CN106967718A

CN106967718A - 人肺腺癌早期诊断用长链非编码rna序列及制备、应用

Info

Publication number: CN106967718A
Application number: CN201710174368.3A
Authority: CN
Inventors: 高山; 高弈航; 张常; 王亮
Original assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Current assignee: Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology of CAS
Priority date: 2017-03-22
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2017-07-21

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA的全长cDNA序列及制备、应用，长链非编码RNA的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，首次克隆了精确的linc00857的全长基因序列，为研究linc00857在肺腺癌发生发展过程中的功能奠定了基础，通过分析得到长链非编码RNA在肺腺癌中高表达，在正常肺组织中表达相对较低，且长链非编码RNA的表达同肺腺癌的恶化显著相关，因此本发明还公开所述长链非编码RNA在制备诊断或治疗肺腺癌的产品中应用，如所述长链非编码RNA的RNAi靶位点的短发夹片段和转录短发夹RNA的重组质粒在肺腺癌细胞中表达能明显降解细胞内源性所述长链非编码RNA并抑制肺腺癌细胞的恶性生长。

Description

人肺腺癌早期诊断用长链非编码RNA序列及制备、应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种肺腺癌特异性的长链非编码RNA的精确cDNA序列、该序列的制备方法、该基因RNA干扰用短发夹片段及其应用。

背景技术

肺癌是世界上发病率和致死率最高的癌症之一，且呈现逐年上升的趋势，在我国肺癌的发病率和致死率也位居所有癌症之首。肺癌患者中的小细胞肺癌(Small Cell LungCancer,SCLC)约占15％，非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)约占80％，肺腺癌属于非小细胞肺癌的一种，多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌，易发生于女性及不抽烟者。肺癌早期进行手术治疗之后的五年生存率约为40％，而发展到肺癌进展期之后术后平均生存时间仅为8个月。目前由于缺乏早期特异性诊断的方法，肺腺癌患者确诊时70％-80％的患者已经出现癌细胞远处转移的情况，错过最佳的手术时机。如何对肺腺癌患者进行早期的特异性诊断，并有效治疗手术后肺腺癌的复发和转移，已经成为亟待解决的问题。

在人类基因组的转录本当中，90％以上的基因并不具备编码蛋白的能力，他们往往被转录成非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。依据核苷酸的长度，我们把ncRNA又分为两大类：分别为核苷酸长度少于200nt的短链非编码RNA和核苷酸长度大于200nt的长链非编码RNA(lncRNA)。过去人们对短链ncRNA的研究比较多，lncRNA一度曾被认为是基因转录时的“噪音”和“垃圾”，并不具有特定的生物学功能。随着这些年的研究发现，lncRNA在多种类型肿瘤细胞(包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等)的增殖、克隆、凋亡、侵袭、转移以及药物耐药等方面均发挥着重要的作用，同时由于lncRNA具有显著的肿瘤组织特异性，因此在肿瘤细胞中表达异常的lncRNA有希望作为肿瘤早期诊断标志物(特别是在某些肿瘤发生的早期)，为癌症临床诊断提供无创、快捷和低成本的筛查手段。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是一种抑制疾病相关基因表达和诱导转录后基因沉默的有效手段。RNAi通过在细胞内由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的降解同源序列的mRNA，从而抑制相应基因表达的现象，它是转录后基因沉默(PTGS)的一种，对于内源性基因和外源性基因均有明显沉默作用。RNA干扰不仅是基础研究的热点,也是临床应用研究的热点，国际上已经有针对癌症、眼部疾病、高胆固醇血症和急性肾损伤等多种疾病的RNAi药物进入临床阶段。

长链非编码RNA与RNA干扰技术均是肿瘤基因治疗研究的热点，找到肺腺癌异常表达的长链非编码RNA有助于更好的进行肺腺癌的早期诊断，并可通过抑制其表达进行基因治疗，具有重要的实用价值。

《长链非编码RNA在肺腺癌分子诊断/预后中的应用及功能研究》(王丽惠，广西医科大学，转化医学，2016)提供了一种用于肺腺癌的早期诊断/预后的分子标志物linc00857，linc00857是在肺腺癌中特异性高表达的长链非编码RNA，与肺腺癌病人的不良预后显著相关。然而上述文献中的技术方案还存在如下缺陷：一、精确的linc00857的全长序列对于研究linc00857在肺腺癌发生发展中的功能具有重要意义，然而上述文献中未能提供精确的linc00857的全长序列，难以满足对肺腺癌发生发展中功能研究的要求；二、上述文献中提供的分子标志物linc00857的RNA干扰靶点少，不能提供更加有效的治疗方案，影响其基因治疗效果，如上述文献中虽然提供了用于在肺腺癌细胞中干扰linc00857的siRNA序列和shRNA质粒，但其中shRNA质粒的干扰效率较低，不足50％，而siRNA虽能取得较高的干扰效率，但同shRNA干扰相比，siRNA仅能对细胞进行瞬时干扰，且不稳定性较高，易出现脱靶效应，这种脱靶效应严重影响了siRNA在肿瘤的临床基因治疗中的应用。

发明内容

为此，本发明要解决的技术问题是提供一种长链非编码RNA的基因序列、制备方法以及其用途，如基于所述长链非编码RNA的RNA干扰靶位点、RNAi的短发夹片段，以及shRNA重组质粒可用于人肺腺癌的相关治疗。

