KR101840003B1 - 행위 중독의 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 행위 중독의 진단을 위한 콜레시스토키닌의 검출 방법 - Google Patents

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천동희
이철주
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전지원
최미란
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김혜정
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한국과학기술연구원
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Abstract

일 양상에 따른 행위 중독 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 행위 중독의 진단을 위해 콜레시스토키닌을 검출하는 방법을 제공한다. 이에 따르면, 행위 중독, 예를 들어 인터넷 중독 또는 게임 중독을 간편하고, 높은 정확도 및 특이도로 진단하는데 이용할 수 있다.

Description

행위 중독의 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 행위 중독의 진단을 위한 콜레시스토키닌의 검출 방법{composition or kit for diagnosing behavioral addiction and method of detecting cholecystokinin for diagnosis of behavioral addiction using the same}
행위 중독의 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 행위 중독의 진단을 위한 콜레시스토키닌의 검출 방법에 관한 것이다.
행위 중독(behavioral addiction)은 도박 중독, 성 중독, 병리적 인터넷 사용 등과 같이 어떠한 행위, 과정, 활동에 관한 중독에 관한 것으로, 뇌 회로가 관여하고, 내성과 금단이 발생할 수 있으며, 충동성이 발달 초기 단계에 중요하게 작용하고 강박성이 행동 유지에 핵심적으로 관여한다. 현대 사회에서는 알코올 중독이나 마약 중독과 같이 인터넷 중독, 게임 중독, 및 강박적 중독 등이 두드러지게 나타나고 있다.
정신 의학적 증상 예를 들어, 자폐, 파킨슨 병, 치매, 주의력 결핍 과잉 행동 장애, 알코올 중독, 마약 중독, 및 강박 신경 장애 등에 대한 바이오 마커들이 알려져 있다(미국 공개 공보 2005/0084880 A1(2005.04.21), 대한민국 등록공고 10-1157526(2016.06.27) 등). 그러나, 행위 중독, 특히 인터넷 중독 또는 게임 중독을 진단하기 위해 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging: MRI)을 통한 뇌 영상 확인이나 설문조사를 통한 자가 진단 방법이 주로 이용될 뿐, 진단을 위해 효과적인 바이오마커가 아직 없다.
따라서, 비용이 비싸고 번거로운 뇌 영상 진단이나 주관적 판단을 기반으로 하는 자가 설문조사 방법이 아니라, 행위 중독을 간편하고 비용이 저렴하게 진단할 수 있고, 진단의 정확도 및 특이도가 높은 바이오마커를 개발할 필요가 있다.
행위 중독 진단용 조성물을 제공한다.
행위 중독 진단용 키트를 제공한다.
행위 중독의 진단을 위해 콜레시스토키닌을 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 콜레시스토키닌(cholecystokinin: CCK) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 행위 중독 진단용 조성물을 제공한다.
용어 "행위 중독(behavioral addiction)"은 어떠한 행위, 과정 또는 활동에 관한 중독을 말한다. 행위 중독은 내성과 금단이 발생할 수 있다. 상기 행위 중독은 인터넷 중독, 스마트폰 중독, 게임 중독, 도박 중독, 종교 중독, 성 중독, 쇼핑 중독, 운동 중독, 및 일 중독으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 인터넷 중독은 병리적 또는 강박적인 인터넷 사용으로 인하여, 신체적, 정신적, 또는 사회적 생활에 지장을 받은 중독 상태에 이르는 것을 말한다. 상기 게임 중독은 병리적 또는 강박적으로 게임에의 몰입으로 인하여, 신체적, 정신적, 또는 사회적 생활에 지장을 받은 중독 상태에 이르는 것을 말한다. 상기 인터넷 또는 게임은 컴퓨터, 휴대전화, 스마트폰, 및 TV 등의 모든 매체에 의한 사용을 포함한다.
콜레시스토키닌(cholecystokinin: CCK)은 위장관계의 펩티드 호르몬으로, 십이지장의 장내분비 세포(enteroendocrine cell)에서 합성 및 분비된다. CCK는 이자 및 담낭으로부터 각각 소화효소와 담즙을 분비하도록 하고, 공복 억제제(hunger suppressant)로서도 기능할 수 있다. CCK는 가스트린과 매우 유사한 구조를 갖고, 함유된 아미노산의 갯수에 따라 여러 아형, 예를 들어 CCK58, CCK33, CCK22 및 CCK8로 존재할 수 있다. CCK는 이전에는 판크레오지민(pancreozymin)으로 불릴 수 있다. CCK는 인간에서 CCK 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. CCK는 인간에서 Uniprot 번호 P06307의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CCK는 마우스에서 Uniprot 번호 P09240의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 단편(fragment)은 CCK 단백질의 일부로서, 면역원성 폴리펩티드일 수 있다.
