生物标志物LINC01451的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及生物标志物LINC01451的应用,具体涉及LINC01451在肝细胞癌中的应用。
背景技术
原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,特别是在亚洲、非洲,肝癌发病率明显高于其它地区,并且肝癌致死率在我国恶性肿瘤中高居第二位;而肝癌中,肝细胞癌(HCC)大约占80%(Llovet JM,Zucman-Rossi J,Pikarsky E,Sangro B,Schwartz M,Sherman M,Gores G:Hepatocellular carcinoma.Nat Rev Dis Primers 2016,2:16018.)。因此探究肝细胞癌相关的癌基因或抑癌基因,研究肝细胞癌发生、转移机制对肝细胞癌的预防、诊断和治疗等均具有重要的实际意义。
目前临床手术切除或者肝移植仍是治疗肝细胞癌最有效的治疗方法,但是一方面由于肝癌发病速度快,恶性程度高,多数患者在肝癌早期并没有明显的临床症状,大多数病人确诊时已属于肝癌晚期,错过了手术治疗的最佳时机,限制了手术治疗手段的应用;另一方面肝细胞癌易扩散转移、术后易复发,导致肝细胞癌患者的术后生存期较短,影响手术治疗的效果。和其他恶性肿瘤相同,肝细胞癌的发生、发展和转移是一个多基因参与、多步骤的、复杂的生物学过程([8]Fidler IJ:The pathogenesis of cancer metastasis:the'seed and soil'hypothesis revisited.Nat Rev Cancer 2003,3(6):453-458.),其中涉及到了许多基因的改变、肿瘤微环境等因素导致了肝实质细胞的的恶性转化。
虽然,目前全世界已经尝试用高通量技术筛选技术对肝细胞癌的功能基因的突变谱及差异表达谱进行了研究,但目前临床上没有很好的诊断标志分子及治疗靶标。之前的大部分研究一直是以蛋白质编码基因为研究对象,随着非编码RNA研究的逐渐深入及高通量测序技术的不断发展和完善,近十年来,人们发现基因组可以编码大量长片段的非编码RNA,它们在生命活动及疾病发生中的作用也逐渐得到揭示。目前为止,在肝细胞癌中仍没有筛选到可以用于临床的诊断或预后的lncRNA分子。因此本发明采用高通量测序技术并辅以生物信息学分析及实验技术筛选、验证与肝细胞癌转移相关的长链非编码RNA(1ncRNA),并探讨其可能的临床意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的之一在于提供一种可应用于肝细胞癌诊断和治疗的lncRNA生物标志物。
本发明的目的之二在于提供一种筛选治疗肝细胞癌的候选药物的方法。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面提供了一种检测LINC01451基因的表达水平的试剂。
进一步,所述试剂包括:
特异性识别LINC01451的探针;或特异性扩增LINC01451的引物。
进一步,特异性扩增LINC01451的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
本发明的第二方面提供了一种产品,所述产品包括本发明第一方面所述的试剂。
进一步,所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。
本发明的第三方面提供了一种组合物,所述组合物包括有效量的LINC01451的抑制剂。其中,所述LINC01451的抑制剂选自:以LINC01451或其转录本为靶序列、且能够抑制LINC01451基因表达或基因转录的干扰分子,包括:shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸,或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
优选的,所述抑制剂为siRNA。
更为优选的,siRNA的序列如SEQ ID NO.9~10所示。
进一步,所述组合物还包括与所述抑制剂相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
药学上可接受的载体和/或辅料包括(但不限于)缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。
本发明的第四方面提供了一种筛选治疗肝细胞癌的候选药物的方法,所述方法包括:
用待筛选物质处理表达或含有LINC01451基因的体系;和
检测所述体系中LINC01451基因的表达;
其中,若所述待筛选的物质可以抑制LINC01451基因的水平((优选显著降低,如低20%以上,较佳的低50%以上;更佳的低80%以上),则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选药物。
所述体系选自:细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型,优选非人哺乳动物的动物模型,如鼠、兔、羊、猴等)等。
所述候选药物包括(但不限于):针对LINC01451基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。
本发明的第五方面提供了如下任一项所述的应用:
a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断肝细胞癌的产品中的应用;
b.本发明第二方面所述的产品在制备诊断肝细胞癌的工具中的应用;
c.本发明第三方面所述的组合物在制备治疗肝细胞癌/肝细胞癌侵袭/肝细胞癌转移的药物中的应用;
d.LINC01451在制备治疗肝细胞癌及其侵袭和转移的药物中的应用;
e.LINC01451在筛选治疗肝细胞癌的候选药物中的应用。
