KR102072562B1

KR102072562B1 - 인터넷 게임 장애 진단용 조성물 및 진단을 위한 정보제공 방법

Info

Publication number: KR102072562B1
Application number: KR1020180074326A
Authority: KR
Inventors: 정연준; 이민호; 정승현
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2018-06-27
Filing date: 2018-06-27
Publication date: 2020-02-03
Also published as: KR20200001402A

Abstract

본 발명은 순환 miRNA를 바이오 마커로서 이용하여 비침습적인 방법으로 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder) 여부를 진단할 수 있는 조성물 및 그 용도에 관한 것으로, 본 발명의 인터넷 게임 장애 진단용 조성물에 의하면, 순환 miRNA를 혈장 등에서 검출할 수 있기 때문에 외과적 시술 없이 간단한 혈액 검사만으로 인터넷 게임 중독 여부를 진단할 수 있고, 순환miRNA의 발현 수준에 따른 판단 기준을 제공함으로써 인터넷 게임 장애를 신속하고 정확하게 진단할 수 있으며, 나아가 상기 순환 miRNA는 인터넷 게임 장애에 대한 바이오 마커로 활용될 수 있기 때문에 miRNA를 타겟으로 한 게임장애 치료용 물질의 스크리닝 또는 게임장애를 예방하거나 치료하기 위한 새로운 방법에 활용될 수 있다.

Description

인터넷 게임 장애 진단용 조성물 및 진단을 위한 정보제공 방법 {Composition for diagnosis of internet gaming disorder and method of providing information for diagnosis thereof}

본 발명은 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder, IGD)를 진단할 수 있는 마커 및 그 용도에 관한 것이다.

인터넷 엑세스 인프라가 구축되어 있는 국가에서의 인터넷 및 인터넷기반 게임의 중독적 사용은 사회적 현상이 아닌 인터넷 게임 장애(Internet gaming disorder; IGD)라고 하는 잠재적인 정신적 장애이다. 역학적 보고에 따르면 청소년의 IGD의 발병률은 나라별로 0.8 내지 26.7% 범위에서 발생하는데, 특히, 한국, 중국, 대만, 홍콩, 싱가포르 등 많은 아시아 국가에서는 10% 이상에 해당한다. IGD는 인지, 심리적-사회적 관계 및 학업 또는 직무수행 능력등 일상생활에 대한 장애와 관련있다. 현재 IGD는 정신 장애 진단 및 통계 메뉴얼의 다섯번째 개정판(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders; DSM-V)의 섹션 Ⅲ(추가적인 연구의 조건)에 포함되어 있다. 그러나, 이의 임상적-사회적 중요성에도 불구하고 IGD의 분자유전학적 메커니즘에 대하여는 알려진 바 없다.

신경행동 표현형이 유전적인 요인 외에도 마이크로 RNA(micro RNA; miRNA)를 포함한 비코딩 RNA에 의해 후발생적으로 조절될 수 있는 것으로 알려져 있다. miRNA는 작은 비코딩 단일가닥 RNA 분자(약 20-23개의 뉴클레오타이드 길이)인데, 이는 mRNA를 분해함으로써 단백질 코딩 유전자의 발현을 부정적으로 조절하고, 다양한 질병의 병리생리학적 과정에서 중요한 역할을 하고 있다. miRNA가 인간 중추 신경계(central nervous system; CNS)에 풍부하고, CNS의 발달과 성숙에 관여하는 표적 유전자의 발현 수준을 미세하게 조정한다는 증거가 있다. 게다가 최근의 연구에 따르면 miRNA 발현 프로파일이 정신 질환자의 뇌 조직에서 변형되어 발현 프로파일이 정신 질환의 생체 표지 물질이 될 수 있다고 한다. 다만, 인간의 중추 신경계에 대한 생검은 불가능하므로 사후에 분석해야 하는 한계점이 분명히 존재한다.

