CN115247212B - 一种与胃癌治疗、诊断、预后的lncRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与胃癌治疗、诊断、预后的lncRNA及其应用。一种与胃癌治疗、诊断、预后的lncRNA，所述的lncRNA为KDM4A‑AS1，全长序列如SEQ ID NO.1所示。KDM4A‑AS1作为检测靶点在制备胃癌辅助诊断、预后试剂盒中的应用。KDM4A‑AS1作为治疗靶点在制备胃癌治疗药物中的应用。本发明进一步丰富lncRNA调控胃癌发生的分子机制，为胃癌的诊疗提供潜在新靶标和新思路。

Description

一种与胃癌治疗、诊断、预后的lncRNA及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种与胃癌治疗、诊断、预后的lncRNA及其应用。
背景技术
胃癌是消化道常见的恶性肿瘤，也是严重威胁人类健康和生命的癌症之一。随着胃癌的诊断技术和医疗技术的不断发展，胃癌的治疗效果和预后虽有提高，但胃癌的整体五年生存率仍然很低。因此，进一步的研究及探索胃癌发生、发展的新的分子机制，可以丰富完善目前的研究理论，提高胃癌的早期诊断率、为新的有效治疗药物的研发提供靶点，最终改善胃癌病人的预后。
近年来，随着后基因组时代技术水平的不断发展，长链非编码RNA(long non-coding RNA， lncRNA)已经引起了越来越多的关注。长链非编码RNA是一类转录本长度超过200nt无蛋白编码能力的RNA分子，作为基因表达调控网络重要组成部分，可在表观遗传学、转录及转录后多个层面调控基因表达，从而影响肿瘤的发生发展。同时多个研究也证实LncRNAs在胃癌发生发展中发挥重要作用[8-11]。LncRNA TINCR通过影响KLF2 mRNA稳定性从而促进胃癌细胞增殖及影响凋亡[12]；LncRNA GHET1通过提高c-Myc的稳定性从而促进胃癌的增殖。因此，从 LncRNAs的角度继续挖掘胃癌新型靶标并深入探讨其分子机制十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种与胃癌治疗、诊断、预后的lncRNA。
本发明的另一目的是提供该lncRNA的应用。
本发明的又一目的是提供一种治疗胃癌的药物。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种与胃癌治疗、诊断、预后的lncRNA，所述的lncRNA为KDM4A-AS1，全长序列如SEQ ID NO.1所示。
KDM4A-AS1作为检测靶点在制备胃癌辅助诊断、预后试剂盒中的应用。
检测所述的lncRNA的试剂在制备胃癌辅助诊断、预后试剂盒中的应用。
一种所述的lncRNA的检测试剂，所述的检测试剂为检测KDM4A-AS1的特意性PCR引物、探针或基因芯片。
一种胃癌辅助诊断、预后试剂盒，包含所述的检测试剂。
KDM4A-AS1作为治疗靶点在制备胃癌治疗药物中的应用。
KDM4A-AS1作为治疗靶点在筛选胃癌治疗药物中的应用。
抑制KDM4A-AS1表达的物质在制备胃癌治疗药物中的应用。
一种治疗胃癌的药物，包含抑制KDM4A-AS1表达的物质。
有益效果：
KDM4A-AS1是一条反义lncRNA(antisense lncRNA)，位于人类染色体1p34区域，与其宿主基因KDM4A属于头对头(head to head)关系。同时，NCBI数据库提供的信息显示其序列长度为1574bp，且只有一个转录本(NR_033827.1)。为进一步深入研究，我们以NCBI提供的序列信息为依据，运用5’和3’端快速扩增实验(Rapid-Amplification of cDNA Ends,RACE) 技术对其序列进行扩增确定，获得KDM4A-AS1的全长序列。我们的结果发现：KDM4A-AS1全长 1069bp，从而确定了KDM4A-AS1的全长序列，如SEQ ID NO.1所示。为验证上述结果，本课题组对66对胃癌及其癌旁组织进行了实时荧光定量(Real-time quantitativePCR，qPCR)分析，结果提示KDM4A-AS1在胃癌组织中显著上调。其表达水平与肿瘤TNM分期、肿瘤大小密切相关，且高表达的KDM4A-AS1提示胃癌不良预后。