KR20230049400A - 생식세포 내 대사적 스트레스에 대한 바이오마커로서의 안지오제닌의 용도 - Google Patents

생식세포 내 대사적 스트레스에 대한 바이오마커로서의 안지오제닌의 용도 Download PDF

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Abstract

남성의 생식세포 내 안지오제닌(Angiogenin)의 발현 수준을 측정함으로써 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하기 위한 조성물, 키트, 및 방법에 관한 것이다.

Description

생식세포 내 대사적 스트레스에 대한 바이오마커로서의 안지오제닌의 용도 {Use of angiogenin as a biomarker for metabolic stress in germ cells}
남성의 생식세포 내 안지오제닌(Angiogenin)의 발현 수준을 측정함으로써 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하기 위한 조성물, 키트, 및 방법에 관한 것이다.
질병관리본부의 발표자료(2015)에 따르면 한국인의 사망원인 상위 10위 중 7개가 만성질환이며 이로 인한 사망은 전체의 80% 이상을 차지하여 질병부담이 높고 사회경제적 부담이 가중되고 있다. 특히 만성질환 중 비만과 당뇨는 그 빈도수가 높을 뿐 아니라 다른 만성질환의 기저요인으로도 작용한다. 의약학의 발전과 예방교육 등 사회적 노력에도 불구하고 당뇨와 비만의 발병은 한국 뿐 아니라 선진국에서 점차 증가하고 있다. 이러한 증가 현상을 설명하기 위해서는 기존에 알려진 병인 뿐 아니라, 새로운 기전에 대한 탐색이 요구되고 있다.
이와 같은 이유로, 부모 세대에 노출된 환경의 영향이 다음 세대의 만성질환 발병에 독립적인 요인으로 작용한다는 ‘대사적 각인 (metabolic imprinting 또는 nutritional programming) 가설’이 제시되었다. 대사적 각인이란 이른 발달과정에 노출된 대사 스트레스가 성체가 된 후에도 계속해서 대사 조절에 영향을 미치며, 자극이 없어진 후에도 그 영향이 지속되는 것을 말하며, 한 세대 뿐 아니라 2세대 이상 다세대에 걸쳐 유지된다고 보고되었다. 대사적 각인이 전달되는 분자적 표식으로는 최근 tRNA fragment가 가장 유력한 후보 전달물질로 제안되고 있고, 최근 연구를 통해 고지방 식이를 한 수컷 생쥐의 생식세포에서 tRNA fragment 양이 증가하는 것이 확인되었다 (비특허문헌 1). 그러나 그 기전에 대한 연구는 여전히 부족한 실정이다.
따라서, 대사적 스트레스가 어떠한 기전을 통해 tRNA fragment 양의 조절을 유도하는지를 밝힘으로써, 궁극적으로 부모의 대사적 스트레스에서 유래된 후성유전적 변이 기전을 규명하고, 나아가 차세대 대사성 질환 소인에 대한 예측 바이오마커를 발굴하여 질병 예방 및 관리에 기여할 수 있는 기술의 개발이 요구된다.
일 예로, 남성의 생식세포 내 안지오제닌(Angiogenin)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하기 위한 조성물이 제공된다.
다른 예로, 상기 조성물을 포함하는, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성 예측용 키트가 제공된다.
다른 예로, 남성의 생식세포 내 안지오제닌(Angiogenin)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
다른 예로, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성 예측을 위한 정보를 제공하기 위하여, 남성의 생식세포 내 안지오제닌(Angiogenin)의 발현을 검출하는 방법이 제공된다.
다른 예로, 남성의 생식세포 내 안지오제닌(Angiogenin)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하는 방법이 제공된다.
본 발명은 부모 세대에서 환경적 요인에 의해 형성된 대사 이상이 게놈 염기서열의 변화 없이 다음 세대에 전달되어, 차세대에서 후천적 환경 요인 노출 없이도 독립적으로 만성질환 발병의 위험 요인으로 작용한다는 대사적 각인(metabolic imprinting 또는 nutritional programming) 이론에 기초한 것이다.
또한, 본 발명은 당업계에 보고된 대사 이상의 세대전달 연구에서, 고지방 식이를 한 수컷 생쥐의 생식세포에서 tRNA-유래의 small RNA (tRNA fragment 또는 tsRNA 라고도 함)의 양이 특이적으로 증가하며, 이러한 tRNA fragment 가 대사성 질환의 세대간 전달(intergenerational transmission)을 매개하는 부계 후성유전 인자임이 제시되었다는 사실에 착안한 것이다.
