KR102072564B1 - Gabbr2를 포함하는 인터넷 게임 장애 진단용 바이오마커 및 그의 용도 - Google Patents

Gabbr2를 포함하는 인터넷 게임 장애 진단용 바이오마커 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder, IGD)와 관련된 바이오마커, 인터넷 게임 장애 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용하여 인터넷 게임 장애 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면, 외과적 시술 없이 간단한 혈액 검사만으로 인터넷 게임 중독 여부를 예측 또는 진단할 수 있고, 바이오마커의 발현 수준에 따른 판단 기준을 제공함으로써 인터넷 게임 장애를 신속하고 정확하게 예측 또는 진단할 수 있으며, 나아가 인터넷 게임 장애 치료용 물질의 스크리닝 방법 및 인터넷 게임 장애의 예방 및 치료방법에 활용될 수 있다.

Description

GABBR2를 포함하는 인터넷 게임 장애 진단용 바이오마커 및 그의 용도{Biomarker comprising Gamma-aminobutyric acid B receptor 2 for diagnosing internet gaming disorder and uses thereof}
본 발명은 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder, IGD)와 관련된 바이오마커, 인터넷 게임 장애 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용하여 인터넷 게임 장애 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
인터넷 엑세스 인프라가 구축되어 있는 국가에서의 인터넷 및 인터넷기반 게임의 중독적 사용은 사회적 현상이 아닌 인터넷 게임 장애(Internet gaming disorder; IGD)라고 하는 잠재적인 정신적 장애이다. 역학적 보고에 따르면 청소년의 IGD의 발병률은 나라별로 0.8 내지 26.7% 범위에서 발생하는데, 특히, 한국, 중국, 대만, 홍콩, 싱가포르 등 많은 아시아 국가에서는 10% 이상에 해당한다. IGD는 인지, 심리적-사회적 관계 및 학업 또는 직무수행 능력 등 일상생활에 대한 장애와 관련이 있다. 현재 IGD는 정신 장애 진단 및 통계 메뉴얼의 다섯번째 개정판(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders; DSM-V)의 섹션 Ⅲ(추가적인 연구의 조건)에 포함되어 있다
IGD는 뇌의 기질적 변화가 수반된다는 사실이 알려져 있고, 이를 선별 평가하기 위한 임상적 척도들이 사용되고 있으나, 임상적 진단을 통한 민감도 및 특이도의 검증은 이루어지지 않고 있고, 상기 임상적 척도들은 발생한 IGD를 판정하거나 진단할 수는 있지만 조기에 IGD 리스크를 판단하거나 예측하고 대비하는데 활용되기는 어려운 실정이다.
최근 연구들은 IGD가 유전적 요소가 매우 강하다고 밝히고 있고, 대규모 쌍둥이 연구는 IGD에 대한 유전적 배경을 제안 했다.　네덜란드의 쌍생아 연구로부터 얻어진 광범위한 데이터로부터 약 48%가 유전적 요인에 의해 설명되었다고 보고된 바 있으며(Vink JM, van Beijsterveldt TC, Huppertz C, Bartels M, Boomsma DI. Heritability of compulsive Internet use in adolescents. Addict Biol (2016) 21(2):460-8), 중국 청소년기의 쌍생아 관찰에 따르면 58-66%의 유전적 요인이 있다고 보고된 바 있다(Li M, Chen J, Li N, Li X. A twin study of problematic internet use: its heritability and genetic association with effortful control. Twin Res Hum Genet(2014) 17(4):279-87). 그러나, IGD의 임상적-사회적 중요성에도 불구하고 IGD의 분자유전학적 메커니즘에 대하여는 알려진 바 없다.
IGD와 같은 뇌신경 관련 질환의 경우 직접적인 조직 적출을 통한 검사가 어렵기 때문에 혈액을 이용한 진단방법 개발에 대한 필요성이 매우 크다. 현재, IGD 를 판별할 수 있는 혈액 기반의 표지자는 거의 없는 상황으로, 인터넷 게임 장애 특이적인 혈액 표지자의 체계적인 발굴 연구가 필요한 상태이다.