进一步,d中所述的药物包括LINC01451的抑制剂,优选的,所述抑制剂包括以LINC01451或其转录本为靶序列、且能够抑制LINC01451基因表达或基因转录的干扰分子,包括:shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸,或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
优选的,所述抑制剂为siRNA;更为优选的所述siRNA的序列如SEQ ID NO.9~10所示。
进一步,e中所述的筛选治疗肝细胞癌的候选药物的步骤包括:
用待筛选物质处理表达或含有LINC01451基因的体系;和
检测所述体系中LINC01451基因的表达;
其中,若所述待筛选的物质可以抑制LINC01451基因的水平((优选显著降低,如低20%以上,较佳的低50%以上;更佳的低80%以上),则表明该待筛选物质是治疗肝细胞癌的候选药物。
附图说明
图1是利用QPCR检测LINC01451在肝细胞癌患者中的表达情况图;
图2是利用QPCR检测LINC01451在肝细胞癌细胞中的表达情况图;
图3是检测转染siRNA对肝细胞癌细胞中LINC01451的表达影响图;
图4是利用CCK8检测LINC01451对肝癌细胞增殖的影响图;
图5是检测LINC01451基因对肝细胞癌细胞迁移的影响图;
图6是检测LINC01451基因对肝细胞癌细胞侵袭的影响图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究,通过高通量测序方法,检测肝细胞癌组织和癌旁组织中lncRNA的表达水平,发现其中具有明显表达差异的lncRNA片段,探讨其与肝细胞癌的发生之间的关系,从而为肝细胞癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选,本发明首次发现了肝细胞癌中LINC01451显著性上调。实验证明,改变LINC01451的表达水平可以改变肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,提示LINC01451可以作为药物靶标应用于肝细胞癌的靶向治疗。
生物标志物
本文所用“生物标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物,其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中,术语“生物标志物”指代与肝细胞癌相关联的基因、基因的片段或变体。所述多肽的变体可以包括由于存在保守氨基酸置换而其氨基酸序列不同的多肽。例如,这样的变体具有的核苷酸序列至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%,或至少99%在整个序列区域与该基因的核苷酸序列是相同的。
本文所用术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较,经测定mRNA的量或水平,在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物mRNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较,经测定RNA的量,样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较,样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。本文所用“差异表达”可以用给定生物标志物的表达水平相对于对照中给定生物标志物的平均表达水平的比率进行测定,其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异表达。当使用p值时,当p值小于0.1时生物标志物被鉴定为在第一和第二群体之间差异表达。更优选p值小于0.05;甚至更优选p值小于0.01;还更优选p值小于0.005;最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异表达时,如果第一种和第二种样品中表达水平的比率大于或小于1.0,则RNA是差异表达的。举例来说,大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率,或小于1的比率,例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。
在本发明中,如果第一群体的平均表达水平与第二群体的平均表达水平的比率大于或小于1.0,则核酸转录本是差异表达的。举例来说,大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率,或小于1的比率,例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。在本发明的另一个实施方案中,如果第一个样品中表达水平与第二个群体中平均表达水平的比率大于或小于1.0,例如包括比率大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20,或比率小于1,例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05,则核酸转录本是差异表达的。
“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言,基因表达显示增加至少10%或更多,例如20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。
“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言,基因表达显示降低至少10%或更多,例如20%、30%、40%或50%、60%、70%、80%、90%或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。例如,上调基因包括与从正常个体分离的mRNA的表达相比,从以患有肝癌为特征的个体分离的样本中的mRNA表达水平增加的基因。例如,下调基因包括与从正常个体分离的样本相比,从以患有肝癌为特征的个体分离的样本中mRNA表达水平降低的基因。