보다 구체적으로, 비특허문헌 1에 의하면, 고지방 식이를 통해 비만, 당불내성(glucose intolerant) 및 인슐린 저항성이 유도된 수컷 생쥐의 정자를 정상 암컷 생쥐의 난모세포와 체외수정하여 얻은 F1 자손은, 정상 식이를 공급했음에도 불구하고 7주령에 내당능 장애(impaired glucose tolerance) 및 인슐린 저항성이 나타나기 시작하고 15주령에는 중증도가 심해진 것으로 나타났다. 이러한 대사 이상의 세대 전달의 요인을 파악하기 위하여, 고지방 식이 생쥐의 정자로부터 총 RNA 를 분리하여 정상 수정란에 주입한 결과 마찬가지로 F1 자손에서 내당능 장애가 발생하였다. 이에, 상기 고지방 식이 생쥐 정자의 small RNA의 구성을 분석해본 결과, 30 - 40 nt 크기의 tRNA fragments의 구성이 정상 식이 생쥐의 정자와 크게 달라졌다. 또한, tRNA fragments 를 분리하여 정상 수정란에 주입한 결과 F1 자손에서 내당능 장애가 발생하는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 정자의 30 - 40 nt 크기의 tRNA fragments 가, 부모의 대사 스트레스를 자손에게 전달하여 자손에서 후천적 대사성 질환을 유도하는 후성유전 인자이자 대사적 각인이 전달되는 분자적 표식임을 나타낸다.
또한, 비특허문헌 2에 의하면, tRNA fragment 중 하나인 tsRNA-Gly의 양을 고지방 식이 생쥐 정자에서 확인한 결과 정상 식이 생쥐에 비해 그 양이 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 고지방 식이에 의해 tRNA fragment의 구성이 달라지고 특정 tRNA fragment 양이 증가하는 것을 알 수 있지만, 그 기전은 정확히 알려진 바가 없다. 또한, 비특허문헌 2 역시 고지방 식이 생쥐 정자의 30 - 40 nt 크기의 tRNA fragments 를 분리하여 정상 수정란에 주입한 결과 F1 자손에서 대사성 질환의 징후들이 나타난 결과를 제공하고 있다.
또한, 비특허문헌 3에 의하면, 고지방 식이가 아닌 단백질 제한 식이에 의해서도 앞서 언급한 현상이 보고되었다. 단백질 제한 식이를 섭취한 생쥐의 자손은 고지방식이 실험결과와 동일한 대사 조절 이상을 보였으며, 단백질 제한 식이 생쥐의 정자 내 tRNA fragment의 양이 정상 식이 생쥐에 비해 증가하였음을 알 수 있지만, 증가하게 된 기전은 역시 정확히 알 수 없다. 이러한 결과는, tRNA fragment의 양 증가 현상이 고지방 식이에 국한되지 않고, 식이로 유도된 대사 스트레스에 의한 결과임을 보여준다. 또한, 비특허문헌 3은 정상 및 단백질 제한 식이 정자에서 분리한 < 40nt RNA 집단을 정상 수정란에 주입한 실험을 통해 부계 식이가 정자내 RNA 를 통해 착상전 유전자 조절에 영향을 미치는 결과를 제공하고 있다.
이러한 기존 보고들과 일치하게, 본원의 일 실시예에 따르면, 정상 식이 (CD) 생쥐 및 고지방 식이 (HFD) 생쥐의 정자를 이용하여 small RNA sequencing 을 진행한 결과, 정상 식이 생쥐에 대비하여 고지방 식이 생쥐의 정자에서 tRNA fragment의 양이 증가함을 확인할 수 있고, 특히 Gly-GCC/CCC와 Glu-CTC 유래 5’ tRNA fragment이 증가함이 확인되었다 (도 3).