이에, 본 발명자들은 영상 진단이나 설문조사 방법이 아니라, 간편하고 정확도 및 특이도가 높은 인터넷 중독 내지 게임 중독 등의 인터넷 게임 장애를 예측 내지 진단할 수 있는 조성물을 제공하기 위하여 노력한 결과, 특정 유전자의 발현 수준을 측정하여 비침습적인 방법으로 인터넷 게임 장애를 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인터넷 게임 장애와 관련된 바이오마커, 인터넷 게임 장애 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커, 인터넷 게임 장애 진단용 조성물 및 키트를 이용하여 인터넷 게임 장애를 예측 또는 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 데 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 GABBR2(Gamma-aminobutyric acid B receptor, 2)를 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder, IGD) 진단용 바이오마커를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder, IGD) 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인터넷 게임 장애 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
a) 인터넷 게임 장애가 의심되는 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 GABBR2의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 대응하는 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계.
본 발명의 바이오마커는 우수한 지표효율성을 나타내기 때문에 외과적 시술 없이 간단한 혈액 검사만으로 인터넷 게임 중독을 예측 또는 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 인터넷 게임 장애 진단을 위한 정보제공방법에 의하면 마커의 발현 수준에 따른 판단 기준을 제공함으로써 인터넷 게임 장애를 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 바이오마커는 mRNA 또는 단백질을 타겟으로 한 게임장애 치료용 물질의 스크리닝 또는 게임장애를 예방하거나 치료하기 위한 방법에 활용될 수 있다.
도 1은 인터넷 게임 장애 진단(IGD)에 사용할 수 있는 miRNA를 검출하기 위한 본 발명의 2단계 접근방법을 나타낸다. 첫번째 단계는 miRNA 어레이(array) 방법에 기초한 발견(discovery)단계로서 정상대조군과 IGD군에서 다르게 발현하는 miRNA를 발견하고, 두번째 단계에서는 qRT-PCR 방법에 기초한 검증(validation)단계로서 첫번째 단계에서 발견한 miRNA들이 IGD에 미치는 영향 및 관계를 qRT-PCR로 검증하고, IGD를 진단하는데 사용할 수 있는 miRNA 분류를 확정한다.
도 2는 정상대조군과 IGD군에서 다르게 발현하는 순환 miRNA들의 발현량을 나타낸다. 가장 안정적으로 발현한 miR-374b-5p를 기준으로 표준화하였다.
도 3은 발현이 하향 조절된 순환 miRNA 개수에 대한 교차비(odd ration; ORs)를 나타내며, 발현이 하향 조절된 순환 miRNA 개수가 많아질수록 IGD에 해당할 위험성이 높아진다. 3가지 순환 miRNA의 발현이 모두 하향 조절될 경우, 발현이 하향 조절된 순환 miRNA가 없는 경우에 비하여 IGD에 해당할 위험성은 22배 높은 것으로 나타났다.
도 4는 타겟 유전자와 관련된 단백질 발현에 대한 웨스턴 블랏 결과 및 박스 플롯을 나타낸다. (A)는 DPYSL2 를, (B)는 GABRB2 를 나타내며, 모두 IGD 군에서 높게 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 GABBR2(Gamma-aminobutyric acid B receptor, 2) 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder, IGD) 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 "인터넷 게임 장애(Internet gaming disorder)"는 인터넷 중독 또는 인터넷을 기반으로 하는 게임 중독을 모두 포함하는 개념이다. 상기 인터넷 중독은 병리적 또는 강박적인 인터넷 사용으로 인하여, 신체적, 정신적, 또는 사회적 생활에 지장을 받은 중독 상태에 이르는 것을 말한다. 상기 게임 중독은 병리적 또는 강박적으로 게임에의 몰입으로 인하여, 신체적, 정신적, 또 는 사회적 생활에 지장을 받은 중독 상태에 이르는 것을 말한다. 상기 인터넷 또는 게임은 컴퓨터, 휴대전화, 스마트폰, 및 TV 등의 모든 매체에 의한 사용을 포함한다.
