CN108841964B - Loc105370108在直肠腺癌诊治中的应用 - Google Patents

Loc105370108在直肠腺癌诊治中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108841964B
CN108841964B CN201810896979.3A CN201810896979A CN108841964B CN 108841964 B CN108841964 B CN 108841964B CN 201810896979 A CN201810896979 A CN 201810896979A CN 108841964 B CN108841964 B CN 108841964B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rectal adenocarcinoma
rna
gene
treatment
sirna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810896979.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108841964A (zh
Inventor
朱雄文
王冬国
袁世超
吴贵阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Taizhou Municipal Hospital
Original Assignee
王冬国
朱雄文
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 王冬国, 朱雄文 filed Critical 王冬国
Priority to CN201810896979.3A priority Critical patent/CN108841964B/zh
Publication of CN108841964A publication Critical patent/CN108841964A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108841964B publication Critical patent/CN108841964B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了LOC105370108在直肠腺癌诊治中的应用，本发明首次发现了LOC105370108在直肠腺癌患者中表达上调，通过降低LOC105370108的表达水平可以影响细胞的增殖，提示LOC105370108可作为分子标志物应用于直肠腺癌的诊断和治疗。

Description

LOC105370108在直肠腺癌诊治中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及LOC105370108在直肠腺癌诊治中的应用。
背景技术
直肠癌是指由于基因、饮食和环境等多种致病因素的综合作用下，直肠粘膜的上皮组织转化而成的恶性肿瘤，其发病率及死亡率分别位于全球恶性肿瘤的第三和第四位。在发达国家，其发病率更是位居恶性肿瘤的第二位。当结直肠癌病变局限于肠壁时，通过外科手术切除病灶，约70％-80％的病人能够治愈，其5年生存率约为90％；但淋巴结转移的患者5年生存率则锐减到60％。目前直肠癌的早期诊断依旧困难，相当一部分患者就诊时就已经有转移了，所以直肠癌的早期诊断及治疗具有非常重要的临床意义。
肿瘤的形成和进展是一个相当复杂的过程，涉及多个作用因素，基因突变和异常表达对肿瘤的形成和进展发挥市要调节功能。由于对结直肠癌形成有关癌基因、抑癌基因及作用机制等研究的进展，人们越来越意识到非编码RNA，DNA的甲基化作用、组蛋白修饰以及染色质位置和结构变化对结直肠癌的形成及进展发挥非常重要的作用，长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是长度为200-100000碱基对的非编码RNA分子，在早期研究中，lncRNAs一直被科学家认为是一些没有意义的转录片段而被忽视。但是随着高通量基因测序技术的出现，lncRNAs的研究逐渐深入，通过对一些具有特异性表达水平的lncRNAs进行具体研究和分析，发现lncRNAs在基因的调节方面发挥重要作用。
lncRNAs与肿瘤的发生发展具有重要关系，目前研究逐渐认识到lncRNAs可能成为肿瘤诊断和治疗的重要标志物和靶点。在诊断方面，由于肿瘤组织中的lncRNAs表达往往异常，且具有组织和种属特异性，使其可能成为肿瘤标志物，尤其是在一些肿瘤的早期，由于其体积小，传统的影像学方法不易发现。通过检测lncRNAs能够便捷的了解病人罹患某种肿瘤的可能性。在治疗方面，1ncRNAs在肿瘤中发病机制中的研究为新的肿瘤治疗靶点的选择及研发新的高效、精准、低毒副作用的抗癌新药提供了思路。目前lncRNAs的研究还处于初级阶段，对lncRNAs作用机制和功能的研究还在探索之中，寻找与肿瘤相关的lncRNA具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与直肠腺癌发生发展相关的lncRNA，从而为直肠腺癌的诊断和治疗提供分子靶标，实现患者的个性化诊疗，同时本发明提供一种筛选治疗直肠腺癌的药物的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测LOC105370108表达水平的试剂在制备诊断直肠腺癌的产品中的应用，其中所述产品包括(但不限于)通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中LOC105370108基因的表达水平的试剂。
进一步，所述试剂选自：
特异性识别LOC105370108的探针；或
特异性扩增LOC105370108的引物。
本发明提供了一种诊断直肠腺癌的产品，包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条，所述产品包括检测样本中LOC105370108水平的试剂。
进一步，所述试剂包括：
特异性识别LOC105370108的探针；或
特异性扩增LOC105370108的引物。
进一步，特异性扩增LOC105370108基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括有效量的LOC105370108的抑制剂，和/或药学上可接受的载体。所述抑制剂选自：以LOC105370108或其转录本为靶序列、且能够抑制LOC105370108基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步，所述抑制剂为siRNA，优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.7～12所示，更为优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。
本发明的药物还可与其他治疗直肠腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
本发明提供了上述所述的药物组合物在制备治疗直肠腺癌的产品中的应用。
本发明提供了LOC105370108在筛选治疗直肠腺癌的药物中的应用。
本发明提供了一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有LOC105370108基因的体系；和
检测所述体系中LOC105370108基因的表达；
其中，若所述待筛选的物质可以抑制LOC105370108基因的表达水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是治疗直肠腺癌的候选药物。所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。
所述候选药物包括(但不限于)：针对LOC105370108基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。
附图说明
图1是利用QPCR检测LOC105370108基因在直肠腺癌组织中的表达情况图；
图2是检测siRNA对LOC105370108的沉默效果图；
图3是CCK8法检测LOC105370108对直肠腺癌细胞增殖的影响图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，拟通过高通量测序和生物信息学分析的方法，筛选与直肠腺癌相关的差异表达的lncRNA，寻找特异敏感的生物标志物，并为后续的功能学及作用机制研究提供线索，为直肠腺癌的预防、临床早期诊断和治疗提供理论依据和临床手段。