进一步运用qRT-PCR方法检测各胃癌细胞系中KDM4A-AS1表达情况，发现对比正常胃粘膜上皮细胞系(GES-1)，KDM4A-AS1在胃癌细胞系中表达显著上调。然后针对KDM4A-AS1序列设计合成ASO(Antisenseoligonucleotides，反义寡核苷酸)，在BGC-823及SGC-7901细胞株中干扰及质粒过表达KDM4A-AS1后，MTT及克隆形成实验说明降低KDM4A-AS1表达能够明显抑制胃癌细胞增殖及克隆形成能力，相反过表达KDM4A-AS1能够促进胃癌细胞增殖及克隆形成能力。Transwell实验发现沉默KDM4A-AS1明显抑制胃癌细胞迁移能力，过表达则促进胃癌细胞迁移能力。流式细胞仪检测发现敲低 KDM4A-AS1后，促进细胞凋亡，同时细胞周期阻滞于G0/G1期。综上所述，KDM4A-AS1在胃癌组织中显著高表达，并调控了胃癌细胞的恶性表型。因此KDM4A-AS1可以作为胃癌诊疗的潜在新靶标，检测KDM4A-AS1的物质可以在制备胃癌辅助诊断、预后试剂中应用，抑制KDM4A-AS1 表达的物质可以在制备胃癌治疗药物中应用。
附图说明
图1分子机制示意图：转录因子c-Myc转录诱导KDM4A-AS1高表达，高表达的KDM4A-AS1与 IGF2BP1蛋白绑定，通过维持mRNA稳定性的方式顺式转录激活宿主基因KDM4A的表达，同时调控下游其他一系列基因表达，其中也包括了转录因子c-Myc，KDM4A-AS1和c-Myc之间形成了一个正反馈调控环路，导致恶性循环，从而导致胃癌细胞恶性进程。
图2：A：对GC 3对癌和相应癌旁进行lncRNA测序，获得差异表达lncRNA，其中KDM4A-AS1 上调倍数最高。B：上下调前五位lncRNA如表格所示。C和D：分析TCGA胃癌数据库，发现 KDM4A-AS1在胃癌中表达上调(配对和非配对均表达上调)。**P<0.01。
图3：A：运用5’和3’端快速扩增实验(Rapid-Amplification of cDNA Ends,RACE)技术对其序列进行扩增确定。B：在66对胃癌组织及其癌旁组织中运用实时荧光定量PCR进行验证，发现KDM4A-AS1在癌组织显著上调(△Ct值越小代表表达越高)，其表达水平与肿瘤的TNM 分期，肿瘤大小呈正相关，且高表达的KDM4A-AS1提示胃癌病人的不良预后。**P<0.01。
图4：A：用qRT-PCR方法检测胃癌细胞系中KDM4A-AS1的表达水平，发现其在胃癌细胞系中的表达相比GES-1(正常胃粘膜上皮细胞系)显著上调。同时在BGC-823，SGC-7901细胞株中干扰及过表达KDM4A-AS1后检测封闭及过表达效率。B，C和D：MTT，克隆形成实验和Transwell 实验检测发现干扰KDM4A-AS1能明显抑制胃癌细胞增殖、克隆形成能力，过表达KDM4A-AS1 能够促进胃癌细胞增殖、克隆形成能力。E:干扰KDM4A-AS1能够明显促进BGC-823细胞凋亡。 F:干扰KDM4A-AS1能够明显阻滞BGC-823细胞于G1/G0期。*P<0.05,**P<0.01。
图5：A：在线数据网站(JASPAR:http://jaspar.genereg.net/；TFSEARCH:http:// diyhpl.us/～bryan/irc/protocol-online/protocol-cache/TFSEARCH.html.)生物信息学分析发现，KDM4A-AS1启动子区(转录起始位点上游2Kb内)含有一个潜在的保守的c-Myc结合位点。B：BGC-823细胞中转染c-Myc的干扰序列和过表达质粒，c-Myc的表达水平显著下调或上调。C：BGC-823细胞中过表达和干扰c-Myc后，KDM4A-AS1表达显著上调和下调(H19作为阳参)。D：荧光素酶双报告实验证实c-Myc能够诱导KDM4A-AS1启动子区活性。E：ChIP实验证实c-Myc能够直接结合到KDM4A-AS1的启动子区，且过表达c-Myc能够增强其在KDM4A-AS1启动子区的结合能力(H19作为阳参)。**P<0.01。