GABBR2(Gamma-aminobutyric acid B receptor, 2)는 중추 신경계에서 주요 억제성 신경 전달 물질인 GABA에 대한 수용체로, 히스타민 수용체 역할도 하며, 히스타민에 대한 세포 반응을 매개한다. GABBR2는 인간에서 GABBR2유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. GABBR2는 Uniprot 번호 P47870 의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 마커는 인터넷 게임 장애를 예측하거나 진단해내는 기준이 되는 유전자를 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터(예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적 상 인터넷 게임 장애로 의심받는 개체의 인터넷 중독 또는 게임 중독을 미리 짐작하는 것을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 인터넷 게임 장애 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제" 란 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩 된 단백질의 발현 수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드이거나, 또는 상기 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되 고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길 이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이 용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 인터넷 중독 또는 게임 중독을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마 커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 인터넷 중독 또는 게임 중독을 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 전술한 인터넷 게임 장애 진단용 조성물을 포함하는 인터넷 게임 장애 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 인터넷 게임 장애와 관련된 바이오마커 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 인터넷 중독 또는 게임 중독을 예측하거나 진단하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오마커 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각 의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 인터넷 게임 장애와 관련된 바이오마커를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편 에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 바이오마커 유전자들에 의해 코딩 된 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있 고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 인터넷 게임 장애의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
a) 인터넷 게임 장애가 의심되는 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 GABBR2의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 대응하는 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계.
상기 정보제공방법은 상기 b) 단계에서 비교한 결과가 GABBR2발현 수준의 상향 조절에 해당하는 경우, 인터넷 게임 장애로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어, "mRNA 발현 수준 측정"이란 인터넷 중독 또는 게임 중독을 예측 및/또는 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 바이오마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RTPCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 DNA 칩(DNA chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어, "단백질 발현 수준 측정"이란 인터넷 중독 또는 게임 중독을 예측 및/또는 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자에서 발현된 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법 (immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석 법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "인터넷 게임 장애가 의심되는 대상으로부터 분리된 생물학적 시료"란 이에 제한되는 것은 아니나, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있다.
본 발명의 인터넷 게임 장애를 진단하기 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 바이오마커 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다. mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법 및 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 분석방법들을 통하여, 정상 대조군의 시료로부터 측정한 바이오마커 유전자의 발현량과 인터넷 게임 장애가 의심되는 환자의 시료로부터 측정한 바이오마커 유전자의 발현량을 비교할 수 있고, 발현량의 증감 여부를 판단하여 인터넷 중독 또는 게임 중독을 예측 및/또는 진단할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의하면 인터넷 중독 또는 게임 중독을 정확하게 예측할 수 있고, 예측에 따라 적절한 치료 계획을 세울 수 있는 이점을 얻을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 연구대상 선정 및 분석
3,166명의 청소년(12세 내지 18세)을 대상으로 설문조사를 실시하여 정신 장애 진단 및 통계 메뉴얼(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders; DSM-V)의 인터넷 게임 중독(Internet gaming disorder; IGD) 점수를 사용하여 IGD 여부를 진단하였다. 모든 참가자들은 한국 아동의 정서 장애 및 정신 분열증 편성(Korean Kiddie Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia; K-SADS-PL)에 기초한 정신과의사의 구조화 된 인터뷰를 받았으며, 한국 웩슬러 아동 지능 검사 제4판(Korean-Wechsler Intelligence Scale for Children IV; K-WISC-IV)의 Block Design 및 Vocabulary 하위 테스트를 완료했다. 충동성은 바렛 충동성 스케일(Barratt Impulsiveness Scale; BIS)으로, 성격차원은 행동 저해 시스템(Behavioral Inhibition System; BInS)과 행동 활성화 시스템(Behavioral Activation System; BAS)으로 측정하였다. 만일 과거 또는 현재에 주요한 의학적 장애(예: 당뇨병), 신경학적 장애(예: 발작 장애, 두부 손상), 정신 장애(예: 주요 우울 장애, 불안 장애) 또는 약물 남용(예: 담배, 대마초, 알코올) 등의 증상이 있는 경우 연구대상에서 제외하였다. 이 연구는 가톨릭 의과대학의 임상 시험위원회(MC16SISI0120)의 승인을 받았으며, 모든 참가자와 부모는 서면 동의서를 제출했다. 결과적으로 87명(IGD 환자 45명, 대조군 42명)이 연구대상자로 선정되었는데, 그 중 51명(IGD 환자 25명, 대조군 26명)은 발견군(discovery)으로서 2014년도부터 2016년까지 연구에 참여하였고, 36명(IGD 환자 20명, 대조군 16명)은 검증군(validation)으로서 2016년에만 연구에 참여하였다. 모든 연구대상자는 서울 성모병원과 서울대학교 보라매 병원에 등록된 한국인이었다.
