/或辅料,包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂;所述药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。
进一步,所述抑制剂为下调FAM170A基因或蛋白的表达的物质。
进一步,所述抑制剂为siRNA。
本发明的第六方面提供了一种筛选治疗阿尔茨海默的候选药物的方法,所述方法包括:
用待筛选物质处理表达或含有FAM170A基因或其编码的蛋白的培养体系;和
检测所述体系中FAM170A基因或其编码的蛋白的表达或活性;
其中,若所述待筛选物质可以抑制FAM170A基因的水平或表达活性,则表明该待筛选物质是治疗阿尔茨海默的候选药物。
在本发明中,所述体系包括(但不限于):细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在本发明中,所述的步骤还包括:对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验,以从候选药物中进一步选择可以治疗阿尔茨海默的药物。
本发明的第七方面提供了如下任一项所述的应用:
a.本发明第一方面所述的试剂在制备早期诊断阿尔茨海默的产品中的应用;
b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断阿尔茨海默的产品中的应用;
c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断阿尔茨海默的产品中的应用;
d.本发明第四方面所述的核酸膜条在制备诊断阿尔茨海默的产品中的应用;
e.本发明第五方面所述的组合物在制备治疗阿尔茨海默的药物中的应用;
f.本发明第六方面所述的方法在筛选治疗阿尔茨海默的候选药物中的应用;
g.FAM170A在筛选治疗阿尔茨海默的候选药物中的应用;
h.FAM170A在制备治疗阿尔茨海默的药物中的应用;
i.FAM170A在构建诊断阿尔茨海默的计算模型中的应用。
本发明的优点和有益效果:
本发明首次发现了FAM170A基因表达与阿尔茨海默病相关,通过检测受试者血液中FAM170A的表达水平,可以判断受试者是否患有阿尔茨海默病、或者判断受试者是否存在患有阿尔茨海默病的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明首次发现了改变FAM170A的表达水平,可以改变阿尔茨海默模式细胞的增殖,提示FAM170A可作为潜在的分子靶点应用于阿尔茨海默病的个性化治疗。
附图说明
图1是利用QPCR检测FAM170A基因在阿尔茨海默病患者血液中的表达情况图;
图2是利用QPCR检测FAM170A基因沉默情况图;
图3是利用MTT检测FAM170A基因表达对阿尔茨海默神经细胞生长的影响图。具体的实施方式
本发明通过高通量测序技术以及进行高通量测序分析,检测阿尔茨海默患者和正常人血液中的基因表达水平,发现其中具有明显差异的基因,探讨其与阿尔茨海默的发生之间的关系,从而为阿尔茨海默的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。经过筛选本发明首次发现了FAM170A在阿尔茨海默患者中表达下调,并通过基因过表达技术进一步验证了FAM170A参与神经细胞的增殖过程,提示FAM170A可作为阿尔茨海默的独立预测因子,也可以和其他的基因标志物联合应用。
FAM170A基因
FAM170A基因位于5号染色体长臂2区3带上,目前在国际公共核酸数据库GeneBank中的gene ID为340069。在本发明中,FAM170A包括野生型、突变型或其片段。作为非限制性的实施例,一种代表性的FAM170A基因具有NM_001163991.1所示的序列。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解,测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
检测技术
本发明的基因和蛋白使用本领域普通技术人员已知的多种技术进行检测,这些技术包括但不限于:核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。
所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中,PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR),TMA和NASBA直接扩增RNA。
本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。
本发明的蛋白免疫技术包括夹心免疫测定,例如夹心ELISA,其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测;放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
检测FAM170A蛋白的试剂为FAM170A蛋白的特异性结合剂。特异性结合剂是例如蛋白质FAM170A的受体、结合蛋白质FAM170A的凝集素、针对蛋白质FAM170A的抗体、针对蛋白质FAM170A的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。
特异性结合剂的例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。作为一种优选的实施方式,所述特异性结合剂为FAM170A特异性抗体。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到,由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击,因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
芯片、制剂、核酸膜条、试剂盒
在本发明中,芯片包括基因芯片、蛋白芯片;所述基因芯片包括固相载体;以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于FAM170A所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体,以及固定在固相载体上的FAM170A编码的蛋白的特异性抗体或配体。
所述固相载体包括无机载体和有机载体,所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等;所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的探针;所述基底可以是任何适于固定探针的基底,例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。其中示例性寡核苷酸探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针,例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
本发明的试剂盒可用于检测FAM170A基因或蛋白的试剂以及选自下组的一种或多种物质:容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。
本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书,其中记载了如何采用试剂盒进行检测。
在某些实施方案中,本文提供的是用于检测一种或多种生物标志物的蛋白质水平的试剂盒。在某些实施方案中,所述试剂盒包含用识别蛋白质生物标志物的抗体包被的试纸条、洗涤溶液、进行该试验的试剂、蛋白质分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中,所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。
抑制剂和药物组合物