图6：A：在BGC-823细胞中干扰KDM4A-AS1后，其宿主基因KDM4A mRNA表达下调。B：在BGC-823 细胞中干扰KDM4A-AS1后，其宿主基因KDM4A蛋白表达下调。C：TCGA胃癌数据发现KDM4A-AS1 与宿主基因KDM4A的表达呈明显正相关。D：在BGC-823细胞中干扰KDM4A-AS1并行RNA-seq 筛选差异表达基因，共获得差异两倍以上基因1398条，且发现干扰KDM4A-AS1后，c-Myc、KDM4A、 IGF2和CD44表达下调。E：GO分析发现这些差异基因主要与肿瘤细胞的增殖凋亡迁移相关。 F:使用qPCR方法对一些增殖凋亡迁移相关基因的测序结果进行验证。*P<0.05,**P<0.01。
图7：A：细胞核及细胞质RNA分离实验发现KDM4A-AS1主要分布在细胞质内。B：RNApull down (下拉实验)联合银染-质谱实验(以KDM4A-AS1 antisense RNA为阴性对照)鉴定出一个差异蛋白峰：IGF2BP1。C：RIP实验反向验证了KDM4A-AS1可以与IGF2BP1蛋白结合。D:western blot检测发现干扰KDM4A-AS1后，c-Myc mRNA、蛋白表达下调；过表达KDM4A-AS1后，c-Myc mRNA、蛋白表达上调。**P<0.01。
图8:lncRNA KDM4A-AS1过表达载体的图谱.
具体实施方式
实施例1利用高通量测序及生物信息学分析筛选出胃癌中差异表达的KDM4A-AS1
通过博奥公司对3对胃癌和癌旁进行lncRNAs测序，对差异lncRNA进行注释，最终获得在胃癌-癌旁差异表达在4倍以上的lncRNAs有257条。其中上调的lncRNAs有131条，下调的lncRNAs有126条(图2A)。测序结果中上调倍数最高的是KDM4A-AS1(18.56倍)(图2B)。选取对高表达差异倍数最高的KDM4A-AS1进行研究。并结合TCGA数据库在大样本数据中对KDM4A-AS1进行进一步验证，结果发现KDM4A-AS1在胃癌中表达明显上调(图2C和2D)。
实施例2.RACE(5’RACE和3’RACE)实验鉴定KDM4A-AS1全长序列
NCBI数据库显示，KDM4A-AS1是一条反义lncRNA(antisense lncRNA)，位于人类染色体1p34区域，与其宿主基因KDM4A属于头对头(head to head)关系(工作基础图2A)。同时，NCBI数据库提供的信息显示其序列长度为1574bp，且只有一个转录本(NR_033827.1)。为进一步深入研究，我们以NCBI提供的序列信息为依据，运用5’和3’端快速扩增实验(Rapid-Amplification of cDNA Ends,RACE)技术对其序列进行扩增确定，获得KDM4A-AS1的全长序列。具体方法如下：
①已知序列验证：使用BGC-823细胞cDNA为模板，根据NCBI gene数据库参考序列为模板，设计引物，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)进行PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳后，目的条带切胶回收测序。
已知序列验证的引物
名称 序列(5’-3’)
F1 GAGCACCCCAGCTTGCAGGTTCAG
F2 ACATCGAGCTGTCTAGAGGAACCC
R1 GGAGTACGGTGGCATGATCTTGGC
R2 TTCACCTCCCAGGTTCACGCCATT
②3’RACE：以运用Clontech
Figure SMS_1
RACE 5’/3’Kit(Cat.Nos.634860)反转录的cDNA为模板，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)进行PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳后，目的条带切胶回收测序。
3’RACE引物
名称 序列(5’-3’)
F1 TCAAGAAGTGACATTAAGGCCAGC
F2 CACGCCTGTAATCCCACCACTTTG
③5’RACE：以运用Clontech
Figure SMS_2
RACE 5’/3’Kit(Cat.Nos.634860)反转录的cDNA为模板，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)进行PCR扩增，然后琼脂糖凝胶电泳后，目的条带切胶回收测序。
