CN111500734B - 一种肝癌诊断标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝癌诊断标志物及其应用，属于生物医药技术领域。该诊断标志物为LncRNA RP11‑70F11.8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的标志物LncRNA RP11‑70F11.8的表达对于肝癌细胞至关重要，为肝癌的临床治疗提供了新的靶点，通过检测该标志物的表达水平可判断患者是否患有肝癌。联合使用siRNA能够抑制LncRNA RP11‑70F11.8在肝癌细胞中的表达，抑制率高达92.51%，具有显著的临床应用前景。

Description

一种肝癌诊断标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肝癌诊断标志物及其应用。
背景技术
肝细胞肝癌(HCC)(以下简称肝癌)是一种恶性程度极高、预后极差的恶性肿瘤。肝癌发病隐匿，发现时已到中晚期，其死亡率高居癌症相关死亡因素的第二位。诱发肝癌的因素包括HBV感染、HCV 感染、酒精依赖、非酒精性脂肪肝、以及暴露于黄曲霉毒素和马兜铃酸等毒素，且这些因素往往相互叠加、协同致病。据2017年WHO报道，全球约有2.57亿HBV和0.71亿HCV感染者，潜在的、可能发展为肝癌患者的人数巨大。因此，进一步阐明肝癌发生发展和复发转移的机制，开发分子靶向药物，对提高肝癌患者的生存率、降低死亡率具有重要意义。
目前临床肝癌的药物以小分子化学药物治疗，靶向药物索拉非尼的应用我肝癌治疗带来曙光。然而，药物不良反应导致部分患者无法耐受而终止治疗。随着分子生物学技术的发展，基因治疗技术在肝癌治疗中具有广泛的应用前景。
长链非编码RNAs (LncRNAs)被认为是一类转录长度大于200个(大到数千个)核苷酸的转录本，且不能编码蛋白质。目前已经鉴定出27,919个人类lncRNAs基因，其中69%(19,175)的lncRNAs具有潜在的生物学功能。虽然已有个别报道称，lncRNAs与肝癌发生、肿瘤生长、癌组织血管的生成、肝癌细胞侵袭转移、以及肝移植之后肝癌的复发密切相关。但由于lncRNAs数量庞大、作用机制复杂，且其具有细胞特异性、组织特异性、发展阶段的特异性、疾病种类特异性等特征，仍有大量肝癌发生发展相关lncRNAs有待被发现、功能有待被研究，该领域的研究仍处于起步阶段。因此，迫切需要深入了解肝癌相关lncRNAs的种类及功能，为肝癌的治疗寻找有效靶点。
发明内容
解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明目的之一为提供一种肝癌诊断标志物及其检测试剂，通过检测该标志物的表达水平可判断患者是否患有肝癌；
本发明的目的之二为提供一种肝癌诊断标志物的特异性扩增和靶向抑制试剂，以及包含该抑制试剂的生物制剂，可以有效调节标志物的表达水平，来达到治疗肝癌的目的。
技术方案：一种肝癌诊断标志物，所述诊断标志物为LncRNA RP11-70F11.8，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
所述一种肝癌诊断标志物作为诊断肝癌的标志物的应用。
一种检测所述肝癌诊断标志物的引物，所述引物为qRT-PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
一种特异性扩增所述肝癌诊断标志物的试剂，所述试剂为5’-GSP引物和3’-GSP引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示。
一种靶向抑制所述肝癌诊断标志物表达的试剂，所述试剂为siRNA1、siRNA2和siRNA3中的一种或几种，所述siRNA1的序列为SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7，所述siRNA2的序列为SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9，所述siRNA3的序列为SEQ ID NO. 10和SEQ IDNO. 11。
优选的，所述试剂为siRNA1。
优选的，所述试剂为siRNA1和siRNA2的组合。
一种靶向抑制所述肝癌诊断标志物表达的试剂在制备治疗肝癌的生物制剂中的应用。
优选的，所述生物制剂包括siRNA1~3中的一种或几种，以及药学上可接受的载体。
有益效果：与现有技术相比，本发明利用基因芯片筛选人肝癌组织中表达显著上调的LncRNA RP11-70F11.8，并获得其转录本全长。进而利用特异性siRNA靶向调控LncRNARP11-70F11.8的表达，减少LncRNA RP11-70F11.8的表达水平。LncRNA RP11-70F11.8表达降低的肝癌细胞的增殖和迁移能力大大降低，这说明LncRNA RP11-70F11.8的表达对于肝癌细胞至关重要，为肝癌的临床治疗提供了新的靶点，通过检测该标志物的表达水平可判断患者是否患有肝癌。联合使用siRNA能够抑制LncRNA RP11-70F11.8在肝癌细胞中的表达，抑制率高达92.51%，具有显著的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明所述的LncRNA RP11-70F11.8在52例人肝癌组织样本中的qRT-PCR结果图；
图2为本发明所述LncRNA RP11-70F11.8的siRNA1、siRNA2和siRNA3干扰SK-Hep1细胞中该lncRNA表达的qRT-PCR结果图；