本发明提供了一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA的cDNA序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。所述的长链非编码RNA为linc00857精准全长cDNA序列。

本发明提供了一种可特异性识别所述的长链非编码RNA的引物组，所述引物组为根据Mitranscriptome数据库中的linc00857的已知序列设计的，所述引物组包括如下引物：

引物GSP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

引物GSP2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

引物GSP3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

引物GSP4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

引物GSP5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

引物GSP6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明提供了一种制备所述的长链非编码RNA的全长cDNA序列的方法，包括如下步骤：

1)提取肺癌细胞总RNA；

2)以步骤1)中提取的总RNA反转录为cDNA，以所述cDNA为模板，利用上述的引物组扩增linc00857特异片段，将所述扩增的linc00857特异片段克隆至载体上，然后进行测序验证所述序列的正确性,即与人类基因组比对，确定其属于人类基因组即可；

3)以步骤1)提取的总RNA为模板，以3'-RACE CDS Primer A为引物进行反转录，获得3'末端的cDNA；

4)以步骤3)中获得的cDNA为模板，用10X Universal Primer A Mix和引物GSP5扩增所述linc00857的3'端序列，然后克隆至载体上，通过测序获得所述linc00857的3'端序列；

5)以步骤1)提取的总RNA为模板，用反转录引物5'-RACE CDS Primer A和接头引物SMARTer II A Oligonucleotide，将所述总RNA反转录，获得5’末端的cDNA；

6)以步骤5)中获得的cDNA为模板，用10X Universal Primer A Mix和引物GSP2扩增所述linc00857的5’端序列，然后克隆至载体上，通过测序获得所述linc00857的5’端序列；

7)将上述步骤4)得到的3’末端片段和步骤6)所得到的5’末端片段通过拼接得到所述长链非编码RNA的全长cDNA序列。

本发明提供了一种所述的长链非编码RNA在制备早期诊断或治疗人肺腺癌的产品中的用途。优选的，所述的长链非编码RNA在制备早期诊断或治疗人肺腺癌的药物中的用途。

本发明提供了一种引物对，所述引物对用于检测所述的长链非编码RNA在细胞和组织中的表达水平；所述引物对包括上游引物linc00857-F和下游引物linc00857-R，所述上游引物linc00857-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述下游引物linc00857-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明提供了一种用于人肺腺癌早期诊断的试剂盒，包括上述的引物对。

所述的用于人肺腺癌早期诊断的试剂盒，包括：

Green dye，10μL；

所述的上游引物linc00857-F，10μM,0.4μL；

所述的下游引物linc00857-R，10μM,0.4μL；

ROX，0.4μL；

dH₂O，6.8μL。

本发明提供了一种用于人肺腺癌早期诊断的qRT-PCR反应体系，包括：

Green dye，10μL；

所述的上游引物linc00857-F，10μM,0.4μL；

所述的下游引物linc00857-R，10μM,0.4μL；

ROX，0.4μL；

模板，2μL；

dH₂O，6.8μL。

本发明提供了一种所述的长链非编码RNA的RNAi靶位点的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示。

本发明提供了一种可用于所述的长链非编码RNA序列RNAi用的短发夹片段，所述短发夹片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

本发明提供了所述的RNAi靶位点的核苷酸序列或所述的RNAi用的短发夹片段在制备治疗肺腺癌疾病的药物中的用途。

本发明还提供了一种包含所述长链非编码RNA、所述的RNAi靶位点的核苷酸序列或所述的RNAi用的短发夹片段的载体。

本发明相对现有技术具有如下优点：

(1)本发明所述的一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA的cDNA序列如SEQ IDNO.1所示，首次克隆了精确的linc00857的全长基因序列，为进一步研究linc00857在肺腺癌发生发展过程中的功能奠定了基础，且所述长链非编码RNA具有更多的RNA干扰靶点，进而能够为针对linc00857的抗肺腺癌药物研发提供更多的功能靶点，显著提高其基因治疗效果。

(2)本发明所述的一种可特异性识别所述的长链非编码RNA的引物组，通过设计上述的引物组可以制备得到精确的linc00857的全长基因序列。

(3)本发明所述的一种制备所述的长链非编码RNA的全长cDNA序列的方法，通过所述方法可以制备得到精确的linc00857的全长基因序列，且所述制备方法步骤简单，易操作，时间短，效率高。

(4)本发明所述的一种引物对，所述引物对用于检测所述的长链非编码RNA在细胞和组织中的表达水平；所述引物对包括上游引物linc00857-F和下游引物linc00857-R，所述上游引物linc00857-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述下游引物linc00857-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；通过设计上述引物对，基于RT-PCR技术，可以检测所述的长链非编码RNA在细胞和组织中的表达水平，进而可以对于人肺腺癌进行早期诊断。

(5)本发明所述的一种用于人肺腺癌早期诊断的qRT-PCR反应体系，利用所述qRT-PCR反应体系，基于qRT-PCR技术，可以检测所述的长链非编码RNA在细胞和组织中的表达水平，进而可以对于人肺腺癌进行早期诊断。

