CN109593843B - 生物标志物klhl35在阿尔茨海默诊治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生物标志物KLHL35在阿尔茨海默诊治中的应用。本发明首次发现了KLHL35在阿尔茨海默患者的血液中表达上调，且改变KLHL35的表达水平会影响阿尔茨海默模式细胞的存活率，说明KLHL35可作为分子靶标应用于阿尔茨海默的早期诊断和个性化治疗。

Description

生物标志物KLHL35在阿尔茨海默诊治中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及生物标志物KLHL35在阿尔茨海默诊治中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病是一种常见的慢性、进行性中枢神经系统退行性疾病，其临床主要表现为进行性的记忆衰退和认知功能的下降、行为异常和社交障碍，通常病情呈进行性加重，病程缓慢不可逆。随着社会人口的老龄化，阿尔茨海默病的发病率呈上升趋势。据统计数据显示，老年人阿尔茨海默病((Alzheimer's Disease,AD)的患病率仅次于心血管病和癌症居第三位，全世界有近3600万人正在遭受着AD的折磨。目前阿尔茨海默病还是绝症，没有任何治疗方法可以使患者痊愈。阿尔茨海默病给社会和家庭带来沉重的负担，给患者本人也带来精神上和身体上的极大痛苦。
目前阿尔茨海默病的发病机制仍然不清楚。目前有分子遗传和基因学说、炎症学说、自由基学说、胆碱能学说、金属离子假说、病毒学说、氧化应激学说、雌激素水平降低学说等。大多数研究犹如盲人摸象，分不清哪些机制是病因哪些是造成的结果。因此很多研究所和大学机构也投入了相当多的人力物力来研究AD的发病机制，但效果很不理想。
由于神经细胞的复杂，而且取样有限，从基因表达水平筛选出和年龄相关的基因，成为阿尔茨海默病分子发病机理研究的最佳途径。目前，具有诊断AD的生物标志物种类较少，灵敏性及特异性也不理想，仅有少数几种作为辅助诊断方法应用于临床。因此寻找新的生物标志物应用于阿尔茨海默的临床检测和治疗，有助于提高诊断的灵敏性和特异性，以及实现阿尔茨海默的个性化治疗。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种阿尔茨海默临床诊断和治疗的分子靶标。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测KLHL35水平的试剂在制备诊断阿尔茨海默病的产品中的应用。
进一步，所述产品包括：芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。
本发明还提供了一种诊断阿尔茨海默病的产品，所述产品包括检测KLHL35水平的试剂。所述产品包括但不限于芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。
进一步，所述试剂包括：
特异性识别KLHL35基因的探针；或
特异性扩增KLHL35基因的引物；或
特异性结合KLHL35编码的蛋白的抗体或配体。
作为一种优选的实施方式，特异性扩增KLHL35基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明提供了KLHL35在筛选治疗阿尔茨海默的候选药物中的应用。
本发明提供了一种筛选治疗阿尔茨海默的和候选药物的方法，步骤包括：
用待筛选物质处理表达或含有KLHL35基因或其编码的蛋白的培养体系；和
检测所述体系中KLHL35基因或其编码的蛋白的表达或活性；
其中，若待筛选物质可降低KLHL35的表达或活性，则表明该待筛选物质是治疗阿尔茨海默的候选药物。
所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。
本发明提供了KLHL35基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
进一步，所述抑制剂包括降低KLHL35基因或其表达产物稳定性、下调KLHL35基因或其表达产物的表达水平、减少KLHL35基因或其表达产物有效作用时间的物质。
进一步，KLHL35的抑制剂是下调KLHL35基因或其表达产物的表达水平的物质。
进一步，所述抑制剂为siRNA。
本发明提供一种治疗阿尔茨海默的药物组合物，所述药物组合物包括针对KLHL35的抑制剂。
进一步，KLHL35的抑制剂是下调KLHL35基因或其表达产物的表达水平的物质。
进一步，所述抑制剂是针对KLHL35的siRNA。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了KLHL35基因表达与阿尔茨海默病相关，通过检测受试者血液中KLHL35的表达，可以判断受试者是否患有阿尔茨海默病、或者判断受试者是否存在患有阿尔茨海默病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明首次发现了改变KLHL35的表达水平，可以改变神经细胞的增殖，提示KLHL35可作为潜在的分子靶点应用于阿尔茨海默病的治疗。
附图说明
图1是利用QPCR检测KLHL35基因在阿尔茨海默病患者血液中的表达情况图；
图2是利用QPCR检测KLHL35基因沉默情况图；
图3是利用MTT检测KLHL35基因表达对阿尔茨海默神经细胞生长的影响图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序方法，检测阿尔茨海默患者和正常人血液中的基因表达水平，发现其中具有明显差异的基因，探讨其与阿尔茨海默的发生之间的关系，从而为阿尔茨海默的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了阿尔茨海默中KLHL35显著性上调。实验证明，降低KLHL35的表达水平，能够有效地促进神经细胞的增殖，为阿尔茨海默的个性化治疗提供了新途径。
KLHL35基因
KLHL35基因位于11号染色体长臂1区3带上，目前在国际公共核酸数据库GeneBank中的gene ID为283212。在本发明中，KLHL35包括野生型、突变型或其片段。作为非限制性的实施例，一种代表性的KLHL35基因具有NM_001039548.2所示的序列。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
本发明的基因可以使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术、蛋白免疫检测技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。