本发明提供了一种药物(组合物),它含有有效量的所述的FAM170A的抑制剂,以及药学上可接受的载体,所述的组合物可用于治疗阿尔茨海默。所述抑制剂包括降低FAM170A基因或其表达产物稳定性、下调FAM170A基因或其表达产物的表达水平、减少FAM170A基因或其表达产物有效作用时间的物质。例如所述抑制剂包括核酸抑制物,蛋白抑制剂,蛋白水解酶,蛋白结合分子。
作为本发明的一种选择方式,所述的FAM170A的抑制剂是一种特异性与FAM170A结合的抗体。所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体;本发明不仅包括完整的抗体分子,也包括抗体的任何片段或修饰,例如,嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与FAM170A蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的,并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体
作为本发明的一种优选方式,所述FAM170A的抑制剂是一种FAM170A特异性的小干扰RNA分子。如本文所用,所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA,这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式,它含有一个正义链和一个反义链,这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此,举例来讲,互补的正义链和反义链是化学合成的,其后可通过退火杂交,产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时,本发明人通过大量的比对分析,从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列,并将它们分别通过转染试剂转染相关细胞系进行验证,选出干扰效果最佳的siRNA,并进一步地在细胞水平实验,从而证明基因对相关细胞的影响。
本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成,也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物,可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内,或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
作为本发明的一种可选方式,所述的FAM170A的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA,shRNA)”,其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述,shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体,例如质粒或病毒载体,然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下,可被切割成小干扰RNA分子,从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒,通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列,从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列,该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(ShortHairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得,例如一些病毒载体。
本发明所述药物组合物组合物可以是适合注射给药的剂型、适合口服摄取的剂型(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的油膏、乳膏或洗剂形式、适合用作滴眼剂的递送剂型、适合通过吸入给药的气雾剂形式(如通过鼻内吸入或口吸入)、适合胃肠外给药的剂型,即皮下、肌肉内或静脉内注射。
本发明的药物组合物还可以与其他治疗阿尔茨海默的药物联用,其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药,甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。
优选的,可采用基因治疗的手段进行。比如,可直接将FAM170A的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者;或者,可通过一定的途径将携带FAM170A的促进调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上,具体情况需视所述的抑制剂的类型而定,这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明提供了FAM170A在构建预测阿尔茨海默计算模型中的应用,所述模型包括但不限于本发明所述的FAM170A基因,还可以包括与阿尔茨海默相关的多个基因。作为一种可选择的实施方式,本发明可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选的,在数学上组合FAM170A和一种或多种其他标志物的测定水平,并将组合值与实际的诊断问题关联起来,可以通过任何适宜的现有技术生物信息学方法将标志物值与FAM170A的测定组合。
本发明中,术语“样本”以其最广泛的含义使用。意在包括从任何来源获得的标本或培养物,以及生物和环境样本。生物样本可获自动物(包括人)并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液制品,诸如血浆、血清等。然而,此类样本不应解释为限制适用于本发明的样本类型。
本发明的样本例如可以来自哺乳动物,例如,人类、非人灵长类动物、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人动物。在某些实施方案中,所述受试者是人,例如,遭受阿尔茨海默氏病或阿尔茨海默氏病相关的痴呆的人,处于遭受阿尔茨海默氏病或阿尔茨海默氏病相关的痴呆的风险中的人,或者潜在地能够遭受阿尔茨海默氏病或阿尔茨海默氏病相关的痴呆的人。
统计学分析
在本发明的具体实施例中,实验都是按照至少重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与阿尔茨海默病相关的基因标志物
1、样品收集
分别收集45例正常人血液和阿尔茨海默病患者血液样本,所有的患者均已知情同意,上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。选取5例正常人血液和阿尔茨海默患者的血液样本,进行高通量测序,使用全部样本进行验证。
2、RNA样品的制备
利用Invitrogen的血液RNA提取试剂盒提取RNA样品,具体操作详见说明书。
3、RNA样品的质量分析
利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl,OD260/280介于1.8~2.2之间。
4、去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。
5、构建cDNA文库
利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建,具体操作按说明书进行。
6、上机测序
使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序,具体操作按说明书进行。
7、高通量转录组测序数据分析
对测序结果进行生物信息学分析,利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位,通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度,利用cuffdiff检测差异表达,当p值<0.05时,认为基因显著差异表达。