(6)本发明所述的的长链非编码RNA的RNAi靶位点的核苷酸序列，和对应的RNAi的短发夹片段，能够有效抑制该基因的表达，所述RNAi靶序列、RNAi短发夹片段可用于制备抗肺腺癌的药物，也可采用基因治疗的方法，如以RNAi短发夹片段构建的shRNA质粒具有较好的稳定性，以shRNA质粒为表达载体，使其在癌变部位高表达。

附图说明

图1为本发明实施例1中5’RACE的测序检测结果；

图2为本发明实施例1中5’RACE的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道从左到右依次为linc00857的5’末端片段和DNA分子标记；

图3为本发明实施例1中3’RACE的测序检测结果；

图4为本发明实施例1中3’RACE的琼脂糖凝胶电泳检测结果，泳道从左到右依次为linc00857的3’末端片段和DNA分子标记；

图5为本发明实施例2中所述长链非编码RNA的保守性和转录活性分析结果；

图6为本发明实施例2中所述长链非编码RNA的编码能力计算值；

图7为本发明实施例3中所述长链非编码RNA在不同肺癌细胞株中的表达量，柱形图从左向右依次代表肺腺癌细胞株A549、Calu1、HCC827、MSTO-211H、NCIH-1299、PC9和正常肺上皮细胞BEAS-2B；

图8为本发明实施例4中所述长链非编码RNA在正常肺组织与肺腺癌组织中的不同表达量；

图9为本发明实施例4中所述长链非编码RNA在正常肺组织与肺腺癌组织中不同表达量的ROC曲线；

图10为本发明实施例4中所述长链非编码RNA随肺腺癌临床分期(I期、II期、III期和IV期)而变化的表达量，其中normal为正常肺组织的对照；

图11为本发明实施例4中所述长链非编码RNA随肺腺癌N分期(N0、N1和N2)而变化的表达量；

图12为本发明实施例4中所述长链非编码RNA随肺腺癌M分期(M0和M1)而变化的表达量；

图13为本发明实施例4中所述长链非编码RNA随肺腺癌T分期(T1、T2、T3和T4)而变化的表达量；

图14为本发明实施例6中所述长链非编码RNA的shRNA1和shRNA2在A549细胞株中的干扰效率；柱形图从左向右依次代表转染乱序RNA的A549阴性对照品、转染shRNA1的A549敲降样品和转染shRNA2的A549敲降样品；

图15为本发明实施例6中显示分别使用shRNA1和shRNA2敲降所述长链非编码RNA的A549细胞生长曲线，曲线从上到下依次代表转染乱序RNA的A549阴性对照品、转染shRNA1的A549敲降样品和转染shRNA2的A549敲降样品；

图16为本发明实施例6中显示分别使用shRNA1和shRNA2敲降所述长链非编码RNA的A549细胞克隆形成结果，其中左图示培养皿从左向右依次代表转染乱序RNA的A549阴性对照品、转染shRNA1的A549敲降样品和转染shRNA2的A549敲降样品；右图为左图克隆形成结果的量化图；

图17为本发明实施例6中显示linc00857的shRNA1和shRNA2在PC9细胞株中的干扰效率，柱形图从左向右依次代表转染乱序RNA的PC9阴性对照品、转染shRNA1的PC9敲降样品和转染shRNA2的PC9敲降样品；

图18为本发明实施例6中显示分别使用shRNA1和shRNA2敲降所述长链非编码RNA的PC9细胞生长曲线，曲线从上到下依次代表转染乱序RNA的PC9阴性对照品、转染shRNA1的PC9敲降样品和转染shRNA2的PC9敲降样品；

图19为本发明实施例6中显示分别使用shRNA1和shRNA2敲降所述长链非编码RNA的PC9细胞克隆形成结果，其中左图示培养皿从左向右依次代表转染乱序RNA的PC9阴性对照品、转染shRNA1的PC9敲降样品和转染shRNA2的PC9敲降样品；右图为左图克隆形成结果的量化图；

图20为本发明实施例7中显示过表达所述长链非编码RNA的NCI-H1299细胞株的过表达效率，柱形图从左向右依次代表转染pLVX-neo的阴性对照细胞株和转染pLVX-neo-linc00857的过表达细胞株；

图21为本发明实施例7中显示过表达所述长链非编码RNA的NCI-H1299细胞生长曲线，曲线由上到下依次代表转染pLVX-neo-linc00857的过表达细胞株和转染pLVX-neo的阴性对照细胞株；

图22为本发明实施例7中显示过表达所述长链非编码RNA的NCI-H1299细胞克隆形成结果，其中左图示培养皿从左向右依次代表转染pLVX-neo的阴性对照细胞株和转染pLVX-neo-linc00857的过表达细胞株；右图为左图克隆形成结果的量化图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，所有引物合成以及测序工作由南京金斯瑞生物有限公司完成，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。如T-vector购自promega，pSIH-H1购自adegene，Lenti-X^TM293T购自Takara，PMD2G购自adegene，PSPAX2购自adgene，opti-MEM购自gibco；下述实施例中所有涉及的细胞均购自上海生命科学研究院细胞所。

实施例1RACE法获得linc00857的精准全长cDNA序列

本实施例提供了linc00857精准全长cDNA序列的获得方法，所述linc00857精准全长cDNA序列即为所述长链非编码RNA，具体包括以下步骤：

1)根据Mitranscriptome数据库中的linc00857的已知序列设计一组gene-specific primer，依次命名为GSP1、GSP2、GSP3、GSP4、GSP5、GSP6，所述引物组可特异性识别linc00857，引物组中的各引物序列如表1所示；