5’RACE引物
名称 序列(5’-3’)
R1 GGCAAGAGCACTCTGGGTTCCACA
R2 AGGTCCGAAGCTTTCGGCCTCAGT
④RACE后序列全长验证：以RACE前验证反转录的cDNA为模板，同时设立阴性对照，使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)，然后琼脂糖凝胶电泳后，目的条带切胶回收测序。
RACE后序列全长验证引物
名称 序列(5’-3’)
F1 AGTGCTGCGGCGAGTGCGGGGCGA
R1 TGAGATGGAGTCTTGCTCTGTTGC
R2 TACGGTGGCATGATCTTGGCTCAC
结果显示：KDM4A-AS1全长1069bp，从而确定了KDM4A-AS1的全长序列(3A)。NCBI数据库显示，KDM4A-AS1(Gene ID：100132774)是一条反义lncRNA(antisense lncRNA)，位于人类染色体1p34区域，与其宿主基因KDM4A属于头对头(head to head)关系。
实施例3.qRT-PCR检测临床组织标本中KDM4A-AS1表达水平并分析与临床数据相关性
进一步收集66对胃癌及癌旁组织标本，及其临床资料的整理。Trizol法提取组织的总RNA，取1μg的RNA逆转录为cDNA模板(TAKARA)。采用qRT-PCR检测了KDM4A-AS1的表达水平。定量PCR应用ABI公司的7500型定量PCR仪(Applied Biosystem,Foster City，CA)，结果采用2-△△ct理论进行分析。并分析其与临床病理资料(TNM分期、病理特征)及预后的相关性，以验证KDM4A-AS1能否作为胃癌诊断及预后的标志物，其表达失活可能是胃癌发生、发展的关键靶分子。
结果提示KDM4A-AS1在胃癌组织中显著上调(图3B)。其表达水平与肿瘤TNM分期、肿瘤大小密切相关，且高表达的KDM4A-AS1提示胃癌不良预后(图3B)。进一步运用qRT-PCR方法检测各胃癌细胞系中KDM4A-AS1表达情况，发现对比正常胃粘膜上皮细胞系(GES-1)，KDM4A-AS1在胃癌细胞系中表达显著上调(图4A)。
qRT-PCR引物
名称 序列(5’-3’)
KDM4A-AS1 F AGGGTGAAAGGAACGTCCAC
KDM4A-AS1 R TGAAGTACTTTGCCAGGTCCC
GAPDH F AGCCACATCGCTCAGACAC
GAPDH R GCCCAATACGACCAAATCC
实施例4.KDM4A-AS1在胃癌中的细胞功能学研究
①设计合成特异性的针对KDM4A-AS1的ASO分子转染胃癌细胞；设计合成特异性KDM4A-AS1过表达质粒载体转染胃癌细胞，以空载体转染组为对照；48小时后收集细胞的总RNA，qRT-PCR分别检测干扰及过表达效率。
KDM4A-AS1干扰序列
KDM4A-AS1 UGGCUCUGAGGAAACAGGAAGGAAG
HSS172505 CUUCCUUCCUGUUUCCUCAGAGCCA
KDM4A-AS1 CACCUGCACACAAAGGAAAGAUGAA
HSS172506 UUCAUCUUUCCUUUGUGUGCAGGUG
KDM4A-AS1过表达质粒载体构建
过表达载体构建由上海捷瑞生物工程有限公司合成构建。图8为lncRNA KDM4A-AS1过表达载体的图谱。基因长度:1081bp，克隆载体:Pcdna3.1，克隆位点:EcoRI/XhoI，克隆载体抗性:AMP
②干扰和过表达KDM4A-AS1后，MTT、克隆形成、EdU、transwell和流式细胞技术检测对胃癌细胞增殖、周期及迁移等功能的影响。明确KDM4A-AS1在胃癌细胞中的生物学功能。