通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。
本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。
蛋白免疫技术包括(但不限于)夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
根据本发明的免疫法可基于，例如，以下方法中的任一种。
免疫沉淀法是最简单的免疫测定方法；这种方法测量沉淀物的量，在试剂抗体已与样本一起孵育并与其中存在的靶抗原反应以形成不溶性团聚体之后形成所述沉淀。免疫沉淀反应可以是定性的或是定量的。
在颗粒免疫测定中，多种抗体与该颗粒连接，且所述颗粒能够同时结合很多抗原分子。这大大地加速了可见反应的速度。这允许生物标志物的快速且灵敏的检测。
在免疫比浊法(immunonephelometry)中，抗体和生物标志物上的靶抗原的相互作用引起免疫复合物的形成，所述免疫复合物太小而不能沉淀。但是，这些复合物将散射入射光，这可使用比浊计来测量。可在反应的几分钟之内测定抗原(即生物标志物)的浓度。
放射免疫测定(RIA)法使用放射性同位素例如I125来标记抗原或抗体。所使用的同位素发射γ射线，通常在除去非结合的(游离的)放射性标记之后测量所述射线。与其它的免疫测定相比较，RIA的主要优势在于更高的灵敏度、容易的信号检测和确认的、快速的测定。主要的劣势在于由放射物的使用引起的健康和安全风险和与维护许可放射物安全和处理程序相关的时间和费用。出于该原因，在常规临床实验室实践中，RIA已很大程度上被酶免疫测定所取代。
酶免疫测定(EIA)发展为放射免疫测定(RIA)的替代物。这些方法使用酶来标记抗体或靶抗原。EIA的灵敏度接近RIA的灵敏度，且不存在由放射性同位素引起的危险。用于检测的最广泛使用的EIA方法之一是酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA方法可使用两种抗体，其一对于靶抗原是特异性的，而另一与酶偶联，酶底物的添加引起化学发光信号或荧光信号的产生。
荧光免疫测定(FIA)指使用荧光标记或酶标记的免疫测定，所述荧光标记或酶标记作用在底物上以形成荧光产物。荧光测量固有地比比色(分光光度法的)测量更加灵敏。因此，FIA方法具有比利用吸收(光密度)测量的EIA方法更高的分析灵敏度。
化学发光免疫测定使用化学发光标记，当其被化学能激发时产生光；使用光检测器测量发射。
因此，可使用熟知的方法进行根据本发明的免疫法。在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。
在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。
芯片、制剂、核酸膜条、试剂盒
本发明提供了检测中KLHL35基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、制剂、核酸膜条或试剂盒。在本发明中芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于KLHL35所示的部分或全部序列。所述蛋白芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的KLHL35编码的蛋白的特异性抗体或配体。
所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“寡核苷酸探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
本发明中的示例性寡核苷酸探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
本发明的配体可包含能够特异性结合KLHL35的肽、抗体或其片段、或适配体或寡核苷酸。抗体可为能够特异性结合该KLHL35的单克隆抗体、多克隆抗体或其片段。
本发明中所述KLHL35蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述KLHL35蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与KLHL35蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。
在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。其中示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测KLHL35的表达。所述试剂盒包括用于扩增KLHL35的特异性引物对；标准DNA模板；PCR反应液。
在一个优选的实施方案中，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，序列如SEQ ID NO.1～2所示。
作为更优选的实施方案，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并一步包含荧光染料。
在一个更优选的实施方案中，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。
抑制剂和药物组合物
基于发明人的发现，本发明提供了一种KLHL35的抑制剂，所述抑制剂包括降低KLHL35基因或其表达产物稳定性、下调KLHL35基因或其表达产物的表达水平、减少KLHL35基因或其表达产物有效作用时间的物质。例如所述抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。
作为本发明的一种选择方式，所述的KLHL35的抑制剂是一种特异性与KLHL35结合的抗体。所述特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体；本发明不仅包括完整的抗体分子，也包括抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与KLHL35蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体
作为本发明的一种优选方式，所述KLHL35的抑制剂是一种KLHL35特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染相关细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，并进一步地在细胞水平实验，从而证明基因对相关细胞的影响。