表1特异性识别linc00857的引物组

2)使用Trizol法提取肺癌细胞株NCI-H199的总RNA，并用Thermo Fisher的III First-Strand Synthesis System的反转录试剂盒以oligo dT为反转录引物，将总RNA反转录为cDNA；

3)以步骤2)中的cDNA为模板，用三对引物GSP1和GSP2，GSP3和GSP4以及GSP5和GSP6扩增linc00857特异片段，连接T-vector，通过测序验证序列的正确性，所述序列通过与人类基因组比对，只要确定其属于人类基因组即可说明所述序列是正确的；

4)用SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒中的5'-RACE CDS PrimerA为反转录引物，SMARTer II A Oligonucleotide为接头引物，将步骤2)提取的总RNA反转录为cDNA，获得linc00857的5’末端的cDNA；所述5'-RACE CDS Primer A：5'–(T)25V N–3'，(N＝A,C,G,or T；V＝A,G,orC)；所述SMARTer II A Oligonucleotide：

5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX–3'；

5)以步骤4中的cDNA为模板，用10X Universal Primer A Mix和GSP2为引物扩增linc00857的5’末端片段，5’末端片段的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示；5’末端片段连接T-vector，通过测序获得linc00857的5’端序列，5’端序列的测序结果如图1所示；所述10XUniversal Primer A Mix为：Long(0.4μM):5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'；Short(2μM):5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'；

6)用SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒中的3'-RACE CDS PrimerA为反转录引物，将步骤2)提取的总RNA反转录为cDNA，获得linc00857的3’末端cDNA；所述3'-RACE CDS Primer A：5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N–3'，(N＝A,C,G,or T；V＝A,G,or C)；

7)以步骤6)中的cDNA为模板，用所述10X Universal Primer A Mix和引物GSP5扩增linc00857的3’末端片段，所述3’末端片段的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示；所述3’末端片段连接T-vector，通过测序获得linc00857的3’端序列，3’端序列的测序结果如图3所示；

8)将上述步骤5)得到的5’末端片段和步骤7)所得到的3’末端片段进行拼接得到所述长链非编码RNA的全长cDNA序列,如序列表中SEQ ID NO.1所示。

实施例2所述长链非编码RNA的保守性、转录活性和编码能力的分析

本实施例利用生物信息学的方法，对所述长链非编码RNA(linc00857精准全长cDNA序列)的保守性、转录活性和编码能力进行了分析，分析方法具体如下：

1、利用Roadmap和ENCODE数据库(https://www.encodeproject.org/)，得到正常肺组织中H3K4me3、H3k36me3和H3K27ac的数据，以及肺腺癌细胞株A549中H3K4me3、H3k36me3和H3K27ac的数据；将所得数据在UCSC网站显示(http://genome.ucsc.edu/)，得到H3K4me3、H3k36me3和H3K27ac在所述长链非编码RNA(图5中的“linc00857”)基因启动子区的富集情况(图5)，GEO accession number分别为GSM906395(H3K27ac,lung),GSM915336(H3K4me3,lung),GSM956014(H3K36me3,lung),GSM1003561(H3K4me3,A549),GSM1003578(H3K27ac,A549)，GSM1003456(H3K36me3,A549)。

结果显示同正常肺组织相比，H3K4me3、H3k36me3和H3K27ac在肺腺癌细胞株A549中高度富集，表明所述长链非编码RNA在肺腺癌细胞中有较强的转录活性，在正常肺组织中有相对较高的保守性。

2、通过PhyloCSF方法分析了linc00857、HOTAIR、SChLAP1、GAPDH和β-actin的编码能力(图6)，结果显示所述长链非编码RNA(图6中的“linc00857”)的PhyloCSF score为负值，介于HOTAIR与SChLAP1之间，HOTAIR和SChLAP1均为长链非编码RNA，对比蛋白编码基因GAPDH和β-actin的PhyloCSF score均为正值，表明所述长链非编码RNA基因不具备蛋白编码能力。

实施例3不同肺腺癌细胞株中所述长链非编码RNA表达量的检测

本实施例提供了一种引物对，所述引物对用于检测所述的长链非编码RNA在细胞和组织中的表达水平；所述引物对包括上游引物linc00857-F和下游引物linc00857-R，所述上游引物linc00857-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述下游引物linc00857-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本实施例提供了一种用于人肺腺癌早期诊断的试剂盒，包括上述的引物对。

所述的用于人肺腺癌早期诊断的试剂盒，包括：Green dye，10μL；所述的上游引物linc00857-F，10μM,0.4μL；所述的下游引物linc00857-R，10μM,0.4μL；ROX，0.4μL；dH₂O，6.8μL。

本实施例提供了一种用于人肺腺癌早期诊断的qRT-PCR反应体系，包括：Green dye，10μL；所述的上游引物linc00857-F，10μM,0.4μL；所述的下游引物linc00857-R，10μM,0.4μL；ROX，0.4μL；模板，2μL；dH₂O，6.8μL。