LINC01451基因
LINC01451基因位于9号染色体长臂3区4带上,本发明中的LINC01451包括野生型、突变型或其片段。在本发明的实施例中,一种代表性的人LINC01451基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LINC01451基因(NR_135288.1)所示。本发明的LINC01451核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
在本发明中,可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解,测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测,这些技术包括但不限于:核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。
试剂盒、芯片、核酸膜条
本发明提供了一种试剂盒,所述试剂盒可用于检测LINC01451的表达。所述试剂盒包括用于扩增LINC01451的特异性引物对;标准DNA模板;PCR反应液。
术语“引物”表示寡核苷酸,不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生,当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下,即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链,并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素,其中包括温度、引物来源和使用方法。例如,对于诊断应用,依赖于靶序列的复杂性,寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸,尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。
在本发明的一个优选的实施方案中,所述特异性引物对包括上游引物和下游引物,序列如SEQ ID NO.1~2所示。
作为更优选的实施方案,所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒,所述引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
在一个更优选的实施方案中,所述试剂盒中的PCR反应液为荧光定量PCR反应液,并一步包含荧光染料。
在一个更优选的实施方案中,所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer缓冲液,所述荧光染料为SYBR Green II,Taq酶为热启动酶。
本发明中的芯片包括:固相载体;以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LINC01451所示的部分或全部序列。
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料,例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合,最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板;所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒,其直径多为微米,由于带有能与蛋白质结合的功能团,易与抗体(抗原)形成化学偶联,结合容量大;所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。
术语“探针”是指寡核苷酸及其类似物,并涉及通过与靶序列的核苷酸碱基的氢键相互作用而识别多核苷酸靶序列的一系列化学物质。探针或靶序列可以是单链或双链RNA或单链或双链DNA或DNA与RNA碱基的组合。探针至少长8个核苷酸,并少于全基因的长度。探针可以长10、20、30、50、75、100、150、200、250、400、500和长至2000个核苷酸,只要小于靶基因全长即可。探针可以包括修饰寡核苷酸,以具有可通过荧光、化学发光等检测的标签。探针还可以被修饰以具有可检测标签和淬灭分子,例如Taqman和Molecular Beacon探针。
寡核苷酸及其类似物可以是RNA或DNA,或RNA或DNA的类似物,通常称为反义寡聚物或反义寡核苷酸。这些RNA或DNA类似物包含但不限于2’-O-烷基糖修饰,甲基膦酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothiate)、二硫代磷酸酯、formacetal、3’-thioformacetal、砜、氨基磺酸酯和硝基氧骨架修饰,和其中碱基结构已被修饰的类似物。此外,寡聚物的类似物可以是下述聚合物,其中糖结构已经被修饰或替换为另一个合适的结构而得到聚合物,包括但不限于吗啉代类似物和肽核酸(PNA)类似物(Egholm,etal.Peptide Nucleic Acids(PNA)--Oligonucleotide Analogues with an Achiral Peptide Backbone,(1992))。
探针还可以是任何寡核苷酸类似物类型与天然DNA或RNA一起或组合的混合物。同时,寡核苷酸及其类似物可以单独使用或与一种或多种另外的寡核苷酸或其类似物组合使用。
在本发明中,核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针;所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底,例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
本发明中基因检测试剂盒或基因芯片或核酸膜条可用于检测包括LINC01451基因在内的多个基因(例如,与肝细胞癌相关的多个基因)的表达水平,将肝细胞癌的多个标志物同时进行检测,可大大提高肝细胞癌诊断的准确率。