공개논문 "Heritability of compulsive Internet use in adolescents."(Addict Biol. 2016 Mar;21(2):460-8) 에서는 네덜란드 청소년 중 일란성 또는 이란성 쌍둥이들을 대상으로 강박적인 인터넷 사용여부를 조사한 결과, 차이점 중 48%가 유전적인 요인과 관련이 있음을 개시하고 있다. 다만, 인터넷 또는 게임 중독 등의 인터넷 게임 장애를 진단할 수 있는 분자 마커는 아직까지 알려져 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 miRNA를 이용하여 인터넷 중독 내지 게임 중독 등의 인터넷 게임 장애를 예측 내지 진단할 수 있는 조성물을 제공하기 위하여 노력한 결과, 혈장 등에서 수득한 순환 miRNA(circulating miRNA)의 발현량을 측정하여 비침습적인 방법으로 인터넷 게임 장애를 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인터넷 게임 장애 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 인터넷 게임 장애의 진단에 필요한 정보제공방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-483-5p 및 hsa-miR-652-3p으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 순환 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 인터넷 게임 장애 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 hsa-miR-26b-5p 는 서열번호 1, hsa-miR-125b-5p 는 서열번호 2, hsa-miR-200c-3p 는 서열번호 3, hsa-miR-337c-5p 는 서열번호 4, hsa-miR-483-5p 는 서열번호 5 및 hsa-miR-652-3p 는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제제는 상기 순환 miRNA와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프로브 및 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 인터넷 게임 장애 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 a) 진단 대상으로부터 분리된 시료에서 순환 miRNA(circulating miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 대응하는 순환 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계; 를 포함하는 인터넷 게임 장애 진단을 위한 정보제공 방법으로서,

상기 순환 miRNA는 hsa-miR-483-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p 및 hsa-miR-652-3p으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder) 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계 이후 인터넷 게임 장애로 진단하는 단계를 추가적으로 포함하는 정보제공 방법으로서,

상기 진단하는 단계는 hsa-miR-483-5p의 발현수준이 정상 대조군에 비하여 상향조절되거나, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p 또는 hsa-miR-652-3p의 발현수준이 정상 대조군에 비하여 하향조절되는 경우 인터넷 게임 장애로 판단하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액 및 양수로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 측정은 서던 혼성화(Southern hybridisation), 노던 혼성화(Northern hybridisation), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역전사효소 PCR (RT-PCR), 정량적인 실시간 PCR (qRT-PCR), 디지털 PCR(dPCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 자동방사성측정 및 인 시츄 혼성화(in situ hybridisation)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 인터넷 게임 장애 진단용 조성물 또는 키트에 의하면, 순환 miRNA를 혈장 등에서 검출할 수 있기 때문에 외과적 시술 없이 간단한 혈액 검사만으로 인터넷 게임 중독 여부를 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 인터넷 게임 장애 진단을 위한 정보제공방법에 의하면 마커의 발현 수준에 따른 판단 기준을 제공함으로써 인터넷 게임 장애를 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.

더욱이, 상기 순환 miRNA는 인터넷 게임 장애에 대한 바이오 마커로 활용될 수 있기 때문에 miRNA를 타겟으로 한 게임장애 치료용 물질의 스크리닝 또는 게임장애를 예방하거나 치료하기 위한 새로운 방법에 활용될 수 있다.

도 1은 인터넷 게임 장애 진단(IGD)에 사용할 수 있는 miRNA를 검출하기 위한 본 발명의 2단계 접근방법을 나타낸다. 첫번째 단계는 miRNA 어레이(array) 방법에 기초한 발견(discovery)단계로서 정상대조군과 IGD군에서 다르게 발현하는 miRNA를 발견하고, 두번째 단계에서는 qRT-PCR 방법에 기초한 검증(validation)단계로서 첫번째 단계에서 발견한 miRNA들이 IGD에 미치는 영향 및 관계를 qRT-PCR로 검증하고, IGD를 진단하는데 사용할 수 있는 miRNA 분류를 확정한다.
도 2는 정상대조군과 IGD군에서 다르게 발현하는 순환 miRNA들의 발현량을 나타낸다. 가장 안정적으로 발현한 miR-374b-5p를 기준으로 표준화하였다.
도 3은 발현이 하향조절된 순환 miRNA 갯수에 대한 교차비(odd ration; ORs)를 나타내며, 발현이 하향조절된 순환 miRNA 갯수가 많아질수록 IGD에 해당할 위험성이 높아진다. 3가지 순환 miRNA의 발현이 모두 하향조절될 경우, 발현이 하향조절된 순환 miRNA가 없는 경우에 비하여 IGD에 해당할 위험성은 22배 높은 것으로 나타났다.
도 4는 타겟 유전자와 관련된 단백질 발현에 대한 웨스턴 블랏 결과 및 박스 플롯을 나타낸다. (A)는 DPYSL2 를, (B)는 GABRB2 를 나타내며, 모두 IGD 군에서 높게 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 용어를 설명한다.