本实施例提供了基于qRT-PCR的检测肺腺癌细胞株中所述长链非编码RNA表达量的方法，具体步骤如下：

1、提取细胞总RNA，按照如下方法分别提取细胞A459、Calu1、HCC827、MSTO-211H、NCIH-1299、PC9和BEAS-2B的总RNA，上述所用细胞均购自上海生命科学研究院细胞所。

(1)将一个培养有上述任一细胞的6cm培养皿用PBS(pH为7.4)清洗，加入1mlTrizol，移入1.5ml EP管中，混匀，静置5min；

(2)12000rpm，4℃离心10min；

(3)加入200μl氯仿，剧烈摇晃15s，静置5min；

(4)12000rpm，4℃离心15min；小心将上层水相移入新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后放入-20℃1小时；

(5)12000rpm，4℃离心10min，小心弃上清；

(6)加入1ml的体积浓度为75％乙醇(DEPC水配置)洗涤沉淀，加入乙醇后，将RNA沉淀弹起漂洗；

(7)12000rpm，4℃离心10min，倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀；

(8)室温晾干，用30μl的DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶解，测浓度。

2、去除基因组DNA的反应，使用III First-Strand SynthesisSystem Kit，将步骤1中提取的细胞总RNA配制为表2所示的混合体系，将混合体系在42℃下静置2min，去除RNA中混有的基因组DNA。

表2去除DNA的反应混合体系

试剂	使用量
		5*gDNAEraser Buffer	2μl
gDNA Eraser	1μl
		Total RNA	1μg
RNase Free H₂O	up to 10μl

3、使用III First-Strand Synthesis System Kit，将步骤2中获得的细胞总RNA反转录为cDNA，所述细胞总RNA反应液为10μl，反转录的反应程序为：37℃保持15min，85℃保持5s，4℃恒温静置，所述反转录的扩增体系如下所示：

表3反转录扩增体系

试剂	使用量
		PrimeScriptRT Enzyme Mix 1	1μl
RT Primer Mix*⁴	1μl
		5*PrimeScript Buffer 2	4μl
RNase Free dH₂O	4μl

4、以步骤3中所得的cDNA为模板，通过所述用于人肺腺癌早期诊断的试剂盒和所述用于人肺腺癌早期诊断的RT-PCR反应体系，荧光定量PCR检测所述长链非编码RNA的表达水平，荧光定量PCR使用Green dye在ABI StepOne PCR instruMent上进行检测，反应程序为：50℃保持2min，95℃保持10min，95℃保持15s，60℃保持30s，40个循环，95℃保持15s，60℃保持1min，95℃保持15s，所述荧光定量PCR的扩增引物linc00857-F的序列如序列表中SEQ ID NO.8所示，引物linc00857-R的序列如序列表中SEQ ID NO.9所示；荧光定量PCR的扩增体系如下所示：

表4荧光定量PCR扩增体系

细胞中所述长链非编码RNA表达水平的检测结果如图7所示，相对细胞株Calu1、HCC827、MSTO-211H、NCIH-1299和BEAS-2B，所述长链非编码RNA在A549和PC9细胞株中有较高的表达量。

实施例4所述长链非编码RNA作为肺腺癌早期诊断标志物的能力评估

所述长链非编码RNA及它的表达数据从Mitranscriptome下载，病人样本从TCGA上下载，通过Wilcoxon rank sum test检测所述长链非编码RNA在正常组织和肺腺癌组织中表达量的差异(如图8所示)，同正常组织相比，所述长链非编码RNA在肺腺癌组织中显著性高表达；同时结合ROC曲线分析(如图9所示)，所述长链非编码RNA区分肺腺癌组织和正常组织的AUC可达0.911，具有较高的灵敏度和较强的特异性，所述长链非编码RNA可作为肺腺癌诊断的分子标记物。

通过Spearman correlation分析TNM以及Stage分期数据(条件：R>0.3且p<0.05)，得到不同Stage分期的肺腺癌组织中所述长链非编码RNA的变化表达量(如图10所示)。同正常组织相比，所述长链非编码RNA在不同分级的肺腺癌中均特异性高表达，且stage II、stage III和stage IV的肺腺癌中所述长链非编码RNA表达量高于stage I；结合TNM不同分期的肺腺癌组织中linc00857的表达变化量(如图11-13所示)，可得知所述长链非编码RNA在早期的肺腺癌中有较高的表达量，可作为人肺腺癌早期诊断的生物标记物，且随着肺腺癌的恶化，所述长链非编码RNA的表达量有所上升，揭示了所述长链非编码RNA在肺腺癌发生发展过程中的潜在功能。

实施例5所述长链非编码RNA特异性RNA干扰质粒与过表达质粒的构建

1、根据实施例1中所获得的linc00857精准全长cDNA序列，利用RNAi设计网站(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/；http://cancan.cshl.edu/RNAi_central/RNAi.cgi？type＝shRNA)，获得可信度高的RNAi的靶位点，靶位点序列如序列表中SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示。

2、根据上述的RNAi的靶位点序列，设计RNAi用的短发夹片段，短发夹片段的序列如序列表中SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

3、根据序列为SEQ ID NO.12所示的短发夹片段构建相应的shRNA1质粒，根据序列为SEQ ID NO.13所示的短发夹片段构建相应的shRNA2质粒，具体构建步骤如下：

