CN108624674B

CN108624674B - Krt73作为分子靶标在帕金森诊治中的应用

Info

Publication number: CN108624674B
Application number: CN201810292496.2A
Authority: CN
Inventors: 汪冰怡; 肖枫
Original assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2038-03-30
Also published as: CN108624674A

Abstract

本发明公开了KRT73作为分子靶标在帕金森诊治中的应用。本发明经QPCR实验证明KRT73在帕金森患者的血液中表达下调，提示KRT73可以作为检测指标应用于帕金森的临床诊断。本发明通过MTT实验证明改变KRT73的表达水平，可以影响帕金森模式细胞存活率，提示KRT73可以作为药物靶标应用于帕金森的治疗。

Description

KRT73作为分子靶标在帕金森诊治中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及KRT73作为分子靶标在帕金森诊治中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是神经科常见的一种退行性疾病，据统计，帕金森病在发达国家的患病率约为0.3，在60岁以上人群中患病率达1％。PD的主要病理表现为黑质内多巴胺能神经元的丢失和路易小体的形成(Dauer,W.and S.Przedborski,Parkinson's disease:mechanisms and models.Neuron,2003.39(6))。PD的主要临床表现分为运动症状和非运动症状两部分，运动症状包括静止性震颤、运动迟缓、姿势步态异常等，非运动性症状包括嗅觉障碍、抑郁、睡眠障碍、自主神经功能障碍等(Garcia-Ruiz,P.J.,K.R.Chaudhuri,and P.Martinez-Martin,Non-motor symptoms of Parkinson'sdisease A review..from the past.J Neurol Sci,2014.338(1-2))。到目前为止已经有多种用于治疗帕金森病的药物，如左旋多巴制剂、多巴胺受体激动剂、抗胆碱能药物、单胺氧化酶抑制剂、儿茶酚胺氧位甲基转移酶等。但是这些药物只能部分缓解疾病症状，并不能完全根治疾病，随着疾病进展，药物的治疗效果持续变差，并且会出现多种药物相关的不良反应，导致患者的生活质量严重下降，功能明显受损，给患者本人、家庭及社会带来沉重的经济负担。

帕金森的发病机制目前仍不完全清楚，其可能是遗传、环境、氧经应激、免疫等多种因素共同作用的结果，最终导致黑质区多巴胺能神经元变性坏死。对发病机制的深入研究，更有利于指导临床的对症及对因治疗。研究表明，基因在帕金森的发生发展过程中起着重要的作用(CN 201510463617.1、CN 2015107135273)。研究帕金森患者基因表达谱的变化，寻找与帕金森发生发展相关的基因，成为研究帕金森的发病机制以及是实现个性化临床诊疗的热点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种帕金森临床诊断和治疗的分子靶标。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测KRT73水平的试剂在制备诊断帕金森病的产品中的应用。

进一步，所述产品包括：芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。

本发明还提供了一种诊断帕金森病的产品，包括检测KRT73水平的试剂。所述产品包括但不限于芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。

进一步，所述试剂包括：

特异性识别KRT73基因的探针；或

特异性扩增KRT73基因的引物；或

特异性结合KRT73编码的蛋白的抗体或配体。

作为一种优选的实施方式，特异性扩增KRT73基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明提供了KRT73在筛选治疗帕金森的潜在药物中的应用。

本发明提供了一种筛选治疗帕金森的潜在药物的方法，步骤包括：

用待筛选物质处理表达或含有KRT73基因或其编码的蛋白的培养体系；和

检测所述体系中KRT73基因或其编码的蛋白的表达或活性；

其中，若待筛选物质可增加KRT73的表达或活性，则表明该待筛选物质是治疗帕金森的潜在药物。

所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

本发明提供了KRT73基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗帕金森病药物中的应用。

进一步，所述促进剂包括提高KRT73基因或其表达产物稳定性、上调KRT73基因或其表达产物的表达水平、增加KRT73基因或其表达产物有效作用时间的物质。

进一步，KRT73的促进剂是包含KRT73的表达载体。

本发明提供一种治疗帕金森的药物组合物，所述药物组合物包括针对KRT73的促进剂。

进一步，KRT73的促进剂是包含KRT73的表达载体。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了KRT73基因表达与帕金森病相关，通过检测受试者血液中KRT73的表达，可以判断受试者是否患有帕金森病、或者判断受试者是否存在患有帕金森病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