本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
作为本发明的一种可选方式，所述的KLHL35的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(ShortHairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。
在本发明中，可将这些抑制剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的KLHL35的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于治疗阿尔茨海默。任何前述的KLHL35的抑制剂均可用于组合物的制备。所述药学上可接受的载体和/或辅料，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。
其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。
本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。
统计学分析
在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与阿尔茨海默病相关的基因标志物
1、样品收集
分别收集45例正常人血液和阿尔茨海默病患者血液样本，所有的患者均已知情同意，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。选取5例正常人血液和阿尔茨海默患者的血液样本，进行高通量测序，使用全部样本进行验证。
2、RNA样品的制备
利用Invitrogen的血液RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。
3、RNA样品的质量分析
利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。
5、构建cDNA文库
利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。
6、上机测序
使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。
7、高通量转录组测序数据分析
对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.05时，认为基因显著差异表达。
8、结果
RNA-seq结果显示，KLHL35基因在阿尔茨海默病患者血液中的表达量显著高于正常人血液中的水平，提示KLHL35可能作为阿尔茨海默病的生物标志物应用于疾病的诊断。
实施例2 QPCR测序验证KLHL35基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择KLHL35基因进行大样本QPCR验证。
2、RNA提取
利用Invitrogen的血液RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。
3、逆转录：
取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀。70℃水浴5分钟后立即冰浴2-3min；继续加入5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin 40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酶水至预期体积，42℃水浴60分钟后，95℃水浴5分钟以灭活M-MLV。
4、QPCR扩增
(1)引物设计
根据Genbank中KLHL35基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
KLHL35基因：
正向引物为5’-CTACACTCGCTCAGAATT-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物为5’-CTAAACATCCACACATCAT-3’(SEQ ID NO.2)。
GAPDH基因：
正向引物为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。
(2)配制PCR反应体系：
正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green聚合酶链式反应体系体系12.5μl，模板2μl，加入去离子水补足至25μl。
(3)PCR反应条件：
95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与正常人血液相比，KLHL35基因在阿尔茨海默病患者血液中的表达显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例3 KLHL35基因的沉默
1、细胞培养
多巴胺神经元细胞SH-SY5Y，以含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的DMEM培养液中(pH7.2～7.4)，在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。每隔2天换液一次，待细胞生长至90％接触时进行传代，用PBS清洗后加入0.25％-EDTA胰蛋白酶消化使细胞从瓶壁上分离下来，用含胎牛血清的DMEM培养液终止胰酶消化反应，1000g离心2min，弃上清，用新配置的培养液重悬，以1:3～1:4比例传代，24小时后细胞进入对数生长期更换培养液，并根据实验要求给予不同的干预。
2、转染
1)转染前细胞的处理
转染前一天，6孔培养板上种3～5×105个细胞/孔，在无抗生素培养基中培养一天，转染时细胞密度为30～50％，于转染前换成无血清培养基。
2)KLHL35基因siRNA的设计
阴性对照siRNA-NC的序列：
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，
反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；
siRNA1：
正义链：5’-UAAACAUCCACACAUCAUGAC-3’(SEQ ID NO.7)，
反义链：5’-CAUGAUGUGUGGAUGUUUAGC-3’(SEQ ID NO.8)；