(1)选择步骤2中的段发夹片段作为目的序列，选择pSIH-H1作为干扰载体设计引物，构建shRNA1质粒的引物为shRNA1-F如序列表中SEQ ID NO.14所示，shRNA1-R如序列表中SEQ ID NO.15所示，构建shRNA2质粒的引物为shRNA2-F如序列表中SEQ ID NO.16所示，shRNA2-R如序列表中SEQ ID NO.17所示，上述引物由金唯智生物科技有限公司提供，插入序列的酶切位点5’-BamHI,3’-EcoRI；

(2)退火反应

反应条件为：37度保持30min，95度保持5min,以6度/min速度梯度退火至25度；退火反应体系如下所示：

shRNA1-F或shRNA2-F，100μM，1μl，

shRNA1-R或shRNA2-R，100μM，1μl，

10X T4DNA ligase buffer，1μl，

T4PNK，0.3-0.5μl，

ddH₂O，补齐10μl；

(3)连接

以1μl退火产物加入99μl ddH₂O的比例稀释上述退火产物，按照如下反应体系连接：

pSIH-H1(Bamh1/EcoR1双酶切)，100ng，

Diluted oligo，2μl，

10XT4ligase buffer，2μl，

T4ligase，0.5μl，

ddH₂O，补齐20μl，

连接条件：4℃过夜或37℃3-5h。

(3)转化突变挑克隆送测序。

4、过表达质粒pLVX-IRES-Neo的构建过程

(1)设计引物linc00857-F2和linc00857-R2，linc00857-F2序列如序列表SEQ IDNO.18所示，linc00857-R2序列如序列表SEQ ID NO.19所示，上述引物由金唯智生物科技有限公司提供。

(2)PCR反应

PCR扩增反应体系：

ddH₂0，36μl；

含有linc00857全长的质粒，所述含有linc00857全长的质粒为采用实施例1中获得的长链非编码RNA的cDNA序列合成在pUC载体上(由金唯智生物科技公司合成)，2μl；

linc00857-F2，10μM，1μl；

linc00857-R2，10μM，1μl；

PFU，1μl；

PFU buffer，5μl；

dNTPs，4μl；

PCR反应程序设定：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃2-4kb/min延伸，35个循环，72℃终延伸：10min，最后降温至4℃；

(3)将上述PCR产物纯化后与pLVX-IRES-Neo载体同时双酶切(Not1/Bamh1双酶切)，跑胶纯化，连接，连接体系如下所示：

pLVX-IRES-Neo(Not1/Bamh1双酶切产物)，50ng，

PCR产物(Not1/Bamh1双酶切产物)，50ng，

10*T4ligase buffer，2μl，

T4ligase，1μl，

ddH₂O，补齐20μl，

连接条件：4℃过夜，将连接产物转化挑克隆送测序。

实施例6shRNA质粒干扰肺腺癌细胞测定细胞生长曲线与克隆形成能力

1、将实施例5中构建的shRNA1和shRNA2质粒分别转染至肺腺癌细胞株A549和PC9中，转染具体操作步骤为：

(1)第一天用6cm细胞培养皿铺Lenti-X^TM 293T，使第二天转染时能够达到70-80％；

(2)第二天当细胞密度达到70-80％可以转染时，取两个EP管，质粒在第一个EP管中按照PMD2G:PSPAX2:目的质粒＝1.5ug:3ug:4ug进行混匀，然后在两个EP管中分别加入160μl opti-MEM，再在第二个EP管中加入25.5μl的PEI转染试剂，旋涡混匀，静置5min；

(3)将含有转染试剂PEI的溶液加入质粒中，旋涡混匀，静置15min；

(4)取出细胞，吸弃上清，用PBS(pH)洗一下，加入1.6ml opti-MEM；

(5)将质粒加入细胞；

(6)6h后换液；

(7)第二天铺目的细胞，使第二天感染时能够达到70-80％；

(8)第三天将48h病毒取出，3000rpm离心10min；

(9)取出目的细胞，吸弃上清，加入病毒；

(10)第四天同一时间加入含有puromysin(嘌呤霉素)的DMEM培养基，其中A549细胞使用含有puromysin浓度为1.5ug/ml的培养基，PC9细胞使用含有puromysin致死浓度2ug/ml的培养基，筛选感染成功的阳性细胞。

2、生长曲线及克隆形成

(1)在96孔板中，将各细胞株调整为每100μL中2000个细胞。使用LμMinescent Cell Viability Assay(CTG)每24h测定一次，通过Prism5.0处理数据后得到生长曲线；

(2)分别将所述长链非编码RNA敲降的细胞株按照2000/孔或者1000/孔种植于六孔板中，培养10-14天后，细胞克隆形成，将培养基去掉，用PBS洗一两次，甲醇：乙酸＝3:1处理1h，用结晶紫处理12h以后，用PBS清洗，计数。通过prism5.0处理数据。

shRNA1和shRNA2在A549细胞株中对所述长链非编码RNA的干扰效率如图14所示，两种shRNA质粒对所述长链非编码RNA的干扰效率均在50％以上，可得到所述长链非编码RNA稳定敲降的细胞株；图15所示的生长曲线和图16所示的细胞克隆形成结果显示在所述长链非编码RNA敲降后，A549细胞的细胞增值率和细胞的克隆能力都得到有效抑制，且转染shRNA2质粒的A549细胞获得相对更有效的抑制效果。

shRNA1和shRNA2在PC9细胞株中对所述长链非编码RNA的干扰效率如图17所示，两种shRNA质粒对所述长链非编码RNA的干扰效率均在50％以上，可得到所述长链非编码RNA稳定敲降的细胞株；图18所示的生长曲线和图19所示的细胞克隆形成结果显示在所述长链非编码RNA敲降后，PC9细胞的细胞增值率和细胞的克隆能力都得到有效抑制，且转染shRNA2质粒的PC9细胞获得相对更有效的抑制效果。