이에, 본 발명에서는 부모에게 노출된 대사적 스트레스가 어떠한 기전을 통해 정자 tRNA fragments 양의 조절을 유도하는지를 연구한 결과, 고지방 식이를 한 생쥐의 고환에서 tRNA fragmentation 의 주요 효소로 알려진 안지오제닌의 유전자 발현이 특이적으로 증가한 것을 확인하였고, 나아가 고지방 식이로 유도된 mTOR 경로 활성에 의해 안지오제닌 유전자 발현이 증가함에 따라 정자 tRNA fragments가 증가하는 기전을 확인하였다. 이는, 안지오제닌이 대사 스트레스의 세대 전달을 예측하는 표지자 및 바이오마커로 사용될 수 있음을 나타내며, 다시 말해, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하는 바이오마커로 사용될 수 있음을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 한 측면에 따라, 남성의 생식세포 내 안지오제닌의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.
안지오제닌(Angiogenin)은 123개의 아미노산으로 구성되며 약 14kDa 크기의 단백질로서, 리보뉴클레아제 패밀리에 속하며, 리보핵산 가수분해 활성으로 단백질 생산을 조절하고, 리보솜 RNA (rRNA) 전사를 향상시키는 등의 작용으로 세포이동(cell migration), 신생혈관형성(angiogenesis), 증식(proliferation), tubular structures의 형성 등을 포함한 다양한 생명 현상에 관계하는 것이 알려져 있다. 안지오제닌 유전자 또는 단백질은 공지된 데이터베이스에서 그 서열 정보를 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 안지오제닌 유전자의 핵산 서열은 Genbank 등록번호 NM_001145 또는 NM_001097577 등에서 확인할 수 있고, 인간 안지오제닌의 아미노산 서열은 Genbank 등록번호 NP_001091046 또는 NP_001136 등에서 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "차세대의 대사성 질환의 발병 위험성 예측"은 안지오제닌의 발현 수준을 측정하는 대상 개체의 후손에서 대사 이상이 나타나거나 대사성 질환이 발병될 위험성을 미리 평가하고 예측하는 것을 말한다. 차세대란, 안지오제닌의 발현 수준을 측정하는 대상 개체(F0, 부모세대)의 후손을 말하는 것으로, 예를 들어 후손 1세대(F1), 후손 2세대(F2) 또는 후손 3세대(F3) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
대사성 질환 (metabolic disease)은 비만， 당뇨 및 심혈관 질환과 같은 위험 인자들이 서로 군집을 이루는 현상을 한 가지 질환군으로 개념화시킨 것으로, 생체 내 물질대사의 장애에 의한 복잡하고 다양한 여러 대사 이상과 임상 양상을 포괄하여 의미하는 개념이다. 대사성 질환은 비만, 내당능 장애, 인슐린 저항성, 당뇨, 지방간, 또는 심혈관질환 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 예로, 본원에서 대사성 질환은 비만, 내당능 장애, 인슐린 저항성, 또는 당뇨를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "안지오제닌의 발현 수준을 측정하는 제제"는 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하기 위하여 개체의 시료에서의 안지오제닌의 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 직접 또는 간접적으로 측정하여 발현 정도를 확인하는 제제를 의미한다. 예를 들어, 상기 제제는 안지오제닌의 유전자를 검출할 수 있는 제제 또는 단백질을 검출할 수 있는 제제일 수 있다.
본 발명에서 "유전자를 검출할 수 있는 제제"는 시료 내 안지오제닌 유전자를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 구체적인 일예로, 안지오제닌 DNA 또는 mRNA 의 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer), 프로브(probe) 또는 안티센스 핵산(antisnense nucleic acid) 등 일 수 있다. 상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산은 안지오제닌 유전자에 상보적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기서열에는 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.
이 때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링(annealing) 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 핵산이 안지오제닌 유전자 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
일 구현예로, 안지오제닌 유전자를 검출하는 데 사용되는 제제는, 안티센스 핵산일 수 있다. 용어, "안티센스 핵산"은 타겟 유전자에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 타겟 유전자와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미하며, 본원의 안지오제닌 유전자를 검출하는 데 사용될 수 있다.
다른 구현예로, 안지오제닌 유전자를 검출하는 데 사용되는 제제는 프라이머(primer) 쌍 또는 프로브(probe)일 수 있으며, 안지오제닌 유전자의 염기서열이 공지되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈(polymerase) 또는 역전사 효소(reverse transcriptase)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 3인산(nucleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 안지오제닌의 염기서열 부위의 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 프라이머는 안지오제닌 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 일 수 있다.