본 발명의 "인터넷 게임 장애(Internet gaming disorder)"는 인터넷 중독 또는 인터넷을 기반으로 하는 게임 중독을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 "순환 miRNA(circulating miRNA)"는 모든 생물학적 순환액에서 발견되는 마이크로 RNA(micro RNA)를 의미한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 기술에서는 정신적 질환을 miRNA 등 바이오 마커 스크리닝 관점에서 접근할 경우 중추 신경계 조직의 생검은 불가능하여 사후에 조직을 수득하여 분석해야만 하는 한계점이 존재하였다. 또한, 인터넷 게임 장애와 유전적 요인과의 관련성만을 연구하였을 뿐 miRNA 등 분자적 관점에서는 연구된 바 없다.

본 발명에 따른 혈장 등에서 수득한 순환 miRNA 의 발현량을 분석하여 인터넷 게임 장애 여부를 진단할 수 있는 조성물은 비침습적이므로 인터넷 게임 장애 진단용 조성물, 키트 또는 진단을 위한 정보제공 방법으로서 효과적이다.

일 측면에서, 본 발명은 혈액, 혈장 등에서 비침습적인 방법으로 수득한 순환 miRNA(circulating miRNA) 중, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-483-5p 및 hsa-miR-652-3p로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 순환 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder) 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 순환 miRNA는 hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-483-5p 및 hsa-miR-652-3p으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-483-5p 및 hsa-miR-652-3p으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-200c-3p 및 hsa-miR-652-3p으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 가장 바람직하다.

상기 순환 miRNA의 발현수준을 측정하는 것은 인터넷 게임 장애 환자의 경우 정상인과 비교하여 일부 순환 miRNA의 발현량이 상이하기 때문에 이를 기준으로 하여 인터넷 게임 장애 여부를 진단하기 위함이다. 구체적으로, 상기 hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-200c-3p 또는 hsa-miR-652-3p 중 발현이 하향조절되는 순환 miRNA가 존재하는 경우 인터넷 게임 장애의 위험성이 있으며(실시예 3, 도 2), 만일 모두 하향조절되는 경우 상승효과가 발생하여, 모두 정상적으로 발현하는 경우에 비하여 인터넷 게임 장애의 위험성이 약 22배 증가할 수 있다(실시예 4, 도 3).

상기 순환 miRNA는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액 또는 양수에서 수득할 수 있으나 체내의 순환액이라면 제한없이 시료로서 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 hsa-miR-26b-5p 는 서열번호 1, hsa-miR-125b-5p 는 서열번호 2, hsa-miR-200c-3p 는 서열번호 3, hsa-miR-337c-5p 는 서열번호 4, hsa-miR-483-5p 는 서열번호 5 및 hsa-miR-652-3p 는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 제제는 상기 순환 miRNA와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프로브 및 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 순환 miRNA와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 순환 miRNA의 염기서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 프로브 또는 프라이머를 제작할 수 있다.

상기 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 족하다.