상기 연구대상자 87명의 특징은 하기 [표 1]에 나타내었다. IGD 환자와 대조군은 KS(Korean Internet Addiction Proneness Scale) 및 매주 인터넷 게임에 소비된 시간 외에 나머지 검사 결과에서는 유의한 차이가 없었다.
[표 1]
Figure 112018063366872-pat00001
실시예 2. IGD와 대조군의 miRNA 발현량 비교
IGD와 관련된 miRNA를 발견하기 위하여 2단계 접근 방법(발견 및 독립적 검증)을 사용하였다(도 1). 그 첫번째 단계로서 발견군과 대조군에서 다르게 발현되는 miRNA를 확인하고자 하였다.
구체적으로, TaqMan Low Density miRNA Arrady(TLDA) 방법을 사용하였다. 각 연구대상자로부터 수득한 말초 혈액을 실온에서 10분 동안 3000rpm으로 원심분리하여 상층액(혈장층)을 분리하였다. 50 ㎕의 혈장 샘플에서 TaqMan miRNA ABC 정제 키트(Human Panel A, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 순환 miRNA를 추출하였다. 추출한 순환 miRNA를 표적 특이적 항 miRNA 자석 비드와 혼합한 후, 결합한 순환 miRNA를 100 ㎕의 용출 완충액으로 비드로부터 용리시켰다. 384개의 miRNA가 포함된 TaqMan miRNA ABC 정제 키트(Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 51개 샘플(IGD 25개, 대조군 26개)의 miRNA 발현 프로파일을 분석하였다. 그 후, MegaplexPreAmp Primers Human Pool A 및 TaqManPreAmp Master Mix (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 Megaplex 역전사 및 사전 증폭 반응을 수행했다. TLDA panel A v2.0 (Thermo Fisher Scientific)을 ViiA7 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 실행하여 얻은 miRNA 발현에 대한 데이터는 Expression Suite Software v1.0.4(Thermo Fisher Scientific)로 분석하여 임계사이클(threshold cycle; Ct) 값을 결정했다.
상기 Ct 값이 35를 초과하는 miRNA는 탐지 불가능한 것으로 보아 후속 분석에서 제외되었다. 모든 Ct 값은 가장 안정하게 발현된 miRNA 중 하나인 miR-374b의 Ct 값(△Ct 값)으로 표준화되었다. 발현의 log2 변화비(fold-change ratio)(△△Ct 값)는 Bioconductor에서 HTqPCR 패키지의 캘리브레이터(calibrator)로서 대조군의 평균값을 사용하여 계산하였다. 두 그룹 사이의 발현 차이를 가상적으로 테스트하여 배치 효과(batch effect) 등의 이질성을 포착하기 위해 Bioconductor에서 sva 패키지를 사용하여 대리결과변수(surrogate variable analysis; sva)를 적용했다. P 값이 0.05 미만인 miRNA는 두 그룹 간에 유의한 발현차이가 있는 것으로 간주하였다.