抑制剂和药物(组合物)
基于发明人的发现,本发明提供了一种LINC01451的抑制剂,所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要,只要它抑制LINC01451基因的功能性表达即可,举例来说,本发明的抑制剂可以是以LINC01451基因为靶序列、且能够抑制LINC01451基因的干扰分子,包括:shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸,或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调LINC01451有用的物质,可用于治疗肝细胞癌。
作为本发明的一种优选方式,所述LINC01451的抑制剂是一种LINC01451特异性的小干扰RNA分子。如本文所用,所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA,这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式,它含有一个正义链和一个反义链,这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此,举例来讲,互补的正义链和反义链是化学合成的,其后可通过退火杂交,产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时,本发明人通过大量的比对分析,从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列,并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证,选出干扰效果最佳的siRNA,在本发明的具体实施例中,该siRNA的序列如SEQ IDNO.9~10所示,进一步地在细胞水平实验,结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中LINC01451基因的表达水平,以及肝癌细胞的增殖。
作为本发明的一种可选方式,所述的LINC01451的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA,shRNA)”,其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述,shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体,例如质粒或病毒载体,然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下,可被切割成小干扰RNA分子,从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒,通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列,从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列,该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得,例如一些病毒载体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
在本发明中,表达载体是本领域已知的各种载体,如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。
如本文所用,本文所用术语“有效量”表示足以降低或改善肝癌或其一种或多种症状的进程、严重程度和/或持续时间、预防肝癌或其一种或多种症状的发生、复发或发作、预防肝癌或其一种或多种症状恶化、或增强或改善另一种治疗的预防或治疗作用的化合物的量。
本发明可以采用用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于:皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等;优选的,所述给药方式是非肠道给予的。
本发明的药物组合物还可与其他治疗肝细胞癌的药物联用,其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药,甚至在同一组合物中同时给药。
本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药,而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中,可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答,调整本发明药物组合物的剂量。
统计学分析
在本发明的具体实施例中,实验都是按照至少重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
下面的实施例使用标准技术进行,所述标准技术对本领域技术人员来说除了另外详细描述的以外都是众所周知的和常规的。这些实施例仅仅是用于举例说明目的。
实施例1筛选与肝细胞癌相关的基因标志物
1、样品收集
各收集50例HBV感染的肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本,从中随机选取8例进行高通量测序,患者均知情同意,上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取,按说明书的具体步骤进行操作。
3、RNA样品的质量分析
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳,利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5ug,浓度≥200ng/μL,OD260/280介于1.8~2.2之间。