상기 프로브는 특정 서열과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling) 되어 있어서 특정 서열의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder) 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다 상기 키트는 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 진단 대상으로부터 분리된 시료에서 순환 miRNA(circulating miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 대응하는 순환 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계; 를 포함하고,

본 발명의 상기 b) 단계 이후 인터넷 게임 장애로 진단하는 단계를 추가적으로 포함하는 정보제공 방법으로서,

상기 진단하는 단계는 hsa-miR-483-5p의 발현수준이 정상 대조군에 비하여 상향조절되거나, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p 또는 hsa-miR-652-3p의 발현수준이 정상 대조군에 비하여 하향조절되는 경우 인터넷 게임 장애로 판단하는 것이 바람직하다.

상기 hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-200c-3p 또는 hsa-miR-652-3p 중 발현이 하향조절되는 순환 miRNA가 존재하는 경우 인터넷 게임 장애의 위험성이 있으며, 만일 모두 하향조절되는 경우 상승효과가 발생하여, 모두 정상적으로 발현하는 경우에 비하여 인터넷 게임 장애의 위험성이 약 22배 증가할 수 있다(실시예 4, 도 3).

본 발명의 상기 a) 단계의 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액 및 양수로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 체내 순환액이라면 제한없이 시료로서 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 a) 단계의 측정은 서던 혼성화(Southern hybridisation), 노던 혼성화(Northern hybridisation), 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역전사효소 PCR(RT-PCR), 정량적인 실시간 PCR(qRT-PCR), 디지털 PCR(dPCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 자동방사성측정 및 인 시츄 혼성화(in situ hybridisation)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 정량적인 실시간 PCR(qRT-PCR) 방법을 사용하는 것이 바람직하나, DNA 또는 RNA 등의 유전자를 검출하기 위한 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

연구대상 선정 및 분석

3,166명의 청소년(12세 내지 18세)을 대상으로 설문조사를 실시하여 정신 장애 진단 및 통계 메뉴얼(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders; DSM-V)의 인터넷 게임 중독(Internet gaming disorder; IGD) 점수를 사용하여 IGD 여부를 진단하였다. 모든 참가자들은 한국 아동의 정서 장애 및 정신 분열증 편성(Korean Kiddie Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia; K-SADS-PL)에 기초한 정신과의사의 구조화 된 인터뷰를 받았으며, 한국 웩슬러 아동 지능 검사 제4판(Korean-Wechsler Intelligence Scale for Children IV; K-WISC-IV)의 Block Design 및 Vocabulary 하위 테스트를 완료했다. 충동성은 바렛 충동성 스케일(Barratt Impulsiveness Scale; BIS)으로, 성격차원은 행동 저해 시스템(Behavioral Inhibition System; BInS)과 행동 활성화 시스템(Behavioral Activation System; BAS)으로 측정하였다. 만일 과거 또는 현재에 주요한 의학적 장애(예: 당뇨병), 신경학적 장애(예: 발작 장애, 두부 손상), 정신 장애(예: 주요 우울 장애, 불안 장애) 또는 약물 남용(예: 담배, 대마초, 알코올) 등의 증상이 있는 경우 연구대상에서 제외하였다. 이 연구는 가톨릭 의과대학의 임상 시험위원회(MC16SISI0120)의 승인을 받았으며, 모든 참가자와 부모는 서면 동의서를 제출했다. 결과적으로 87명(IGD 환자 45명, 대조군 42명)이 연구대상자로 선정되었는데, 그 중 51명(IGD 환자 25명, 대조군 26명)은 발견군(discovery)으로서 2014년도부터 2016년까지 연구에 참여하였고, 36명(IGD 환자 20명, 대조군 16명)은 검증군(validation)으로서 2016년에만 연구에 참여하였다. 모든 연구대상자는 서울 성모병원과 서울대학교 보라매 병원에 등록된 한국인이었다.

상기 연구대상자 87명의 특징은 하기 [표 1]에 나타내었다. IGD 환자와 대조군은 KS(Korean Internet Addiction Proneness Scale) 및 매주 인터넷 게임에 소비된 시간 외에 나머지 검사 결과에서는 유의한 차이가 없었다.

IGD와 대조군의 miRNA 발현량 비교

IGD와 관련된 miRNA를 발견하기 위하여 2단계 접근 방법(발견 및 독립적 검증)을 사용하였다(도 1). 그 첫번째 단계로서 발견군과 대조군에서 다르게 발현되는 miRNA를 확인하고자 하였다.