상기 제제는 CCK 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab', 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 항-CCK 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.
상기 제제는 CCK 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.
다른 양상은 CCK 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 행위 중독 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 행위 중독 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.
다른 양상은 행위 중독이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CCK 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 행위 중독의 진단을 위해 CCK를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 행위 중독이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CCK 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 행위 중독을 앓고 있거나 행위 중독에 걸린 것으로 의심되는 개체일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 상기 개체로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, CCK 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 노던 블로팅(Northern blotting), 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 상기 전기영동은 SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 2차원 전기영동, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 PCR은 실시간 PCR 또는 역전사 PCR일 수 있다.
상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서, 측정된 CCK의 발현 수준의 양이 정상 대조군의 시료로부터 유래된 CCK의 발현 수준에 비해 감소될 수 있다. 상기 정상 대조군은 행위 중독에 걸리지 않은 군으로서 음성 대조군을 의미한다. 예를 들어, 검출된 CCK 단백질의 양이 정상 대조군의 CCK 단백질의 양 보다 적은 경우, 상기 개체는 행위 중독, 예를 들어 인터넷 중독 또는 게임 중독에 걸리거나 걸릴 확률이 높은 것으로 진단될 수 있다. 행위 중독, 예를 들어 인터넷 중독 또는 게임 중독으로 진단된 개체에 심리사회적 치료 또는 약물 치료를 수행할 수 있다. 상기 약물은 예를 들어, 날트렉손(naltrexone), 디술피람(disulfiram), 메타돈(methadone), 클로르디아제폭사이드(chlordiazepoxide), 아캄프로세이트(acamprosate), 부프로피온(bupropion), 바레니클린(varenicline), 부르페노르핀(buprenorphine), 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 양상에 따른 행위 중독 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 행위 중독의 진단을 위해 콜레시스토키닌을 검출하는 방법에 따르면, 행위 중독, 예를 들어 인터넷 중독 또는 게임 중독을 간편하고, 높은 정확도 및 특이도로 진단하는데 이용할 수 있다.
도 1은 감손된 혈청 시료에 대해 고성능 액체 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다(x 축: 시간(분), y 축: 질량 흡광도 단위(milli Absorbance Unit: mAU)).
도 2a는 정상 대조군의 혈청 시료에서 감손 전후 SDS-PAGE 겔 이미지이고, 도 2b는 인터넷 또는 게임 중독군의 혈청 시료에서 감손 전후 SDS-PAGE 겔 이미지이다(좌: 감손 전, 우: 감손 후, M: 크기 마커(KDa), 1 내지 3: 레인 1 내지 3).
도 3a는 493 종의 단백질에 대해 항체 어레이를 수행하여 수득된 이미지이고, 도 3b는 대조군과 인터넷 또는 게임 중독군에서 콜레시스토키닌(CCK)의 항체 어레이 스팟을 비교한 이미지이고, 도 3c는 CCK의 항체 어레이 스팟의 상대적 강도를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 인터넷 또는 게임 중독군(중독군) 또는 정상 대조군(대조군)에서 CCK의 양을 ELISA로 확인하고 이를 분석한 그래프이고(p=0.0008), 도 4b는 CCK의 ROC 곡선이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인터넷 또는 게임 중독군의 혈청 단백질 중 차등 발현된 단백질의 확인
1. 인터넷 또는 게임 중독군의 시료의 준비
가톨릭 대학교 서울성모병원으로부터 인터넷 또는 게임 중독 환자(n=4)의 혈청 시료를 수집하였다. 음성 대조군으로서 인터넷 또는 게임 중독으로 진단되지 않은 정상인(n=4)의 혈청 시료를 수득하였다.
혈청 시료의 단백질 분해 또는 변형을 막기 위해, 혈청을 수득한 직후에 수득된 혈청에 단백질 분해효소 저해제로서 cOmplete, Mini EDTA-free 프로테아제 저해제 칵테일(Roche) 및 포스파타아제 저해제로서 PhosSTOP(Roche)을 첨가하였다. 상기 저해제는 제조자의 프로토콜에 따라 1개의 정제를 200 ㎕의 인산완충식염수(phosphate bufffered saline: PBS)에 녹여 50 X로 만든 후, 각 시료에 저해제의 최종 농도 1.5 X가 되도록 첨가하였다. 저해제를 첨가한 혈청 시료를 정량하고, 실험에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
2. 혈청 시료의 감손( depletion )
알부민이나 면역글로불린 G와 같이 혈청에 다량 존재한 단백질을 제거하기 위해, 수득된 혈청 시료를 감손하였다.