上述结果表明shRNA1和shRNA2可明显抑制肺腺癌细胞的生长克隆，可以shRNA质粒为表达载体，使其在癌变部位高表达，用于肺腺癌的基因治疗途径；同时，本实施例所提供的RNAi的靶位点序列以及短发夹片段，可用于抗肺腺癌药物的研发。

实施例7所述长链非编码RNA过表达对肺腺癌的影响

将实施例5中构建的过表达质粒pLVX-IRES-Neo转染到所述长链非编码RNA低表达的人肺腺癌细胞NCI-H1299中，转染方法如实施例6中所述的转染方法(所述转染方法中采用的含有puromysin(嘌呤霉素)的DMEM培养基中，培养基中puromysin为致死浓度700ug/ml)，得到所述长链非编码RNA过表达后的细胞生长曲线(如图21所示)和细胞克隆形成结果(如图22所示)。

图20显示转染了pLVX-IRES-Neo(图20中pLVX-Neo-linc00857)质粒的肺腺癌细胞，所述长链非编码RNA表达量显著性增加，pLVX-IRES-Neo质粒的表达效果好，所述长链非编码RNA过表达后，人肺腺癌细胞NCI-H1299的细胞增值率显著增加(图21所示)，细胞克隆形成能力显著增强(图22所示)，结果显示所述长链非编码RNA的过表达可增加人肺腺癌细胞的恶性程度。

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

<120> 人肺腺癌早期诊断用长链非编码RNA的序列及应用

<130> SHA201700020

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2652

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaggtgtgct ggtgccgggc aggaacggtg ccttgggaca gcctggcccc ggcctcacaa 60