LOC105370108
长链非编码RNA是长度大于200核苷酸的非编码RNA，参与众多生命过程的调节。在本发明中，转录LOC105370108的基因是位于人13号染色短臂1区2带上，本发明中的LOC105370108包括野生型、突变型或其片段。在本发明的实施例中，一种代表性的转录LOC105370108基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LOC105370108基因(XR_001749777.1)所示。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。这些手段包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。
芯片、制剂、核酸膜条、试剂盒
本发明提供了检测中LOC105370108基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、制剂、核酸膜条或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LOC105370108所示的部分或全部序列，所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LOC105370108的表达。所述试剂盒包括用于扩增LOC105370108的特异性引物对；标准DNA模板；PCR反应液。在一个优选的实施方案中，所述特异性引物对包括上游引物和下游引物，序列如SEQ ID NO.1～2所示。
作为更优选的实施方案，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
在一个更优选的实施方案中，所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液，并一步包含荧光染料。
在一个更优选的实施方案中，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green II，Taq酶为热启动酶。
抑制剂和药物组合物
基于本发明的发现，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含LOC105370108的抑制剂。
所述的LOC105370108的抑制剂是指任何可降低LOC105370108表达水平的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调LOC105370108基因的表达有用的物质，从而可用于治疗直肠腺癌。举例来说，本发明的抑制剂可以是以LOC105370108基因为靶序列、且能够抑制LOC105370108基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
作为本发明的一种优选方式，所述LOC105370108的抑制剂是一种LOC105370108特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染直肠腺癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中LOC105370108的表达水平，并通过降低LOC105370108的表达水平起到抑制直肠腺癌细胞增殖的作用。
作为本发明的一种可选方式，所述的LOC105370108的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
在本发明中，表达载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。
在本发明中，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的LOC105370108基因的抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
在本发明中，将通过本发明的筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、羊、猪、牛、猴子、狒狒、黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成各种剂型。例如，根据需要，所述药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊口服施用；或者用水或任何其它药物可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将化合物以一般接受的药物施用方式所需的单位剂型(unitdose)、与药学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质包括但不限于无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、媒介物(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。根据这些制剂中有效成分的含量，可以获得在指定范围内的合适的给药量。
统计学分析
在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1筛选与直肠腺癌相关的基因标志物
1、样品收集
分别收集3例直肠腺癌癌旁正常上皮组织和直肠腺癌组织样本，全部病例在手术前均未接收化疗和放疗，无其他肿瘤性疾病、自身免疫疾病和严重的慢性疾病，癌旁正常上皮组织取自距肿瘤上缘5cm处，所有的患者均已知情同意，并通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，具体操作按说明书进行。
3、总RNA定量与纯度分析
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、构建cDNA文库
1)去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA；
2)片段化RNA
对完整的RNA序列，利用金属离子进行随机打断，将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
3)反转合成cDNA
利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作详见说明书。
5、测序
使用Illumina X-Ten测序平台进行2*150bp测序。
6、高通量转录组测序数据分析
1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；
3)cuffquant定量mRNA的表达量并标准化输出；cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；
4)cuffdiff比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异，差异表达lncRNA的筛选标准：p value<0.05，|log2FC|>1。
7、结果
结果显示，LOC105370108在直肠腺癌患者中呈现差异性表达，与癌旁正常上皮组织相比，其在癌组织中的表达水平显著性上调。
实施例2 QPCR测序验证LOC105370108基因的差异表达
1、对LOC105370108基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择直肠腺癌癌旁正常组织和直肠腺癌组织各45例。
2、RNA提取
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。
3、QPCR
1)逆转录反应
采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录。
a.去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH2O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min。
b.将10×Fast RT Bμffer 2.0μl，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH2O 5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl。