그 결과, 하기 [표 2]에 나타나있는 10개의 miRNA의 발현 수준이 IGD 군와 대조군간의 차이가 있는 것를 확인하였다. 그 중 IGD 군에서는 두 개의miRNA(hsa-miR-423-5p 및 hsa-miR-483-5p)가 상향 조절되었고 8개의 miRNA(hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-411-5p 및 hsa-miR-652-3p)는 IGD 군에서 하향 조절되었다.
[표 2]
Figure 112018063366872-pat00002
실시예 3. 후보 miRNA의 qRT-PCR 검증
2단계 접근방법의 두 번째 단계로서, 상기 [실시예 2]에서 선택한 10개의 후보 miRNA를 검증하기 위해 검증군(IGD군 20개, 대조군 16개)에 대하여 qRT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, TaqMan MicroRNA Assay(miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p, #000413; miR-125b-5p, #000449; miR-200c-3p, #002300; miR-337-5p, #002156; miR-411-5p, #001610; miR-423-5p, #002340; miR-483-5p, #002338; miR-652-3p, #002352) 및 ViiA7 시스템(Life Technologies))을 사용하였다. TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(# 4366596, Life Technologies)를 사용하여 10ng의 전체 RNA를 miRNA 특이적 프라이머를 사용하여 첫 번째 cDNA가닥으로 전환시킨 후 TaqMan Probes를 사용하여 실시간 PCR을 수행했다. 각 miRNA의 상대적 양은 2-△Ct로 계산하였는데, 여기서 △Ct는 대상 샘플에 대한 임계 사이클의 차이이며 miR-374b-5p에 대해 표준화되었다. 모든 PCR 반응은 3 중으로 수행하였고, 이들의 Ct 값을 평균하였다. 상기 [실시예 2]와 동일한 방식으로 각 miRNA의 log2 변화비(fold-change ratio)(△△Ct)를 계산했다. Non-parametric Mann-Whitney-Wilcoxon 테스트를 수행하여 임계 P 값이 0.05 인 두 그룹의 miRNA 발현 차이를 테스트했다.
그 결과, IGD 군에서는 hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p, hsa-miR-337c-5p 및 hsa-miR-125b-5p는 발현이 하향 조절되었으며, hsa-miR-483-5p은 상향 조절되었다. 상기 6개의 순환 miRNA의 서열 정보는 하기 [표 3]과 같다. 나머지 4개의 miRNA(hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p 및 hsa-miR-423-5p)는 상기 [실시예 2]의 결과와 상이하게 확인되었다.
[표 3]
Figure 112018063366872-pat00003
실시예 4. IGD 위험성에 대한 세 가지 miRNA 동시 변형의 상승효과
세 가지 miRNA의 복합적인 효과를 평가하기 위해 네 개의 하위 그룹(0, 1, 2 또는 3 miRNA 변경)의 교차비(odds ratio; OR)를 관찰했다. miRNA 변형은 각 miRNA 표적의 상대적인 양(relative quantity; RQ)으로 확인하였는데, 이는 2-△△Ct로 계산되었다. 세 miRNA 마커 모두 IGD 군에서 하향 조절 되었기 때문에 RQ 값이 1 미만인 miRNA는 변경된 것으로 간주하였다. 확률(odds)는 miRNA 변형 개수별로 IGD군의 인원수에 대한 대조군의 인원수 비율로 계산하였으며, 각 OR은 miRNA 변형이 없는 하위 그룹의 확률로 각 하위 그룹의 확률을 나눠 계산하였다.
그 결과, 세 miRNA의 변형이 있는 경우 어떤 변형도 없는 경우에 비하여 22배 이상 높은 IGD 위험성을 나타냈다(OR 22, 95 % CI 2.29-211.11). OR는 변형된 miRNA 수가 0에서 3(r2=0.996)으로 늘어갈수록 증가하는 추세를 보였다(도 3).