구체적으로, TaqMan Low Density miRNA Arrady(TLDA) 방법을 사용하였다. 각 연구대상자로부터 수득한 말초혈액을 실온에서 10분동안 3000rpm으로 원심분리하여 상층액(혈장층)을 분리하였다. 50 ㎕의 혈장 샘플에서 TaqMan miRNA ABC 정제 키트(Human Panel A, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 순환 miRNA를 추출하였다. 추출한 순환 miRNA를 표적 특이적 항 miRNA 자석 비드와 혼합한 후, 결합한 순환 miRNA를 100 ㎕의 용출 완충액으로 비드로부터 용리시켰다. 384개의 miRNA가 포함된 TaqMan miRNA ABC 정제 키트(Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 51개 샘플(IGD 25개, 대조군 26개)의 miRNA 발현 프로파일을 분석하였다. 그 후, MegaplexPreAmp Primers Human Pool A 및 TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 Megaplex 역전사 및 사전 증폭 반응을 수행했다. TLDA panel A v2.0(Thermo Fisher Scientific)을 ViiA7 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 실행하여 얻은 miRNA 발현에 대한 데이터는 ExpressionSuite Software v1.0.4(Thermo Fisher Scientific)로 분석하여 임계사이클(threshold cycle; Ct) 값을 결정했다.

상기 Ct 값이 35를 초과하는 miRNA는 탐지 불가능한 것으로 보아 후속 분석에서 제외되었다. 모든 Ct 값은 가장 안정하게 발현된 miRNA 중 하나인 miR-374b의 Ct 값(ΔCt 값)으로 표준화되었다. 발현의 log2 변화비(fold-change ratio)(ΔΔCt 값)는 Bioconductor에서 HTqPCR 패키지의 캘리브레이터(calibrator)로서 대조군의 평균값을 사용하여 계산하였다. 두 그룹 사이의 발현 차이를 가상적으로 테스트하여 배치 효과(batch effect) 등의 이질성을 포착하기 위해 Bioconductor에서 sva 패키지를 사용하여 대리결과변수(surrogate variable analysis; sva)를 적용했다. P 값이 0.05 미만인 miRNA는 두 그룹 간에 유의한 발현차이가 있는 것으로 간주하였다.

그 결과, 하기 [표 2]에 나타나있는 10개의 miRNA의 발현 수준이 IGD 군와 대조군간의 차이가 있는 것을 확인하였다. 그 중 IGD 군에서는 두 miRNA(hsa-miR-423-5p 및 hsa-miR-483-5p)가 상향 조절되었고 8개의 miRNA(hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p 및 hsa-miR-652-3p)는 IGD 군에서 하향 조절되었다.

후보 miRNA의 qRT-PCR 검증

2단계 접근방법의 두번째 단계로서, 상기 [실시예 2]에서 선택한 10개의 후보 miRNA를 검증하기 위해 검증군(IGD군 20개, 대조군 16개)에 대하여 qRT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, TaqMan MicroRNA Assay(miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p, #000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5p, #002340; miR-483-5p, #002338; miR-652-3p, #002352) 및 ViiA7 시스템(Life Technologies))을 사용하였다. TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(# 4366596, Life Technologies)를 사용하여 10ng의 전체 RNA를 miRNA 특이적 프라이머를 사용하여 첫번째 cDNA가닥으로 전환시킨 후 TaqMan Probes를 사용하여 실시간 PCR을 수행했다. 각 miRNA의 상대적 양은 2^- ^ΔCt로 계산하였는데, 여기서 ΔCt는 대상 샘플에 대한 임계 사이클의 차이이며 miR-374b-5p에 대해 표준화되었다. 모든 PCR 반응은 3 중으로 수행하였고, 이들의 Ct 값을 평균하였다. 상기 [실시예 2]와 동일한 방식으로 각 miRNA의 log2 변화비(fold-change ratio)(ΔΔCt)를 계산했다. Non-parametric Mann-Whitney-Wilcoxon 테스트를 수행하여 임계 P 값이 0.05 인 두 그룹의 miRNA 발현 차이를 테스트했다.