c.将混合后液体在水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。
2)引物设计
根据Genebank中LOC105370108基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：
LOC105370108基因：
正向引物为5’-CCTGGTATGACTAACTTC-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物为5’-GGTGTGAGAATCTGTATT-3’(SEQ ID NO.2)。
GAPDH基因：
正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。
3)QPCR扩增检验
用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
a.构建反应体系：
2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl，5×ROXReferenceDye△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。
每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
b.反应条件：
95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。
4)cDNA模板浓度的筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。
根据溶解曲线，当cDNA进行10倍稀释时，PCR的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好，因此选择cDNA 10倍稀释进行后续的实验。
5)样品RealTime PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2-ΔΔCT法进行相对定量。
4、结果
QPCR结果如图1所示，与直肠腺癌癌旁正常上皮组织相比，LOC105370108在直肠腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；阳性检出率＝上调表达例数/总检测例数×100％＝41/45＝91.1％，提示LOC105370108应用于直肠腺癌的诊断具有较高的准确率。
实施例3 LOC105370108基因的沉默
1、细胞培养
人直肠腺癌细胞株HRC-99，以含10％小牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用含EDTA的0.25％胰蛋白酶常规消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。
2、siRNA的设计
针对LOC105370108基因的序列设计siRNA，设计的siRNA序列如下所示：
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，
反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；
siRNA1：
正义链：5’-AACCAAAUAAAUGAUGUAGCA-3’(SEQ ID NO.7)，
反义链：5’-CUACAUCAUUUAUUUGGUUGC-3’(SEQ ID NO.8)；
siRNA2：
正义链：5’-AGCUAAUGGGUAAAAGGUGAA-3’(SEQ ID NO.9)，
反义链：5’-CACCUUUUACCCAUUAGCUAA-3’(SEQ ID NO.10)；
siRNA3：
正义链为5’-AUAGUCAACAGGAAAGUCGAA-3’(SEQ ID NO.11)，
反义链为5’-CGACUUUCCUGUUGACUAUAA-3’(SEQ ID NO.12)
siRNA4：
正义链为5’-AACUUAGAUUUUUCAACUCUU-3’(SEQ ID NO.13)，
反义链为5’-GAGUUGAAAAAUCUAAGUUGA-3’(SEQ ID NO.14)
3、转染
将细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的RPMI1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。
实验分为空白对照组(HRC-99)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，其中阴性对照组siRNA与LOC105370108基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。
4、QPCR检测LOC105370108基因的转录水平
1)细胞总RNA的提取
使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，具体步骤详见说明书。
2)逆转录 步骤同实施例2。
3)QPCR扩增步骤同实施例2。
5、结果
结果如图2显示，与HRC-99和转染空载siRNA-NC组相比，实验组(siRNA1～4)能降低LOC105370108的水平，其中siRNA1的效果最为显著，因此选择siRNA1进行后续实验，以证明LOC105370108表达水平的降低可以影响癌细胞的增殖。
实施例4 LOC105370108对直肠腺癌细胞增殖的影响
1、直肠腺癌细胞HRC-99接种于6孔板中培养，待细胞密度达到85％-90％，使用脂质体2000转染siRNA1。无血清培养基培养4-6h后更换新培养基。
2、转染siRNA1后培养24h，将干扰组细胞和对照组细胞消化，在96孔板中接种转染后的HRC-99细胞悬液以及各对照组(100μl/孔)，接种密度为5×104/L。将培养板放在培养箱中预培养(37℃，5％CO2)。
3、向每孔加入10μl CCK8溶液。
4、将培养板放在培养箱内培养1-4h。
5、使用酶标仪测定在490nm处的吸光度。
6、结果
结果如图3所示，与对照组相比，随着细胞生长时间的延长，siRNA1转染组细胞增殖减缓，差异具有显著统计学意义(P<0.05)，因此，LOC105370108可以增强直肠腺癌细胞的增殖，提示LOC105370108可以作为潜在的靶点应用于直肠腺癌的治疗。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 王冬国 朱雄文
<120> LOC105370108在直肠腺癌诊治中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctggtatga ctaacttc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgtgagaa tctgtatt 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagccccagc cttctccat 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaccaaauaa augauguagc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cuacaucauu uauuugguug c 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcuaauggg uaaaagguga a 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caccuuuuac ccauuagcua a 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
auagucaaca ggaaagucga a 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgacuuuccu guugacuaua a 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aacuuagauu uuucaacucu u 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaguugaaaa aucuaaguug a 21