4、去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA。
5、构建cDNA文库
利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建,具体操作按说明书进行。
6、上机测序
使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序,具体操作按说明书进行。
7、高通量转录组测序数据分析
对测序结果使用R-3.3.3工具包中的DESeq2进行生物信息学分析,通过构dds矩阵、标准化,进行差异分析,差异表达lncRNA的筛选标准:FDR<0.05,abs(log2FC)>2。
8、结果
RNA-seq结果显示,LINC01451基因在肝细胞癌组织中的表达量显著高于对照组(癌旁组织),P值为1.15E-25,提示LINC01451可以作为可能的检测靶标应用于肝细胞癌的诊断。
实施例2 QPCR测序验证LINC01451基因的差异表达
1、利用前面收集的50例患者癌组织样本和癌旁组织样本对LINC01451基因差异表达进行大样本QPCR验证。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录:
1)将1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl polyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合,体积最后为20μl,37℃孵育1h;
2)向反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物,70℃孵育5min,立即置冰上孵育至少2min;
3)将反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM),0.5μl M-MLV逆转录酶,0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂,10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase freewater)混合,42℃孵育1h。
4、QPCR扩增检验
1)引物设计
根据Genebank中LINC01451基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物,由博迈德生物公司合成,其中,LINC01451的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示,GAPDH基因的引物序列如SEQ ID NO.3~4所示。
2)反应体系
SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl,正反向引物(5μM)各1μl,模板cDNA 2.0μl,ddH2O 8.5μl。各项操作均于冰上进行。每个样本设置3个平行管,所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
3)反应条件
95℃10min,(95℃15s,60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物,在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应,以GAPDH作为参照基因,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
5、结果
结果如图1所示,与癌旁组织相比,LINC01451基因在肝细胞癌组织中表达水平上调,差异具有统计学意义(P<0.05);其中表达上调的患者为47例,低表达2例,正常表达1例,阳性检出率=47/50×100%=94%;提示LINC01451可作为检测指标应用于肝细胞癌的辅助诊断。
实施例3 LINC01451基因在肝细胞癌细胞系中的差异表达
1、细胞培养
人肝细胞癌细胞株HepG2、Huh7和正常肝细胞系HL-7702,以含10%胎牛血清和1%P/S的培养基DMEM在37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。2-3天换液1次,使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、RNA的提取
使用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,具体操作参照说明书。
3、逆转录具体步骤同实施例2
4、QPCR扩增检验具体步骤同实施例2
5、结果
结果如图2所示,与正常肝细胞系相比,LINC01451基因在肝细胞癌细胞HepG2、Huh7中表达均上调,差异具有统计学意义(P<0.05),同RNA-sep结果一致。
实施例4 LINC01451基因的沉默
1、细胞培养
人肝细胞癌细胞株HepG2,以含10%胎牛血清和1%P/S的培养基DMEM在37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。2-3天换液1次,使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、siRNA设计
针对LINC01451基因的序列设计siRNA,设计的阴性对照siRNA-NC、siRNA1~3序列分别如SEQ ID NO.5~6、SEQ ID NO.7~12所示。
将细胞按2×105/孔接种到六孔细胞培养板中,在37℃、5%CO2培养箱中细胞培养24h;在无双抗、含10%FBS的DMEM培养基中,转染按照脂质体转染试剂3000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。
实验分为空白对照组(HepG2)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1、siRNA2、siRNA3),其中阴性对照组siRNA与LINC01451基因的序列无同源性,浓度为20nM/孔,同时分别进行转染。