附图说明

图1显示利用QPCR检测KRT73基因在帕金森病患者血液中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测siRNA对KRT73基因表达的影响；

图3显示利用MTT检测KRT73基因表达对帕金森神经细胞生长的影响。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，采检测帕金森患者和正常人血液中的基因表达水平，发现其中具有明显差异的基因，探讨其与帕金森的发生之间的关系，从而为帕金森的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了帕金森中KRT73显著性下调。实验证明，促进KRT73的表达水平，能够有效地促进神经细胞的增殖，为帕金森的个性化治疗提供了新途径。

KRT73基因

KRT73基因位于12号染色体长臂1区3带上，本发明中的KRT73包括野生型、突变型或其片段。本发明的KRT73具有如目前国际公共核酸数据库GeneBank中KRT73基因(NM_175068.2)所示的序列。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的基因可以使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术、蛋白免疫检测技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

蛋白免疫技术包括(但不限于)夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。

芯片、制剂、核酸膜条、试剂盒

本发明提供了检测中KRT73基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片芯片、制剂、核酸膜条或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于KRT73所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

在本发明中，术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体。所述KRT73蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与KRT73蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测KRT73的表达。所述试剂盒包括用于扩增KRT73的特异性引物对；标准DNA模板；PCR反应液。

在一个优选的实施方案中，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，序列如SEQ ID NO.1～2所示。

作为更优选的实施方案，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。

在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并一步包含荧光染料。

在一个更优选的实施方案中，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶及buffer缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。

促进剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种KRT73的促进剂，所述促进剂包括提高KRT73基因或其表达产物稳定性、上调KRT73基因或其表达产物的表达水平、增加KRT73基因或其表达产物有效作用时间的物质。

通常，可将这些促进剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

作为本发明的一种优选方式，所述的KRT73的促进剂是一种KRT73的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

在本发明中，“宿主细胞”胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的KRT73的促进剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于治疗帕金森。任何前述的KRT73的促进剂均可用于组合物的制备。所述药学上可接受的载体和/或辅料，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

其中，稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与帕金森病相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例正常人血液和帕金森病患者血液样本，写明样本名称、编号、取样日期、样本处理过程等情况，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用Invitrogen的血液RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。

3、RNA样品的质量分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5ug，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。

5、构建cDNA文库

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

6、上机测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

7、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，利用TopHat v1.3.1进行RNA-seq读段定位，通过Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度，利用cuffdiff检测差异表达，当p值<0.05时，认为基因显著差异表达。

8、结果

RNA-seq结果显示，KRT73基因在帕金森病患者血液中的表达量显著低于正常人血液中的水平。

实施例2QPCR测序验证KRT73基因的差异表达

1、根据高通量测序的检测结果选择KRT73基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择帕金森患者血液和正常人血液各90例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀。70℃水浴5分钟后立即冰浴2-3min；继续加入5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin 40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酶水至预期体积，42℃水浴60分钟后，95℃水浴5分钟以灭活M-MLV。

4、QPCR扩增

(1)引物设计

根据Genbank中KRT73基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

KRT73基因：

正向引物为5’-AAGAAGAGGTATGAAGAA-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-CACTTGAAGAACTTGATT-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。

(2)配制PCR反应体系：正向引物和反向引物各1μl，SYBR Green聚合酶链式反应体系体系12.5μl，模板2μl，加入去离子水补足至25μl。

(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与正常人血液相比，KRT73基因在帕金森病患者血液中的表达显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3KRT73基因的过表达

1、细胞培养

多巴胺神经元细胞SH-SY5Y，以含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的DMEM培养液中(pH7.2～7.4)，在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。每隔2天换液一次，待细胞生长至90％接触时进行传代，用PBS清洗后加入0.25％-EDTA胰蛋白酶消化使细胞从瓶壁上分离下来，用含胎牛血清的DMEM培养液终止胰酶消化反应，1000g离心2min，弃上清，用新配置的培养液重悬，以1:3～1:4比例传代，24小时后细胞进入对数生长期更换培养液，并根据实验要求给予不同的干预。