구체적으로, 1.에서 수득된 혈청 시료를 각각 정량 최소량인 54.8 ㎍/㎕의 농도로 준비하고, 동일한 조건에서 실험을 수행하였다. 준비된 혈청 시료를 제조사에서 제공하는 완충액으로 6배 희석하고, 희석된 시료를 0.22 ㎛ 스핀 필터에 여과하였다. 여과된 100 ㎕의 시료를 Multiple Affinity Removal System(MARS) 14 컬럼(Agilent)에 주입하고, Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여 시료를 감손하였다. 14종의 다량존재하는 단백질(알부민, 면역글로불린 G, 알파-1-항트립신, 면역글로불린 A, 트랜스페린, 합토글로빈, 피브리노겐, 알파-2-마크로글로불린, 알파-1-산성당단백질, 면역글로불린 M, 아포지질단백질 A-I, 아포지질단백질 A-II, 보체 단백질 C3, 및 트랜스타이레틴)이 제거된 여과물을 각각 수집하였다. MARS 14 컬럼에 의해서 감손되어 나오는 여과물에 대한 흡광도를 실시간으로 측정한 결과를 도 1에 나타내었다(―··―··―: 여과물의 수집이 시작되는 시점을 나타냄. ――――: 여과물의 수집이 끝나는 시점을 나타냄).
3. 감손된 혈청 시료의 농축 및 정량
3k centrifugal filter(Amicon Ultra, Millipore)를 400 ㎕의 물(HPLC grade, J.T Baker)로 2회 및 400 ㎕의 10 mM HEPES 완충액(pH8.0)으로 2회 가하여 준비하였다.
2.에서 감손된 혈청 시료를 10 mM HEPES 완충액으로 5배 희석하였다. 희석된 시료를 준비된 필터에 가한 후 14000x g의 속도로 10℃에서 10 분 동안 원심분리하여 시료를 농축하였다. 그 후, 시료가 포함된 필터를 10 mM HEPES 완충액으로 5회 세척하고 새로운 튜브에 감손된 혈청 시료를 함유한 필터를 뒤집어서 끼운 후, 3000x g의 속도로 10℃에서 5 분 동안 원심분리하여 농축된 혈청 시료를 회수(recovery)하였다.
농축된 시료는 비신크로니닉산(bicinchoninic acid: BCA) 분석법으로 정량하였다. 동량의 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후, 전기영동된 겔을 은 염색법으로 염색하였다. 염색된 겔의 이미지를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다(도 2a: 정상 대조군의 혈청 시료에서 감손 전후 SDS-PAGE 겔 이미지, 도 2b: 인터넷 또는 게임 중독군의 혈청 시료에서 감손 전후 SDS-PAGE 겔 이미지).
4. 항체 어레이를 이용한 단백질 스크리닝
대조군과 인터넷 또는 게임 중독군 각각 4명의 혈청 시료를 단백질의 농도가 500 ㎍/총 부피 1.5 ㎖가 되도록 풀링(pooling)하였다.
풀링된 각각의 혈청 시료에 3.6 ㎕의 비오틴화제(RayBiotech, Inc.)를 가하고 30분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 5 ㎕의 반응 종결 용액을 가하여 반응을 종결시켰다. 반응물을 크기 배제 컬럼(RayBiotech, Inc.)에 여과하여 시료에 남아 있는 비오틴을 제거하였다.
항체 493 어레이(RayBiotech, Inc.)에 블로킹 완충액(RayBiotech, Inc.)을 가하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 항체 어레이를 준비하였다. 1.5 ㎖의 비오틴-표지된 시료에 블로킹 완충액을 가하여 총 부피 14 ㎖로 희석하였다. 준비된 어레이에 시료를 가하고 약 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
그 후, 항체 어레이 키트에 포함된 세척 완충액으로 어레이를 세척하고, 어레이에 스트렙트아비딘-HRP 접합 용액(RayBiotech, Inc.)을 가하고 상온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 다시 어레이를 세척하고, 제조자의 지시에 따라 어레이의 신호를 검출하였다. 493 종의 단백질에 대한 항체 어레이 결과를 도 3a에 나타내었다.