8、结果
RNA-seq结果显示,FAM170A基因在阿尔茨海默病患者血液中的表达量显著高于正常人血液中的水平,提示FAM170A可能作为阿尔茨海默病的生物标志物。
实施例2 QPCR测序验证FAM170A基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择FAM170A基因进行大样本QPCR验证。
2、RNA提取
利用Invitrogen的血液RNA提取试剂盒提取RNA样品,具体操作详见说明书。
3、逆转录:
取总RNA 2μg进行逆转录,加入Oligo(dT)2μl,充分混匀。70℃水浴5分钟后立即冰浴2-3min;继续加入5×逆转录缓冲液5μl,dNTP(2.5mM)5μl,RNasin 40U/μl,M-MLV 200U/μl,补无核酶水至预期体积,42℃水浴60分钟后,95℃水浴5分钟以灭活M-MLV。
4、QPCR扩增
(1)引物设计
根据Genbank中FAM170A基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下:
FAM170A基因:
正向引物为5’-CTTGTCGTCCTATTCATC-3’(SEQ ID NO.1);
反向引物为5’-CAAAGTTTCCTCTGTCTC-3’(SEQ ID NO.2)。
GAPDH基因:
正向引物为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’(SEQ ID NO.3);
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。
(2)配制PCR反应体系:
正向引物和反向引物各1μl,SYBR Green聚合酶链式反应体系体系12.5μl,模板2μl,加入去离子水补足至25μl。
(3)PCR反应条件:
95℃10min,(95℃15s,60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物,在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验采用3次重复实验,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示,与正常人血液相比,FAM170A基因在阿尔茨海默病患者血液中的表达显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05),同高通量测序结果一致。
实施例3 FAM170A基因的沉默
1、细胞培养
多巴胺神经元细胞SH-SY5Y,以含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液中(pH7.2~7.4),在37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。每隔2天换液一次,待细胞生长至90%接触时进行传代,用PBS清洗后加入0.25%-EDTA胰蛋白酶消化使细胞从瓶壁上分离下来,用含胎牛血清的DMEM培养液终止胰酶消化反应,1000g离心2min,弃上清,用新配置的培养液重悬,以1:3~1:4比例传代,24小时后细胞进入对数生长期更换培养液,并根据实验要求给予不同的干预。
2、转染
1)转染前细胞的处理
转染前一天,6孔培养板上种3~5×105个细胞/孔,在无抗生素培养基中培养一天,转染时细胞密度为30~50%,于转染前换成无血清培养基。
2)FAM170A基因siRNA的设计
阴性对照siRNA-NC的序列:
正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5),
反义链:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6);
siRNA1:
正义链:5’-AAUGUUUCCUCUUUUGUCGUC-3’(SEQ ID NO.7),
反义链:5’-CGACAAAAGAGGAAACAUUUG-3’(SEQ ID NO.8);
siRNA2:
正义链:5’-AGUCUUAUAGGAUGAAUAGGA-3’(SEQ ID NO.9),
反义链:5’-CUAUUCAUCCUAUAAGACUUG-3’(SEQ ID NO.10);
siRNA3:
正义链为5’-UCUCAUUUCCAUUUUCCUCCU-3’(SEQ ID NO.11),
反义链为5’-GAGGAAAAUGGAAAUGAGAAG-3’(SEQ ID NO.12)
3)转染
将神经细胞分为3组,分别为对照组(SH-SY5Y)、阴性对照组(转染siRNA-NC)、实验组(转染siRNA1~3)。使用Invitrogen公司的Lipofectamine3000试剂盒进行转染,具体转染方法按照说明书的指示进行。
3、QPCR检测FAM170A基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂,按说明书提供方法提取SH-SY5Y细胞的总RNA。
3.2逆转录步骤同实施例2。
3.3QPCR扩增步骤同实施例2。
4、结果
结果如图2显示,相比对照组与空白对照组,实验组FAM170A基因的表达水平降低,而siRNA1的沉默效果最为显著,因此选择siRNA1进行后续的实验,而siRNA-NC组和对照组之间没有显著的差异。
实施例4 FAM170A基因对神经细胞的影响
采用MTT实验检测FAM170A基因对SH-SY5Y阿尔茨海默病细胞模型细胞存活率的影响。
1、细胞培养转染步骤同实施例3。
2、细胞分组:
SH-SY5Y组:空白对照组,SH-SY5Y细胞正常培养48h后,再加入对照量的PBS,孵育24h后再进行检测分析;
Aβ1-42组:SH-SY5Y细胞正常培养48h后,再加入5μM Aβ1-42(GL Biochem),孵育24h后再进行检测分析;
siRNA1组:SH-SY5Y细胞转染siRNA1 48h后,再加入浓度为5μM Aβ1-42(GLBiochem),孵育24h后再进行检测分析
3、MTT检测
MTT用PBS溶解,终浓度为5mg/ml,将孔内溶液弃掉,加入100μl培养基,再每孔加入5mg/ml MTT 10μl,37℃继续培养4h,再将孔内溶液弃掉,每孔加DMSO100μl,室温摇床孵育10min。酶标仪在490nm波长测吸光度值(OD值),与对照组的吸光度值的百分比即为细胞活性百分比。按如下公式计算:
细胞活性百分比%=实验组OD值/对照组OD值×100%
4、结果
图3所示的结果显示:细胞组的细胞存活率相比Aβ1-42组,具有显著的增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明FAM170A的过表达不利于SH-SY5Y细胞的生长,通过降低FAM170A基因的表达可以保护神经细胞,提示可以将FAM170A基因作为分子靶标应用于阿尔茨海默的靶向治疗。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 阿尔茨海默诊治用标志物FAM170A
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aauguuuccu cuuuugucgu c 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgacaaaaga ggaaacauuu g 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agucuuauag gaugaauagg a 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cuauucaucc uauaagacuu g 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ucucauuucc auuuuccucc u 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggaaaaug gaaaugagaa g 21