图3为本发明所述LncRNA RP11-70F11.8对肝癌SK-Hep1细胞增殖和迁移的影响图，(图3A为LncRNA RP11-70F11.8-siRNA1联合-siRNA2 (siRNA1+2)干扰SK-Hep1细胞中LncRNA RP11-70F11.8后的CCK-8实验结果；图3B为siRNA1联合siRNA2干扰SK-Hep1细胞中LncRNA RP11-70F11.8后的克隆形成实验结果，右侧柱状图为形成克隆数的统计结果；图3C为siRNA1联合siRNA2干扰SK-Hep1细胞中LncRNA RP11-70F11.8后的Transwell实验结果，右侧柱状图为穿过细胞数统计结果)。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例说明本发明的具体步骤。应理解，实施例仅用来说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
本发明中所使用的术语，除非有特别说明，一般指本领域普通技术人员在通常情况下所理解的含义。
在以下实施例中，未详细描述的实验条件和方法，通常按照本领域中公知的常规实验条件和方法，或者按照生产厂商的建议实施。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1 肝癌及癌旁组织样本验证差异表达LncRNA RP11-70F11.8
1、临床样本收集
收集医院肝胆外科手术治疗切除的52例患者肝癌组织(包括癌组织和癌旁组织)。52例患者中男性47例、女性5例，年龄41-82岁，平均54岁。患者术前未经受过抗肿瘤治疗。纳入标准：(1)病理初步诊断为原发性肝细胞肝癌；(2)经详细说明研究目的后患者知情同意参与本研究。取上述患者手术切除的病理组织，满足临床病理诊断后，进行如下实验。
2、组织RNA提取及qRT-PCR检测
组织RNA提取按照Reagent (Invitrogen)说明书操作，逆转录后，采用PrimeScript RT-PCR Kit (Takara)进行qRT-PCR，操作按试剂盒说明书进行。使用Bio-radCFX96 PCR仪，反应程序为：Stage 1：95℃ 3min；Stage 2 (Cycle：40)：95℃ 15s，60℃30s；Stage 3：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。所有实验结果至少3次重复，结果以2－△△CT计算(以β-actin作为内参)，并进行统计分析。
采用的LncRNA RP11-70F11.8上游引物：5’-GTCCACAATGCAGAGAGAACCCCT-3’ (SEQID NO. 2)，下游引物：5’-GGTCCTGGATCAACCACTTCTTAC-3’ (SEQ ID NO. 3)。
3、qRT-PCR结果如图1所示，结果显示与癌旁组织 (paracancer，设定表达量为1)相比，肝癌(HCC)组织中的LncRNA RP11-70F11.8表达显著增加，差异具有统计学意义(***P<0.001)。
实施例2 快速扩增LncRNA RP11-70F11.8的cDNA末端(RACE)
1、取患者肝癌组织，使用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit试剂盒，严格按照操作说明提取高品质RNA；
2、使用Clotech公司的SMARTerTM RACE试剂盒，严格按照说明书进行如下实验：分别用5’-CDS primer和3’-CDS primer进行First-strand cDNA的合成，得到相应的5’-cDNA和3’-cDNA，并测序；根据说明书要求，针对LncRNA RP11-70F11.8设计5’-GSP引物(序列如SEQ ID NO. 4所示)和3’-GSP引物(序列如SEQ ID NO. 5所示)，随后使用降落PCR进行5’-RACE和3’-RACE，获取LncRNA RP11-70F11.8的5’和3’末端，PCR产物进行测序。
3、测序完成后，将结果和原来已知序列进行拼接，获取LncRNA RP11-70F11.8的cDNA全长，该LncRNA长度为1207nt，序列见 SEQ ID No. 1。
4、将获取到的序列与UCSC数据库GRCh38/hg38序列进行比对分析，表明LncRNARP11-70F11.8位于12q13。
实施例3 抑制肝癌细胞LncRNA RP11-70F11.8表达
1、siRNA设计与合成
依据本发明获取的LncRNA RP11-70F11.8全长，通过BLAST检索，在该LncRNA的特异性序列区域设计特定靶向siRNA (LncRNA RP11-70F11.8-siRNA1～3)序列(SEQ ID NO.6～11)：
siRNA1正义链：5’-tcCTCTGCCACATCTCTTTCT-3’ (SEQ ID NO. 6)；
siRNA1反义链：5’-AGAAAGAGATGTGGCAGAGGA-3’ (SEQ ID NO. 7)；
siRNA2正义链：5’-gcCTCTGCCTATGCCAAATGT-3’ (SEQ ID NO. 8)；
siRNA2反义链：5’-ACATTTGGCATAGGCAGAGGC-3’ (SEQ ID NO. 9)；
siRNA3正义链：5’-ctGTGCTGAGAAACCATGACT-3’ (SEQ ID NO. 10)；
siRNA3反义链：5’-AGTCATGGTTTCTCAGCACAG-3’ (SEQ ID NO. 11)；
上述siRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，同时该公司提供阴性对照siRNA (siRNA-NC)。