cgggccccgg gcgctcagtc atattccgtg gccgctccaa caccccctac ccccaccagc 120

aggcgcggct ctctttcggg gctggactgc attttttgga catgagtcgg cgagtgaggg 180

tgaaactcag gccaaagtct ccagagccgc tcggagaaaa cgctgcctgg aacagaagag 240

cagaggatca gaggcaccac cagagactct cagagtgggt tattaccctg gtgggggcgc 300

ctgctgcggc gtaggagatg gcgggactgg gggcgcgggt gtgaagcccc caagaaatct 360

gtgtgaattt cctggggagg taaggtctcc aggcgctctc tctgggcccg gggattggtc 420

cgggaaggtc tcctggcgcc tacccagccc ccactgcctg gacgcctgcg cctgctctgc 480

cgccccacag cgaccgcgaa ggccagcttc ttcgaaaggc ccatttttct ccgtggctga 540

gcgaatgctc ctagaatacc acgtttataa taaatcatgt agggtggaat tcctgctgga 600

tgtatacacc tttctgcatc agagctcttc aaacccagaa tggtgaatag ctacccctgg 660

gcttaccctt ttataatttt caacaaacct gcgtttagcc ccggctaggt gccagcaagt 720

tgctagggac tgaggaggct ctgcagagga cccgagctga ggccctaatc ctcaaggcca 780

atggcagggg tcaccgccca ggcaccccca gagaacgcgg tgtgaaggaa aagacaccaa 840

actcggtgtt caaatgtgtg ggatctattc tagttctgat tctgacactt gcaagtcatg 900

catcctccga gcctcggctt tctcacctat aaaatcttca acgtgaccta taaaaatcca 960

taaaatcacc cctgcttcat tgtttcccag ggctcataga aacatcatac aaggtggaga 1020

agagtaccca agaaggacaa gcttggaatg gggccccctc cccaggctgg agatcagaca 1080

ttgttggaga aggtatcatt gcagccccct acatagcaga gagatttgct gagttgcata 1140

gtctagagct ggttgcaatt attggacaag caggaaacaa acctccacag cccatgcgag 1200

ccacactgct gggttgagtg tatgagcatg tagaatgatt gggtctccag tgcggacaga 1260

aggcatggat cgcgtggtgc ctgtgttggg aggatactaa gagggcgatc accatgccag 1320

gacaagacta gttgcctggg atcttctggg cacgtgactg gagcagagta ccactggatc 1380

tcctcacacc agccagaccc aggaagagaa gctcctttca cctgcactgt tctctcagca 1440

ccctccacgg agaaagcttc atgttatgct tagtgtacag gagaaatgct catgggaatc 1500

ctgtccatta tcacagagca ggtattagtg ggtgaatatg gagctgagaa gtaataagtt 1560

gtaactggca tagatatcat ggggatattt gaagaacgct gtgaacacat atgcatgggt 1620

ccatgtattc atgagtgtgc acatatgtgt aattattcat acaattcatg gtggatacta 1680

cttcgagggt gttcacagac cccaggcaga gagcgcctgg agggaaaatt atccaaggca 1740

ggcccattca tagttccagg acagccagaa gaaagcctcc gttaagcacc agaagtctcc 1800

ggggcaggtg gggccaggca gcatgaaaga attggccgca agagttccaa accctgtccc 1860

aattatggag ggtgactttt ctttgtcctc cttctccatt cccttccata ttgctcatgc 1920

atccaaaggg agacctgaag actctctagc agggcaaggc cattttcttt tggcattttt 1980

ctctccccag agtctagctg attatcagct tagacacaca gcaggctatg tgctgtgaac 2040

aacaggcatc ctgggttatt ttacaaactc atggatagtc attttgaaac cacctttgca 2100

aaattgtgac tgaaacagtg aaagagagct aacttaacca gctccatctt gtttctaacc 2160

tccaagctgt ctttgttcat tcctgggcgt aggctgaact aactttggga gaaacttagt 2220

ttgtagttat agtttaaaca aagactgtga cagccctttc ccaatgcaga cctccttctt 2280

gtctggggac tagactaaca ttagccacag gattagaaat tacggtttag gagtcacgca 2340

gctggaggct acaagattct gaccctccct aaactgcttc taagatcagt gcttgagaca 2400

tgttgcagac cccgcacttg ctggatcagc tgacgccaca cagatggata aactgcctcg 2460

tctgatcttg tggcccccac ccgggaactg acgaagcgca agaagacagc ttcgactccc 2520

tgtgagttca tccctgacca accagcactc ctggctcact ggcttccccc taccaagtta 2580

tgcttaaaaa ttctgctccc cgaattctcg aggagactga tttgagtgat aataaaactc 2640

cagtctcccg ct 2652

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagcagagga tcagaggcac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagaccttcc cggaccaatc 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acccgagctg aggccctaat cct 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgcctggggt ctgtgaacac cct 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tggggccagg cagcatgaaa gaat 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgcctgttgt tcacagcaca tagcc 25

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gttccaaacc ctgtcccaat tatggag 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tagcctgctg tgtgtctaag ctgataa 27

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

gttgagtgta tgagcatgta gaatgattg 29

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

ggtattagtg ggtgaatatg g 21

<210> 12

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gatccgttga gtgtatgagc atgtagaatg attgttcaag agacaatcat tctacatgct 60

catacactca acttttttg 79

<210> 13

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gatccggtat tagtgggtga atatggttca agagaccata ttcacccact aatacctttt 60

ttg 63

<210> 14

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatccgttga gtgtatgagc atgtagaatg attgttcaag agacaatcat tctacatgct 60

catacactca acttttttg 79

<210> 15

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aattcaaaaa agttgagtgt atgagcatgt agaatgattg tctcttgaac aatcattcta 60

catgctcata cactcaacg 79

<210> 16

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gatccggtat tagtgggtga atatggttca agagaccata ttcacccact aatacctttt 60

ttg 63

<210> 17

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aattcaaaaa aggtattagt gggtgaatat ggtctcttga accatattca cccactaata 60

ccg 63

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atatgcggcc gcgaggtgtg ctggtgccg 29

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gcgcggatcc agcgggagac tggagtttta ttatcactc 39

Claims

1.一种长链非编码RNA，其特征在于，所述长链非编码RNA的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种可特异性识别如权利要求1所述的长链非编码RNA的引物组，其特征在于，所述引物组包括如下引物：

引物GSP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

引物GSP2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

引物GSP3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

引物GSP4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

引物GSP5，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

引物GSP6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.一种制备如权利要求1所述的长链非编码RNA的全长cDNA序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取肺癌细胞总RNA；

2)以步骤1)中提取的总RNA反转录为cDNA，以所述cDNA为模板，利用权利求2中所述的引物组扩增linc00857特异片段，将所述扩增的linc00857特异片段克隆至载体上，然后进行测序验证所述序列的正确性；

7)将上述步骤4)得到的3’末端片段和步骤6)所得到的5’末端片段拼接得到所述长链非编码RNA的全长cDNA序列。

4.权利要求1所述的长链非编码RNA在制备早期诊断或治疗人肺腺癌的产品中的用途。

5.一种引物对，其特征在于，所述引物对用于检测权利要求1所述的长链非编码RNA在细胞和组织中的表达水平；所述引物对包括上游引物linc00857-F和下游引物linc00857-R，所述上游引物linc00857-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述下游引物linc00857-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

6.一种用于人肺腺癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述的引物对。

7.一种用于人肺腺癌早期诊断的qRT-PCR反应体系，其特征在于，包括：

Green dye，10μL；

权利要求5中所述的上游引物linc00857-F，10μM,0.4μL；

权利要求5中所述的下游引物linc00857-R，10μM,0.4μL；

ROX，0.4μL；

模板，2μL；

dH₂O，6.8μL。

8.一种如权利要求1所述的长链非编码RNA的RNAi靶位点的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示。

9.一种可用于权利要求1所述的长链非编码RNA序列RNAi用的短发夹片段，其特征在于，所述短发夹片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

10.权利要求8所述的RNAi靶位点的核苷酸序列或权利要求9所述的RNAi用的短发夹片段在制备治疗肺腺癌疾病的药物中的用途。

11.包含权利要求1、8或9所述的核苷酸序列的载体。