③KDM4A-AS1的干扰及过表达慢病毒载体构建：合成KDM4A-AS1的序列及特异性干扰序列，以GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)基因序列作为对照。上述序列均由英潍捷基TM公司合成，并将其插入慢病毒载体中；包装入慢病毒载体感染BGC-823细胞，收集阳性稳转细胞的总RNA 用于qRT-PCR检测KDM4A-AS1的表达。用其及相应的对照组细胞分别皮下注射BALB/C裸鼠，建立皮下移植瘤模型和肺转移模型；待瘤体形成后，每2天测一次瘤体体积，3周后处死小鼠，取瘤体，测量重量；qRT-PCR检测KDM4A-AS1的表达水平，石蜡包埋标本，HE染色，免疫组化检测增殖标记物ki-67变化。进一步评价KDM4A-AS1对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。
在BGC-823及SGC-7901细胞株中干扰及质粒过表达KDM4A-AS1后(图4A)，MTT及克隆形成实验说明降低KDM4A-AS1表达能够明显抑制胃癌细胞增殖及克隆形成能力，相反过表达 KDM4A-AS1能够促进胃癌细胞增殖及克隆形成能力(图4B和4C)。Transwell实验发现沉默 KDM4A-AS1明显抑制胃癌细胞迁移能力，过表达则促进胃癌细胞迁移能力(图4D)。流式细胞仪检测发现敲低KDM4A-AS1后，促进细胞凋亡，同时细胞周期阻滞于G0/G1期(图4E和4F)。
实施例5
在线数据网站(JASPAR:http://jaspar.genereg.net/；TFSEARCH:http:// diyhpl.us/～bryan/irc/protocol-online/protocol-cache/TFSEARCH.html.)生物信息学分析发现，KDM4A-AS1启动子区(转录起始位点上游2Kb内)含有一个潜在的保守的c-Myc结合位点(图5A)。BGC-823细胞中转染c-Myc的干扰序列和过表达质粒，荧光定量PCR检测c-Myc的表达水平，结果见图5B。以H19作为阳性参照，定量PCR检测转染BGC-823细胞中过表达和干扰c-Myc后，KDM4A-AS1和阳性参照H19表达量，结果见图5C。
实施例6双荧光素酶报告基因实验
1.重组质粒制备:提取胃癌细胞基因组总DNA，用PCR的方法将KDM4A-AS1启动子区含有 c-Myc保守结合位点的序列扩增，用特异的限制性核酸内切酶酶切扩增产物，并用同样的内切酶酶切PGL3-Luc载体，用DNA纯化试剂盒纯化回收酶切产物，在T4DNA连接酶的作用下，将 KDM4A-AS1启动子区片段插入荧光素酶报告基因中，构建成含c-Myc结合位点的KDM4A-AS1序列的荧光素酶报告基因(PGL3-KDM4A-AS1-Luc)，对构建好的PGL3-KDM4A-AS1-Luc载体进行酶切鉴定并送公司测序。
2.细胞系选择:根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T细胞
3.共转染：将构建好的荧光素酶报告基因载体(PGL3-KDM4A-AS1-Luc)及c-Myc过表达载体作为实验组共转染293T细胞，同时将转染(PGL3-KDM4A-AS1-Luc)和空质粒细胞作为对照组，检测转染效率
4.细胞处理:采用Promega双荧光素酶检测试剂盒依照protocol操作；
5.荧光检测:使用GENios Pro酶标仪进行荧光强度检测。
荧光素酶双报告实验证实c-Myc能够诱导KDM4A-AS1启动子区活性。ChIP实验证实c-Myc 能够直接结合到KDM4A-AS1的启动子区，且过表达c-Myc能够增强其在KDM4A-AS1启动子区的结合能力(H19作为阳参)。**P<0.01。
实施例7
BGC-823细胞中转染KDM4A-AS1干扰序列后荧光定量PCR检测发现宿主基因KDM4AmRNA 表达下调(图6A)。Western blot检测发现在BGC-823细胞中干扰KDM4A-AS1后，其宿主基因KDM4A蛋白表达下调(图6B)。在BGC-823细胞中干扰KDM4A-AS1并行RNA-seq筛选差异表达基因，共获得差异两倍以上基因1398条，且发现干扰KDM4A-AS1后，c-Myc、KDM4A、IGF2 和CD44表达下调(图6C)。GO分析发现这些差异基因主要与肿瘤细胞的增殖凋亡迁移相关(图6D)。使用qPCR方法对一些增殖凋亡迁移相关基因的测序结果进行验证，结果见图6E。
实施例8