그 결과, IGD 군에서는 hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p, hsa-miR-337c-5p 및 hsa-miR-125b-5p는 발현이 하향 조절되었으며, hsa-miR-483-5p은 상향 조절되었다. 상기 6개의 순환 miRNA의 서열정보는 하기 [표 3]과 같다. 나머지 4개의 miRNA(hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p 및 hsa-miR-423-5p)는 상기 [실시예 2]의 결과와 상이하게 확인되었다.

순환 miRNA	염색체 내 영역	위치	서열	뇌에서의 발현 수준	서열번호
hsa-miR-26b-5p	2q35	Intron	UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU	Moderate	1
hsa-miR-125b-5p	21q21.1	Intergenic	UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA	-	2
hsa-miR-200c-3p	12p13.31	Intergenic	UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA	None	3
hsa-miR-337c-5p	14q32.2	Intergenic	GAACGGCUUCAUACAGGAGUU	-	4
hsa-miR-483-5p	11p15.5	Intron	AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG	-	5
hsa-miR-652-3p	Xq22.3	Intron	AAUGGCGCCACUAGGGUUGUG	None(Moderate in Mouse)	6

IGD 위험성에 대한 세 가지 miRNA 동시 변형의 상승효과

세 가지 miRNA의 복합적인 효과를 평가하기 위해 네 개의 하위 그룹(0, 1, 2 또는 3 miRNA 변경)의 교차비(odds ratio; OR)를 관찰했다. miRNA 변형은 각 miRNA 표적의 상대적인 양(relative quantity; RQ)으로 확인하였는데, 이는 2^- ^ΔΔCt로 계산되었다. 세 miRNA 마커 모두 IGD 군에서 하향조절 되었기 때문에 RQ 값이 1 미만인 miRNA는 변경된 것으로 간주하였다. 확률(odds)는 miRNA 변형 갯수별로 IGD군의 인원수에 대한 대조군의 인원수 비율로 계산하였으며, 각 OR은 miRNA 변형이 없는 하위 그룹의 확률로 각 하위 그룹의 확률을 나눠 계산하였다.

그 결과, 세 miRNA의 변형이 있는 경우 어떤 변형도 없는 경우에 비하여 22배 이상 높은 IGD 위험성을 나타냈다(OR 22, 95 % CI 2.29-211.11). OR는 변형된 miRNA 수가 0에서 3(r²=0.996)으로 늘어갈수록 증가하는 추세를 보였다(도 3).

후보 miRNA의 표적 유전자의 GO 및 경로 분석

IGD 군에서 발현이 하향 조절된 3가지의 miRNA 마커의 기능을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 4가지 알고리즘(miRWalk, miRanda, RNA22 및 Targetscan)을 이용하여 miRWalk 2.0 데이터베이스 기반으로 3가지의 miRNA의 대상 유전자를 예측하였다. 또한 ToppGene Suite의 ToppFu을 이용한 유전자 세트 농축 분석(Gene set enrichment analysis)을 이용하여 대상 유전자의 Gene Ontology(GO) 용어, 경로 및 질병 조건을 확인하였다. 경로 분석은 ToppGene 경로의 KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP 및 MSigDBin에 따라 예측된 표적 유전자의 중요한 경로를 찾는데 사용되었다. 기능적 농축 조건의 중요도는 Bonferroni 보정 P 값에 근거하여 결정되었다.