실시예 5. 후보 miRNA의 표적 유전자의 GO 및 경로 분석
IGD 군에서 발현이 하향 조절된 3가지의 miRNA 마커의 기능을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 4가지 알고리즘(miRWalk, miRanda, RNA22 및 Targetscan)을 이용하여 miRWalk 2.0 데이터베이스 기반으로 3가지의 miRNA의 대상 유전자를 예측하였다. 또한 ToppGene Suite의 ToppFu을 이용한 유전자 세트 농축 분석(Gene set enrichment analysis)을 이용하여 대상 유전자의 Gene Ontology(GO) 용어, 경로 및 질병 조건을 확인하였다. 경로 분석은 ToppGene 경로의 KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP 및 MSigDBin에 따라 예측된 표적 유전자의 중요한 경로를 찾는데 사용되었다. 기능적 농축 조건의 중요도는 Bonferroni 보정 P 값에 근거하여 결정되었다.
그 결과, 총 1,230개의 유전자가 다운스트림 타겟으로 일관되게 예측되었으며, 그 중 140개가 2개 이상의 miRNA에서 모두 발현하는 것으로 예측되었다. 또한, 유전자 세트 농축 분석 결과 상기 miRNA의 표적 유전자는 "Axon 유도"와 같은 신경 발달 경로와 "신경 발생"과 같은 GO 용어와 유의하게 연관되어 있는 것을 확인하였다.
hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p 또는 hsa-miR-652-3p 중에서 2개 이상의 miRNA에서 발현할 것으로 예측된 단백질은 다음과 같다: ABL2, AFF3, AGPS, APAF1, ATP11C, ATRX, BRWD1, CCDC50, CDC73, CDK6, CELF1, CEP350, CERS6, CFLAR, CHML, CHRNB2, CHST11, CLASP2, CNOT6L, CPED1, CPM, CREBRF, DNA2, DOCK4, DPYSL2, DUSP4, EIF5, EPM2AIP1, ERBB4, FAM105B, FAM46C, FAM84A, G2E3, GFPT1, GJC1, GMFB, GSE1, HDAC4, HEG1, INTS7, ITGA10, ITGA2, KDM5A, KLHL42, KPNA6, LMBR1, LOX, LTN1, MALT1, MAP1B, MAP2, MAP3K13, MBNL3, MEF2D, MIER3, MKLN1, MOB1B, MYO9A, NAB1, NCEH1, NCOA4, NIPA1, NRIP1, NRIP3, NRXN1, NTRK2, NUFIP2, ONECUT2, OSGIN2, OTUD6B, PELI2, PI15, PIKFYVE, PIP4K2B, PLAG1, PPM1H, PPP1R12B, PPP1R9A, PRLR, PRTG, PTGER3, PTP4A1, RAB18, RASA2, RBM20, RBM46, REEP3, RPL28, RTF1, SCN9A, SH3BP2, SH3PXD2A, SHROOM4, SLC12A2, SLC26A2, SLC30A7, SLC35B4, SLC38A2, SLC4A7, SLC5A3, SLIT1, SMAD2, SOCS6, SOGA3, SPTBN1, SSR1, ST8SIA3, TAF12, TBC1D15, TET2, THAP2, THRB, TROVE2, UBE2W, UBN2, USH2A, USP15, USP25, VGLL3, WNT5A, WPO4, ZCCHC24, ZFAND5, ZFX, ZNF148, ZNF451, ZNF555, ZNF662, ZNF704, ZNHIT6, CHST3, CNR1, GABRB2, IVD, MDM4, PCCB, PURB, SERBP1, SLC7A1, TMEM33 및 UHRF1BP1. 이 중 3가지의 miRNA에서 모두 발현할 것으로 예측되는 단백질은 DUSP4와 PI15 이다.
실시예 6. 예측된 타겟 유전자의 발현 검증
다운스트림 타겟 유전자의 단백질 발현 수준이 IGD와 대조군 간에 차이가 있는지 여부를 알아보기 위해 3가지 miRNA 모두의 다운스트림 타겟에 해당하는 유전자의 단백질 중에서 2가지(DUSP4와 PI15)를 선택하고, 2가지 miRNA의 다운스트림 타겟에 해당하는 유전자의 단백질 중에서 3가지(GABRB2, DPYSL2 및 CNR1) 유전자를 선택했다. 이들을 28 개의 IGD와 28 개의 대조군의 혈장 샘플을 사용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하여 밴드 강도와 면적을 측정하여 IGD군과 대조군 사이의 다섯 가지 표적의 발현을 비교했다.