도 3a에 나타난 바와 같이 정상 대조군과 인터넷 또는 게임 중독군의 시료에서 차등발현되는 단백질을 확인하였다. 인터넷 또는 게임 중독군에서 차등발현되는 단백질 중 콜레시스토키닌(cholecystokinin: CCK) 단백질을 바이오마커로 선정하고, CCK 단백질의 항체 어레이 이미지를 도 3b에 나타내었다. CCK 단백질의 항체 어레이 이미지를 TotalLab 1D 분석 소프트웨어(Nonlinear Dynamics)를 사용하여 스팟의 상대적 강도를 수치화하고, 대조군과 인터넷 또는 게임 중독군에서 정량된 단백질의 상대적 강도를 도 3c에 나타내었다.
도 3c에 나타난 바와 같이, CCK 단백질은 대조군에 비해 인터넷 또는 게임 중독군에서 유의하게 발현이 감소하였다.
5. 경쟁적 효소-결합 면역흡착 분석법을 이용한 차등발현의 검증
4.에서 바이오마커 후보로 선정된 CCK 단백질의 발현 양상을 검증하였다. 검증을 위해, 가톨릭 대학교 서울성모병원과 보라매병원에서 제공한 대조군 28명, 인터넷 또는 게임 중독군 38명의 시료를 사용하여 실험을 진행하였다.
인산 완충 식염수(phosphate bufffered saline: PBS)를 사용하여 1:4의 비율로 희석된 대조군과 인터넷 또는 게임 중독군 환자의 혈청 시료와, 1000 pg/㎖, 333.33 pg/㎖, 111.11 pg/㎖, 37.04 pg/㎖, 12.35 pg/㎖, 0 pg/㎖의 농도로 준비된 콜레시스토키닌 스탠다드(Wuhan USCN Business Co., Ltd), 및 1:100의 비율로 희석된 50 ㎕의 검출 시약 A를 준비하였다. 준비된 용액들을 96 웰 ELISA 플레이트(Cloud-Clone Co., USA) 에 로딩하고, ELISA 플레이트를 37℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 후 남아있는 시료, 스탠다드, 및 검출 시약 A를 제거하였다. 30X로 농축된 세척 완충액을 1X로 희석시켜 각 웰당 300 ㎕씩 가하고, 3회 세척하였다. 그 후, 1:100의 비율로 희석된 100 ㎕의 검출 시약 B(Cloud-Clone Co., USA) 용액을 각 웰에 가하고 37℃에서 약 30분간 인큐베이션하였다. 반응 후 남아있는 시료와 스탠다드를 제거하고, 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 90 ㎕의 기질 용액(Cloud-Clone Co., USA)을 각 웰에 가하고, ELISA 플레이트를 37℃에서 약 10분 내지 20 분간 빛을 차단한 상태에서 인큐베이션하였다. 시료와 스탠다드의 색이 파란색으로 바뀌면, 50 ㎕의 종결 용액(Cloud-Clone Co., USA)을 ELISA 플레이트에 가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
측정된 값으로부터 시료의 농도를 계산하였고, 만-휘트니(Mann-Whitney) U-검정법으로 분석한 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 인터넷 또는 게임 중독군은 정상 대조군에 비해 CCK의 발현이 유의하게 감소하였다.
또한, CCK의 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic: ROC) 곡선을 도 4b에 나타내었다. ROC 곡선에서, 곡선 하 면적(Area Under Curve: AUC) 값은 0.744이고, p 값은 0.0008로, CCK는 인터넷 또는 게임 중독에 대한 바이오마커로서 정확도가 우수함을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 콜레시스토키닌(cholecystokinin: CCK) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 행위 중독 진단용 조성물로서,
    상기 행위 중독은 인터넷 중독 및 게임 중독으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는
    CCK 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는
    CCK 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 것인 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체인 것인 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 핵산은 프라이머 또는 프로브인 것인 조성물.
  6. CCK 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 행위 중독 진단용 키트로서,
    상기 행위 중독은 인터넷 중독 및 게임 중독으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 키트.
  7. 행위 중독이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 CCK 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 행위 중독에 필요한 정보를 제공하기 위하여 CCK를 검출하는 방법으로서,
    상기 행위 중독은 인터넷 중독 및 게임 중독으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, CCK 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 노던(Northern) 블로팅, 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 또는 이들의 조합으로 수행되는 것인 방법.
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