siRNA2：
正义链：5’-AAGAAAAGGGACCAUUAAGUU-3’(SEQ ID NO.9)，
反义链：5’-CUUAAUGGUCCCUUUUCUUGU-3’(SEQ ID NO.10)；
siRNA3：
正义链为5’-AAGAUUUUAUUUAUACAAGAA-3’(SEQ ID NO.11)，
反义链为5’-CUUGUAUAAAUAAAAUCUUGU-3’(SEQ ID NO.12)
3)转染
将神经细胞分为3组，分别为对照组(SH-SY5Y)、阴性对照组(转染siRNA-NC)、实验组(转染siRNA1～3)。使用Invitrogen公司的Lipofectamine 3000试剂盒进行转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。
3、QPCR检测KLHL35基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取SH-SY5Y细胞的总RNA。
3.2逆转录 步骤同实施例2。
3.3 QPCR扩增 步骤同实施例2。
4、结果
结果如图2显示，相比对照组与空白对照组，实验组KLHL35基因的表达水平降低，而siRNA1的沉默效果最为显著，因此选择siRNA1进行后续的实验，而siRNA-NC组和对照组之间没有显著的差异。
实施例4 KLHL35基因对神经细胞的影响
采用MTT实验检测KLHL35基因对SH-SY5Y阿尔茨海默病细胞模型细胞存活率的影响。
1、细胞培养转染 步骤同实施例3。
2、细胞分组：
SH-SY5Y组：SH-SY5Y细胞正常培养48h后，再加入对照量的PBS，孵育24h后再进行检测分析；
Aβ1-42组：SH-SY5Y细胞正常培养48h后，再加入5μM Aβ1-42(GL Biochem)，孵育24h后再进行检测分析；
siRNA1组：SH-SY5Y细胞转染siRNA1 48h后，再加入浓度为5μM Aβ1-42(GLBiochem)，孵育24h后再进行检测分析
3、MTT检测
MTT用PBS溶解，终浓度为5mg/ml，将孔内溶液弃掉，加入100μl培养基，再每孔加入5mg/ml MTT 10μl，37℃继续培养4h，再将孔内溶液弃掉，每孔加DMSO100μl，室温摇床孵育10min。酶标仪在490nm波长测吸光度值(OD值)，与对照组的吸光度值的百分比即为细胞活性百分比。按如下公式计算：
细胞活性百分比％＝实验组OD值/对照组OD值×100％
4、结果
图3所示的结果显示：siRNA1组的细胞存活率相比Aβ1-42组，具有显著的增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明KLHL35的过表达不利于SH-SY5Y细胞的生长，通过降低KLHL35基因的表达水平可以保护神经细胞。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 生物标志物KLHL35在阿尔茨海默诊治中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctacactcgc tcagaatt 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaaacatcc acacatcat 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aactctggta aagtggatat tg 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggaatca tattggaaca 20
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uaaacaucca cacaucauga c 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caugaugugu ggauguuuag c 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagaaaaggg accauuaagu u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cuuaaugguc ccuuuucuug u 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagauuuuau uuauacaaga a 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cuuguauaaa uaaaaucuug u 21

Claims (9)

1.检测KLHL35基因mRNA水平的试剂在制备诊断阿尔茨海默病的产品中的应用，所述KLHL35基因的gene ID为283212。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：
特异性识别KLHL35基因的探针；或
特异性扩增KLHL35基因的引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增KLHL35基因的引物序列如SEQID NO.1~2所示。
5.KLHL35基因在筛选治疗阿尔茨海默的候选药物中的应用，所述KLHL35基因的geneID为283212，所述应用是通过检测KLHL35基因mRNA水平来实现。
6.一种筛选治疗阿尔茨海默的候选药物的方法，其特征在于，步骤包括：
用待筛选物质处理表达或含有KLHL35基因mRNA的体系；和
检测所述体系中KLHL35基因mRNA水平；
所述KLHL35基因的gene ID为283212；
其中，若待筛选物质可降低KLHL35基因mRNA水平，则表明该待筛选物质是治疗阿尔茨海默的候选药物。
7.KLHL35基因mRNA的抑制剂在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用，所述KLHL35基因的gene ID为283212。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括降低KLHL35基因mRNA稳定性、下调KLHL35基因mRNA水平、减少KLHL35基因mRNA有效作用时间的物质。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是siRNA。
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