Claims (10)

1.检测LOC105370108表达水平的试剂在制备诊断直肠腺癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：
特异性识别LOC105370108的探针；或
特异性扩增LOC105370108的引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，特异性扩增LOC105370108的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。
5.药物组合物在制备治疗直肠腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括有效量的LOC105370108的抑制剂，和/或药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为siRNA。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，siRNA的序列如SEQ ID NO.7~12所示。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，siRNA的序列如SEQ ID NO.7~8所示。
9.LOC105370108在筛选治疗直肠腺癌的药物中的应用。
10.一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有LOC105370108 的体系；和
检测所述体系中LOC105370108 的表达；
其中，若所述待筛选的物质可以抑制LOC105370108的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗直肠腺癌的候选药物。
CN201810896979.3A 2018-08-08 2018-08-08 Loc105370108在直肠腺癌诊治中的应用 Active CN108841964B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810896979.3A CN108841964B (zh) 2018-08-08 2018-08-08 Loc105370108在直肠腺癌诊治中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810896979.3A CN108841964B (zh) 2018-08-08 2018-08-08 Loc105370108在直肠腺癌诊治中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108841964A CN108841964A (zh) 2018-11-20
CN108841964B true CN108841964B (zh) 2021-07-02

Family

ID=64192848

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810896979.3A Active CN108841964B (zh) 2018-08-08 2018-08-08 Loc105370108在直肠腺癌诊治中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108841964B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104877998A (zh) * 2015-05-13 2015-09-02 中国人民解放军总医院 长链非编码rna以及检测细胞及组织中该长链非编码rna表达水平的引物对及试剂盒
CN107043823A (zh) * 2017-05-26 2017-08-15 郴州市第人民医院 一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104877998A (zh) * 2015-05-13 2015-09-02 中国人民解放军总医院 长链非编码rna以及检测细胞及组织中该长链非编码rna表达水平的引物对及试剂盒
CN107043823A (zh) * 2017-05-26 2017-08-15 郴州市第人民医院 一种结直肠癌相关的肿瘤标志物及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XR_001749777.1;Anonymous;《GenBank》;20180326;第1-3页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108841964A (zh) 2018-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106995858B (zh) 一种与肝癌诊疗相关的lncRNA
US20180051340A1 (en) Methods and uses for diagnosis and treatment of prostate cancer
CN108753969B (zh) 长链非编码rna在肝细胞癌诊疗中的应用
CN108531596B (zh) 一种lncRNA作为生物标志物在胃癌诊治中的应用
CN107586850B (zh) 非编码基因在肝癌诊疗中的应用
CN111455059A (zh) 检测及靶向生物标志物的试剂在口腔鳞癌中的应用
US11013754B2 (en) Compositions and methods for treating cancer
US10030269B2 (en) Biomarkers, methods, and compositions for inhibiting a multi-cancer mesenchymal transition mechanism
CN108220446B (zh) Linc01356作为分子标志物在胃癌中的应用
CN108251528B (zh) Linc01814在胃癌诊治中的应用
CN107267616B (zh) 一种非编码基因生物标记物在肝癌中的应用
CN108707672B (zh) Duxap8在肝细胞癌诊断和治疗中的应用
CN111455061A (zh) lncRNA生物标志物在口腔鳞癌诊疗中的应用
CN111440874A (zh) 口腔鳞癌诊断和治疗用生物标志物
CN108660211B (zh) 一种与肝细胞癌相关的生物标志物linc01549及其应用
CN111455060A (zh) 诊断和治疗口腔鳞癌的相关生物标志物及应用
CN108192977B (zh) 一种与胃癌发生发展相关的分子标志物
CN107227362B (zh) 一种与肝癌相关的基因及其应用
CN106868183B (zh) Wfdc21p在肝癌诊治中的应用
CN108841964B (zh) Loc105370108在直肠腺癌诊治中的应用
CN109371136B (zh) 一种与肺腺癌相关的lncRNA及其应用
CN110055333B (zh) Rp11-116o18.1作为分子标志物在肺癌中的应用
CN108624689B (zh) 生物标志物linc01451的应用
CN112501304A (zh) miRNA-424作为脑垂体瘤诊断标志物的应用
CN108950001B (zh) 一种与直肠腺癌发生发展相关的分子标志物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211210

Address after: No. 381 East Zhongshan Road, Jiaojiang District, Zhejiang, Taizhou

Patentee after: TAIZHOU MUNICIPAL Hospital

Address before: 318000 Haimen street, Huijing Mingyuan 36-2-202, Jiaojiang District, Taizhou City, Zhejiang Province

Patentee before: Wang Dongguo

Patentee before: Zhu Xiongwen