그 결과, 총 1,230개의 유전자가 다운스트림 타겟으로 일관되게 예측되었으며, 그 중 140개가 2개 이상의 miRNA에서 모두 발현하는 것으로 예측되었다. 또한, 유전자 세트 농축 분석 결과 상기 miRNA의 표적 유전자는 "Axon 유도"와 같은 신경 발달 경로와 "신경 발생"과 같은 GO 용어와 유의하게 연관되어 있는 것을 확인하였다.

hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p 또는 hsa-miR-652-3p 중에서 2개 이상의 miRNA에서 발현할 것으로 예측된 단백질은 다음과 같다: ABL2, AFF3, AGPS, APAF1, ATP11C, ATRX, BRWD1, CCDC50, CDC73, CDK6, CELF1, CEP350, CERS6, CFLAR, CHML, CHRNB2, CHST11, CLASP2, CNOT6L, CPED1, CPM, CREBRF, DNA2, DOCK4, DPYSL2, DUSP4, EIF5, EPM2AIP1, ERBB4, FAM105B, FAM46C, FAM84A, G2E3, GFPT1, GJC1, GMFB, GSE1, HDAC4, HEG1, INTS7, ITGA10, ITGA2, KDM5A, KLHL42, KPNA6, LMBR1, LOX, LTN1, MALT1, MAP1B, MAP2, MAP3K13, MBNL3, MEF2D, MIER3, MKLN1, MOB1B, MYO9A, NAB1, NCEH1, NCOA4, NIPA1, NRIP1, NRIP3, NRXN1, NTRK2, NUFIP2, ONECUT2, OSGIN2, OTUD6B, PELI2, PI15, PIKFYVE, PIP4K2B, PLAG1, PPM1H, PPP1R12B, PPP1R9A, PRLR, PRTG, PTGER3, PTP4A1, RAB18, RASA2, RBM20, RBM46, REEP3, RPL28, RTF1, SCN9A, SH3BP2, SH3PXD2A, SHROOM4, SLC12A2, SLC26A2, SLC30A7, SLC35B4, SLC38A2, SLC4A7, SLC5A3, SLIT1, SMAD2, SOCS6, SOGA3, SPTBN1, SSR1, ST8SIA3, TAF12, TBC1D15, TET2, THAP2, THRB, TROVE2, UBE2W, UBN2, USH2A, USP15, USP25, VGLL3, WNT5A, WPO4, ZCCHC24, ZFAND5, ZFX, ZNF148, ZNF451, ZNF555, ZNF662, ZNF704, ZNHIT6, CHST3, CNR1, GABRB2, IVD, MDM4, PCCB, PURB, SERBP1, SLC7A1, TMEM33 및 UHRF1BP1. 이 중 3가지의 miRNA에서 모두 발현할 것으로 예측되는 단백질은 DUSP4와 PI15 이다.

예측된 타겟 유전자의 발현

다운스트림 타겟 유전자의 단백질 발현 수준이 IGD와 대조군간에 차이가 있는지 여부를 알아보기 위해 3가지 miRNA 모두의 다운스트림 타겟에 해당하는 유전자의 단백질 중에서 2가지(DUSP4와 PI15)를 선택하고, 2가지 miRNA의 다운스트림 타겟에 해당하는 유전자의 단백질 중에서 3가지(GABRB2, DPYSL2 및 CNR1) 유전자를 선택했다. 이들을 28 개의 IGD와 28 개의 대조군의 혈장 샘플을 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하여 밴드 강도와 면적을 측정하여 IGD군과 대조군 사이의 다섯 가지 표적의 발현을 비교했다.

구체적으로, 각 혈청 시료는 웨스턴 블랏을 수행하기에 앞서 MARS-14 칼럼(4.6 x 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 14개의 풍부한 단백질(알부민, 면역 글로불린 G, 면역 글로불린 A, 세로토니어, 합토글로빈, 알파-1 항트립신, 피브리노겐, 알파-2 마크로글로불린, 알파-1 산 당단백질, 면역 글로불린 M, 아포리포단백질 AI, 아포지단백질 A-II, 보체 C3 및 트란스타이레틴)을 제거하였다. 상기 14개의 단백질이 제거된 혈청시료를 Amicon Ultracel-3 원심 분리 필터(3 kDa cutoff)를 사용하여 농축시킨 후, 비신코닌 산(bicinchoninic acid) 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 동일한 양 (10 ~ 30 ㎍)의 대조군과 IGD 혈청 샘플을 4 ~ 20 % Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔(Bio-Rad, CA, USA)에서 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오리드 막(polyvinylidene difluoride membrane)으로 옮겼다.