구체적으로, 각 혈청 시료는 웨스턴 블랏을 수행하기에 앞서 MARS-14 칼럼(4.6 x 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 14개의 풍부한 단백질(알부민, 면역 글로불린 G, 면역 글로불린 A, 세로토니어, 합토글로빈, 알파-1 항트립신, 피브리노겐, 알파-2 마크로글로불린, 알파-1 산 당단백질, 면역 글로불린 M, 아포리포단백질 AI, 아포지단백질 A-II, 보체 C3 및 트란스타이레틴)을 제거하였다. 상기 14개의 단백질이 제거된 혈청시료를 Amicon Ultracel-3 원심 분리 필터(3 kDa cutoff)를 사용하여 농축시킨 후, 비신코닌산(bicinchoninic acid) 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 동일한 양 (10 ~ 30 ㎍)의 대조군과 IGD 혈청 샘플을 4 ~ 20 % Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔(Bio-Rad, CA, USA)에서 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오리드 막(polyvinylidene difluoride membrane)으로 옮겼다.
그 후, 상기 막을 실온에서 30 분 동안 5 % 탈지 분유로 TBS-T(190 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 및 0.05 % Tween 20)에서 블락시켰다. 그 후 막에 DPYSL2(1:500, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), GABRB2(1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), CNR1(1:100, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), DUSP4 (1:500, MybioSource, San Diego, CA, USA) 및 PI15 (1:500, MybioSource, San Diego, CA, USA)에 대한 1차 항체를 처리하고 4℃에서 TBS-T와 5%의 탈지 분유를 함께 하루 동안 배양하였다. 그 후 상기 배양한 막에 2차 항체로서 bovine anti-mouse antibody(1:1,000, Santa Cruz Biotechnology) 또는 goat anti-rabbit antibody(1:1,000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA)를 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)로 표지 및 처리하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 신호 검출은 ECL 시약(GE healthcare, Piscataway, NJ, USA)으로 화학 발광을 사용하여 수행한 후, TotalLab 1D 분석 소프트웨어 (Non-linear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK)를 사용하여 웨스턴 블랏 결과를 정량화했다.
그 결과, DPYSL2(IGD 28개, 대조군 28개, P=0.0037)와 GABBR2(IGD 27개, 대조군 28개, P=0.0052)의 발현 수준은 IGD 군에서 유의하게 높았다(도 4). 그러나 CNR1(P=0.0853), DUSP4(P=0.5443) 및 PI15(P=0.6346)은 발현의 차이점을 관찰할 수 없었다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION Korea Institute of Science and Technology <120> Composition for diagnosis of internet gaming disorder and method of providing information for diagnosis thereof <130> 1063865 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-26b-5p <400> 1 uucaaguaau ucaggauagg u 21 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-125b-5p <400> 2 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-200c-3p <400> 3 uaauacugcc ggguaaugau gga 23 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-337c-5p <400> 4 gaacggcuuc auacaggagu u 21 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-483-5p <400> 5 aagacgggag gaaagaaggg ag 22 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-652-3p <400> 6 aauggcgcca cuaggguugu g 21

Claims (10)

  1. GABBR2(Gamma-aminobutyric acid B receptor, 2) 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder, IGD) 진단용 바이오마커 조성물.
  2. GABBR2의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder, IGD) 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항의 조성물을 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder) 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인 인터넷 게임 장애 진단용 키트.
  6. a) 인터넷 게임 장애가 의심되는 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 GABBR2의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계에서 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 대응하는 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 인터넷 게임 장애(internet gaming disorder) 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 b) 단계에서 비교한 결과가 GABBR2발현 수준의 상향 조절에 해당하는 경우, 인터넷 게임 장애로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 정보제공방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인 정보제공방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)인 것인 정보제공방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)인 것인 정보제공방법.
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