3、QPCR检测LINC01451基因的表达水平
1)细胞总RNA的提取具体步骤同实施例4。
2)逆转录步骤同实施例2。
3)QPCR扩增步骤同实施例2。
4、结果
结果如图3显示,相比HepG2、转染空载siRNA-NC组,实验组能够降低LINC01451的表达水平,而siRNA2组的降低水平最为显著,因此选择siRNA2进行后续的实验。
实施例5 CCK8检测细胞增殖实验
1、细胞培养与转染步骤同实施例4
2、CCK8检测细胞增殖
将对数增殖期的HepG2细胞接种于96孔板,每孔2×103个细胞,将细胞分为三组,分别是空白对照组、转染siRNA-NC组和转染siRNA2,每组设6个复孔;分别在转染0h、24h、48h、72h、96h后加入10μl/孔CCK8试剂,放入培养箱中孵育1h后使用酶标仪检测A450的吸光值。
3、结果
图4所示的结果显示:空白对照组同转染空载组无明显差异(P>0.05),而转染siRNA2组的增殖细胞明显低对照组的增殖细胞,差异具有统计学意义(P<0.05),上述结果表明LINC01451与肝癌细胞的增殖有关。
实施例6细胞迁移实验
1、各组细胞转染后24h,常规消化、离心,用含有10g/L的无血清DMEM培养液重悬,调整细胞浓度为1×105/ml;
2、取200μ1的细胞悬液接种至不铺Matrigel胶的Transwell小室上室中;
3、在24孔板下室加1ml含10%胎牛血清的DMEM培养液,将Transwell小室置于24孔板孔内,避免培养液与小室之间形成气泡;37℃,5%CO2,常规培养48h;
4、取出小室,PBS淋洗,棉签小心擦净小室上室面的细胞,下室面用甲醇固定15min,1%结晶紫染色5min;200倍倒置显微镜下随机选取10个视野,计数穿过微孔膜下层的细胞数,取平均值,每组3个小室,重复3次。
5、结果
结果如图5所示,在肝细胞癌细胞转染干扰RNA之后,与对照组相比,实验组的穿膜细胞数显著减少,说明改变LINC01451的表达水平可以改变肝癌细胞的迁移能力,提示LINC01451可作为潜在的靶标应用于肝癌细胞的转移过程。
实施例7细胞侵袭实验
1、包被基底膜:将Matrigel胶置于4℃冰箱过夜液化,在冰上用预冷的枪头将Matrigel胶按1:3比例稀释于无血清的DMEM培养液,按50μl/孔均匀地覆盖在Transwell小室膜上,室温自然风干;
2、吸出培养板中残余液体,然后每孔加入50μl含有l0g/L BSA的无血清培养液,37℃孵育30min;
3、各组细胞转染后24h,常规消化、离心,用含有10g/L BSA的无血清DMEM培养液重悬。调整细胞浓度为1×l 05ml;
4、取200μl的细胞悬液接种至包被有Matrigel胶的Transwell小室上室中;在24孔板下室加1ml含10%胎牛血清的DMEM培养液,将Transwell小室置于24孔板内,避免培养液与小室之间形成气泡;37℃,5%CO2,常规培养48h;
5、取出小室,PBS淋洗,棉签小心擦净小室上室面的Matrigel胶和细胞,下室面用甲醇固定15min,1%结晶紫染色5min;用PBS漂洗2遍,200倍倒置显微镜下随机选取10个视野,计数穿过微孔膜下层的细胞数,取平均值,每组3个小室,重复3次。
6、结果
结果如图6所示,与对照组相比,实验组的穿膜细胞数减少,说明改变LINC01451的表达水平改变了肝癌细胞的侵袭能力,在肝癌的发生发展过程中,LINC01451可能参与了肝癌的浸润过程,提示LINC01451可作为潜在靶标应用于肝癌浸润的治疗中。
实施例8 LINC01451基因对肝细胞癌细胞凋亡的影响
使用流式细胞仪检测LINC01451基因对细胞凋亡的影响。
1、细胞培养步骤同实施例4。
2、细胞转染步骤同实施例5。
3、细胞凋亡检测
1)收集细胞样本并用预冷的PBS清洗,将细胞加入lml 1×上样缓冲液,300g离心10min,吸出缓冲液;
2)再次加入1×上样缓冲液,将细胞悬液中细胞浓度调整为1×106个/ml;
3)将细胞悬液取出100μ1,加入EP管中;将5μl的Annexin V FITC加入EP管中,混匀EP管中的液体,在室温下避光孵育10min;
4)继续加入5μ1PI染液,在室温下避光5min;
5)加入500μl的PBS溶液,轻轻混匀,1h内上流式细胞仪进行检测。
4、结果:
结果显示,实验组与对照组相比,对照组之间的细胞凋亡率无显著差异(HepG2组:4.2±0.27;siRNA-NC组:4.3±0.45),而实验组(siRNA2:9.12±0.21)则显著增加,说明改变LINC01451的表达水平可以改变肝癌细胞的凋亡率,提示LINC01451参与肝癌细胞的凋亡过程。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
中国医学科学院北京协和医院
<120> 生物标志物LINC01451的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtaaaggttg tcaaggtaag 20
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<212> DNA
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tcccaatctc ctcttctt 18
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<211> 22
<212> DNA
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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aauggaauau uuauccuucc g 21
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<212> RNA
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