그 후, 상기 막을 실온에서 30 분 동안 5 % 탈지 분유로 TBS-T(190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 및 0.05 % Tween 20)에서 블락시켰다. 그 후 막에 DPYSL2(1:500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2(1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), CNR1(1:100, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), DUSP4 (1:500, MybioSource, San Diego, CA, USA) 및 PI15 (1:500, MybioSource, San Diego, CA, USA)에 대한 1차 항체를 처리하고 4℃에서 TBS-T와 5%의 탈지 분유를 함께 하루 동안 배양하였다. 그 후 상기 배양한 막에 2차 항체로서 bovine anti-mouse antibody(1:1,000, Santa Cruz Biotechnology) 또는 goat anti-rabbit antibody(1:1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA)를 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지 및 처리하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 신호 검출은 ECL 시약(GE healthcare, Piscataway, NJ, USA)으로 화학 발광을 사용하여 수행한 후, TotalLab 1D 분석 소프트웨어 (Non-linear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK)를 사용하여 웨스턴 블랏 결과를 정량화했다.

그 결과, DPYSL2(IGD 28개, 대조군 28개, P=0.0037)와 GABBR2(IGD 27개, 대조군 28개, P=0.0052)의 발현 수준은 IGD 군에서 유의하게 높았다(도 4). 그러나 CNR1(P=0.0853), DUSP4(P=0.5443) 및 PI15(P=0.6346)은 발현의 차이점을 관찰할 수 없었다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for diagnosis of internet gaming disorder and method of providing information for diagnosis thereof <130> 1063865 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-26b-5p <400> 1 uucaaguaau ucaggauagg u 21 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-125b-5p <400> 2 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-200c-3p <400> 3 uaauacugcc ggguaaugau gga 23 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-337c-5p <400> 4 gaacggcuuc auacaggagu u 21 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-483-5p <400> 5 aagacgggag gaaagaaggg ag 22 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-652-3p <400> 6 aauggcgcca cuaggguugu g 21

Claims

hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-483-5p 및 hsa-miR-652-3p으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 순환 miRNA(circulating miRNA)의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder, IGD) 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 hsa-miR-26b-5p 는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, hsa-miR-125b-5p 는 서열번호 2 의 염기서열로 이루어지고, hsa-miR-200c-3p 는 서열번호 3 의 염기서열로 이루어지고, hsa-miR-337c-5p 는 서열번호 4 의 염기서열로 이루어지고, hsa-miR-483-5p 는 서열번호 5 의 염기서열로 이루어지고, hsa-miR-652-3p 는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 인터넷 게임 장애 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제제는 상기 순환 miRNA와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프로브 및 프라이머로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 인터넷 게임 장애 진단용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder) 진단용 키트.
a) 진단 대상으로부터 분리된 시료에서 순환 miRNA(circulating miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 대응하는 순환 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계; 를 포함하고,
상기 순환 miRNA는 hsa-miR-483-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p 및 hsa-miR-652-3p으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder) 진단을 위한 정보제공 방법.
제5항에 있어서, 상기 b) 단계 이후 c) 단계로서, 상기 hsa-miR-483-5p의 발현수준이 정상 대조군에 비하여 상향조절되거나, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p 또는 hsa-miR-652-3p의 발현수준이 정상 대조군에 비하여 하향조절되는 경우 인터넷 게임 장애로 판단하는 단계; 를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 인터넷 게임 장애 진단을 위한 정보 제공 방법.
제5항에 있어서, 상기 a) 단계의 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액 및 양수로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인터넷 게임 장애 진단을 위한 정보제공 방법.
제5항에 있어서, 상기 a) 단계의 측정은 서던 혼성화(Southern hybridisation), 노던 혼성화(Northern hybridisation), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역전사효소 PCR (RT-PCR), 정량적인 실시간 PCR (qRT-PCR), 디지털 PCR(dPCR), 나노어레이, 마이크로어레이, 자동방사성측정 및 인 시츄 혼성화(in situ hybridisation)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 인터넷 게임 장애 진단을 위한 정보제공 방법.