2、细胞培养与转染
细胞培养：人肝癌细胞株SK-Hep1用含10％FBS的高糖型DMEM培养，置于5％ CO2、饱和湿度、37℃二氧化碳培养箱中。细胞用0.25％胰蛋白酶消化，每隔两天传代一次。
siRNA转染：转染的前将细胞接种与6孔板培养板中，培养过夜。细胞生长至融合度30-50％时进行转染。使用LipofectamineTM RNAiMAX (Thermo Fisher公司)将siRNA1、siRNA2和siRNA3的终浓度调至100 nM，分别转入SK-Hep1细胞；将siRNA1和siRNA2按照1:1比例混合制成siRNA1+2，至终浓度为100 nM转染细胞；将siRNA1、siRNA2和siRNA3按照1:1:1比例混合制成siRNA1+2+3，至终浓度为100 nM转染细胞。转染严格按照说明书进行，第二天换成完全培养基，根据需要进行后续实验。
3、利用qRT-PCR检测干扰效率
转染换成完全培养基后继续培养48小时，收取肝癌细胞。RNA提取、逆转录及qRT-PCR步骤同实施例1。
4、qRT-PCR结果如图2所示，siRNA1、siRNA2、siRNA3干扰48小时后，LncRNA RP11-70F11.8的表达量分别为对照组(siNC)表达量的13.28%、44.39%和35.51%，差异均有显著性(****P<0.0001)。将siRNA1与siRNA2组合后干扰，RP11-70F11.8表达量仅为对照组的7.49%，差异显著(****P<0.0001)。故siNRA1、siNRA2及siNRA3均可显著抑制LncRNA RP11-70F11.8在肝癌细胞中的表达，抑制率分别为86.72%、55.61%和64.49%，差异具有统计学意义(P<0.001)。siRNA1和siRNA2组合的干扰效率进一步增强，抑制率达92.57%。表明本发明的siRNA-LncRNA可显著抑制细胞内LncRNA RP11-70F11.8表达。
实施例4 LncRNA RP11-70F11.8对肝癌细胞增殖、克隆形成和迁移的影响
1、细胞增殖实验
取对数生长期的SK-Hep1细胞，接种于96孔培养板，接种细胞数为1.5×103个每孔。分别转染siNC和siRNA1+2，第二天更换含10％FBS的高糖型DMEM继续培养。分别取培养0、24、48、72、96小时(hours)的细胞，每孔加10μL的CCK8 (Dojindo公司)工作液，在培养箱中继续孵育2小时，用酶标仪检测450nm波长处的吸光度值。每个实验组设置5个复孔，实验重复3次，绘制细胞生长曲线。结果如图3A所示，干扰SK-Hep1细胞中LncRNA RP11-70F11.8表达，抑制肝癌细胞增殖。差异具有统计学意义(**P<0.01)。
2、克隆形成实验
取对数生长期的SK-Hep1细胞，接种于12孔培养板，接种细胞数为100个每孔。分别转染siNC和siRNA1+2，第二天更换含10％FBS的高糖型DMEM继续培养，每隔3天更换一次培养基。3周后用75%乙醇配制的0.1％结晶紫染色5分钟，PBS洗掉多余染色液，观察细胞克隆形成情况，计数。实验重复3次以上，进行统计分析。结果如图3B所示，干扰SK-Hep1细胞中LncRNA RP11-70F11.8表达，抑制肝癌细胞克隆形成能力。差异具有统计学意义(***P<0.001)。
3、Transwell迁移实验
取对数生长期的SK-Hep1细胞，接种与6孔板培养板中，培养过夜。细胞生长至融合度30-50％时分别转染siNC和siRNA1+2，第二天更换含10％FBS的高糖型DMEM继续培养48小时。胰酶消化后，细胞以DMEM重悬，计数，并调整细胞浓度为1×105/mL。取8μm孔径的24孔板Transwell小室(BD公司)置于事先加入500μl完全培养基的24孔板中。小室上层加入100μL不同组别的细胞，培养箱中培养24小时。取出Transwell小室，用75%乙醇配制的0.1％结晶紫染色5分钟，自来水冲洗多余染色液，轻轻用棉签将小室上层没有穿过膜的细胞擦掉，置于PBS中。倒置显微镜下观察，随机选取5个以上视野，拍照。实验重复3次以上，进行统计分析。结果如图3C所示，干扰SK-Hep1细胞中LncRNA RP11-70F11.8表达，抑制肝癌细胞迁移能力。差异具有统计学意义(***P<0.001)。
序列表
<110> 南通大学
<120> 一种肝癌诊断标志物及其应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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agtcatggtt tctcagcaca g 21

Claims (2)

1.一种靶向抑制LncRNA RP11-70F11.8表达的试剂在制备治疗肝癌的生物制剂中的应用，其特征在于，所述试剂为siRNA1、siRNA2和siRNA3中的一种或几种的组合所述siRNA1的序列为SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7，所述siRNA2的序列为SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO.9，所述siRNA3的序列为SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物制剂包括siRNA1~3中的一种或几种，以及药学上可接受的载体。
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