2、转染

1)转染前细胞的处理

转染前一天，6孔培养板上种3～5×10⁵个细胞/孔，在无抗生素培养基中培养一天，转染时细胞密度为30～50％，于转染前换成无血清培养基。

2)基因过表达载体的构建

根据GeneBank中KRT73的序列合成特异的PCR扩增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGAAGCTTGCCACCATGAGCCGCCAATCA-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-CGGCTCGAG TCTCATGGTTTTTTTGGTGGG-3’(SEQ ID NO.6)

在5’端引物和3’端引物分别添加HindIII和XhoI两个限制性酶切位点。以帕金森患者提取和反转录得到的cDNA作为扩增模板，上述cDNA序列经限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切后插入到经HindIII和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-1用于后续实验。

3)转染

将神经细胞分为3组，分别为对照组(SH-SY5Y)、空白对照组(转染pcDNA3.1-NC)、实验组(转染pcDNA3.1-1)。使用脂质体3000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-1的转染浓度均为0.5μg/ml。

3、QPCR检测KRT73基因的转录水平

3.1细胞总RNA的提取

采用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取SH-SY5Y细胞的总RNA。

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰KRT73基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2显示，相比对照组，实验组KRT73基因的表达水平显著增加，而转染空载组和空白对照组之间没有显著的差异。

实施例4KRT73基因对神经细胞的影响

采用MTT实验检测KRT73基因对SH-SY5Y帕金森病细胞模型细胞存活率的影响。

1、细胞培养转染步骤同实施例3。

2、细胞分组：

SH-SY5Y组：空白对照组，SH-SY5Y细胞正常培养72h后，再加入对照量的PBS，孵育24h后再进行检测分析

MPP⁺组：SH-SY5Y细胞正常培养72h后，再加入浓度为1000μmol/LMPP⁺的完全培养基，孵育24h后再进行检测分析

pcDNA3.1-1组：SH-SY5Y细胞转染pcDNA3.1-1 48h后，再加入浓度为1000μmol/LMPP⁺的完全培养基，孵育24h后再进行检测分析

3、MTT检测

MTT用PBS溶解，终浓度为5mg/ml，将孔内溶液弃掉，加入100μl培养基，再每孔加入5mg/ml MTT 10μl，37℃继续培养4h，再将孔内溶液弃掉，每孔加DMSO100μl，室温摇床孵育10min。酶标仪在490nm波长测吸光度值(OD值)，与对照组的吸光度值的百分比即为细胞活性百分比。按如下公式计算：

细胞活性百分比％＝实验组OD值/对照组OD值×100％

4、统计学方法

实验采用3次重复实验，使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

图3所示的结果显示：pcDNA3.1-1组的细胞存活率相比MPP⁺组，具有显著的增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明KRT73的低表达不利于SH-SY5Y细胞的生长，通过促进KRT73基因的表达可以保护神经细胞。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> KRT73作为分子靶标在帕金森诊治中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagaagaggt atgaagaa 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacttgaaga acttgatt 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aactctggta aagtggatat tg 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgaagcttg ccaccatgag ccgccaatca 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggctcgagt ctcatggttt ttttggtggg 30

Claims

1.检测KRT73基因转录水平的试剂在制备诊断帕金森病的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：

特异性识别KRT73基因的探针；或

特异性扩增KRT73基因的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增KRT73基因的引物序列如SEQID NO.1~2所示。

5.KRT73在筛选治疗帕金森的潜在药物中的应用。

6.一种筛选治疗帕金森的潜在药物的方法，其特征在于，步骤包括：

用待筛选物质处理表达或含有KRT73基因的体系；和

检测所述体系中KRT73基因的转录水平；

其中，若待筛选物质可增加KRT73的转录水平，则表明该待筛选物质是治疗帕金森的潜在药物。

7.KRT73基因转录水平的促进剂在制备治疗帕金森病药物中的应用，其特征在于，所述促进剂上调KRT73基因的转录水平。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进剂是包含KRT73的表达载体。