按照Pariskit试剂盒说明书操作步骤进行核质分离。细胞核及细胞质RNA分离实验发现 KDM4A-AS1主要分布在细胞质内(图7A)。RNA pull down联合银染-质谱实验(以KDM4A-AS1 antisense RNA为阴性对照)鉴定出一个差异蛋白峰：IGF2BP1(图7B)。RNA免疫共沉淀实验反向验证了KDM4A-AS1可以与IGF2BP1蛋白结合(图7C)。western blot检测发现干扰 KDM4A-AS1后，c-Myc mRNA、蛋白表达下调；过表达KDM4A-AS1后，c-Myc mRNA、蛋白表达上调(图7D)。
序列表
<110> 南京市第二医院
<120> 一种与胃癌治疗、诊断、预后的lncRNA及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1069
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtgctgcgg cgagtgcggg gcgagaggtt cgcgctggtg gagcacccca gcttgcaggt 60
tcagcgtggg tgtctctccc gggcacatcg agctgtctag aggaaccctc ttcccctggc 120
ttcacggccc agaggacgca cggctctctc ccctcgagag cgtgtttcgt cgcccgcgcg 180
gggaacgcaa agtgctaggg tagtcacggc cacttcacgc cgagggacat ctcatctcgc 240
cctccaggtc gtgagcgcac ccattccgct cactgaggcc gaaagcttcg gacctccgtg 300
ggccctgaga cttcagcgtt ccatgtctgc tgtgctgtgg aacccagagt gctcttgcct 360
ggatggctga gaatcccttg gaccctggaa gcacctactc catgatggcc cgcaggagga 420
ccaaactgga gacagtcctg gctctgagga aacaggaagg aaggagggtg aaaggaacgt 480
ccacctgcac acaaaggaaa gatgaaaaag agtcacctac catgggacct ggcaaagtac 540
ttcagaactt ttattccttc cagaagcagt gtatcacaat agattgaatc aagaagtgac 600
attaaggcca gcgcggtggc tcacgcctgt aatcccacca ctttgggagg ccgaggcggg 660
cggatcacga gatcaggaga tcaagaccat cctggctaac atggtgaaac cccatgtcta 720
ctaaaaatac aaaaaattag ccgggcatgg tggcgggcgc ctgtagtccc agctactcgg 780
gaggctgagg caggagaatg gcgtgaacct gggaggtgaa gcctgcagtg agccaagatc 840
atgccaccgt actcccgtac tccagcctgg gcaacagagc aagactccat ctcaaaaaaa 900
aaaagaaaag acattaaaga gatttgcaaa attgcaggga aatggcaatc ttttgttttt 960
gttttagaaa agttattttt aatctaaaaa aattgattat tttaaatcaa tctgctttaa 1020
tttctaataa gaataaatac gtttagatgt aacccagaaa aaaaaaaaa 1069

Claims (2)

1.检测SEQ ID NO.1所示的lncRNA表达水平的试剂在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
2.抑制SEQ ID NO.1所示的lncRNA表达的物质在制备胃癌治疗药物中的应用。
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