다른 구현예로, 본원의 안지오제닌 유전자를 검출하는 데 사용되는 제제는, 프로브일 수 있다. 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링(labeling) 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 안지오제닌 유전자와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "단백질을 검출할 수 있는 제제"는 환자의 시료 내에서 안지오제닌 단백질을 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 바람직하게, 안지오제닌 단백질을 타겟으로 하는 특정 화합물 또는 합성 물질일 수 있다. 구체적인 일예로, 안지오제닌 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머일 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.
용어 "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 안지오제닌 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 안지오제닌 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 상기 안지오제닌 유전자에 의해 코딩되는 안지오제닌 단백질을 얻고, 얻어진 안지오제닌 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 안지오제닌 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명의 바이오마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
용어 "압타머"는, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 본 발명의 압타머는, RNA, DNA, 수식 핵산 또는 이들의 혼합물 등의 직쇄상 또는 환상의 형태의 핵산일 수 있다. 압타머는, 파지 디스플레이(phage display) 또는 단클론 항체에 의해 생성되는 펩티드와 같은 것으로서, 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 전형적인 압타머는 크기가 10-15 kDa(30-45개의 뉴클레오티드)이며, 나노몰 이하(sub-nanomolar)의 친화성으로 그 표적에 결합할 수 있다. 압타머는 결합 상호작용(예컨대, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 배제(steric exclusion)) 또는 항체-항원 복합체에서의 특이성을 통하여 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명에서 안지오제닌의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하기 위한 조성물은, 키트의 형태로 구현되어 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 바이오마커인 안지오제닌 유전자 또는 단백질을 검출할 수 있다. 본 발명의 키트에는 안지오제닌 유전자 또는 단백질을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 핵산 또는 안지오제닌 단백질을 인지하는 항체 또는 압타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 안지오제닌 유전자를 검출하기 위한 키트는 DNA 칩(chip)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 안지오제닌 유전자를 검출하기 위한 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 안지오제닌 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너(container), 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할수 있다.
또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 안지오제닌 단백질을 검출하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 남성의 생식세포 내 안지오제닌(Angiogenin)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 안지오제닌 유전자 또는 단백질을 검출하는 방법으로 수행할 수 있고, 개체의 시료로부터 게놈(genome) DNA 또는 총 RNA (total RNA) 또는 총 단백질(total protein)의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 "개체의 시료"란 남성의 생식세포 시료를 말하며, 상기 생식세포는 정소 내 세포, 예를 들어 정자, 정세포, 정모세포, 또는 정원세포일 수 있고, 바람직하게는 정자일 수 있다.
바람직하게, 시료로부터 안지오제닌 유전자를 검출하는 방법은, 시료로부터 핵산을 증폭하는 단계, 및 상기 증폭된 핵산의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 핵산을 증폭하는 단계는, 중합효소 연쇄반응(PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, 테일-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제 또는 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 증폭된 핵산의 염기서열을 결정하는 단계는, 생거(Sanger) 시퀀싱, 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 시퀀싱, 샷건(Shotgun) 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, TaqMan 기법, 자동염기서열분석, 또는 차세대 염기서열 분석에 의하여 수행될 수 있다. 차세대 염기서열 분석은, 당업계에 널리 사용되는 염기서열 분석 시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 Roche 사의 454 GS FLX, Illumina 사의 Genome Analyzer, Applied Biosystems 사의 SOLid Platform 등을 이용할 수 있다.
또 다른 예로, 시료로부터 안지오제닌 단백질을 검출하는 방법은, 해당 아미노산 변이를 특이적으로 검출하는 항체를 이용한 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 안지오제닌과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체를 확인할 수 있고, 안지오제닌과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체를 판단하여, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하는 목적을 달성할 수 있다.
본원에서 "항원-항체 복합체"란 안지오제닌과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성 여부는 검출 라벨(detection label)의 시그널을 통해서 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스(redox) 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
일 구체예로, 안지오제닌과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체 측정은 ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 바이오마커인 안지오제닌과 항체의 복합체 형성을 확인하여, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측할 수 있다.
다른 구체예로, 안지오제닌에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 예를 들어, 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킬 수 있다. 생성된 항원-항체 복합체를 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 안지오제닌 유전자의 발현에 의해 생성된 안지오제닌의 양을 확인하여, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측할 수 있다. 상기 검출 방법은 안지오제닌과 이에 대한 항체 사이의 항원-항체 복합체를 조사하는 방법으로 이루어진다.
다른 구체예로, 안지오제닌에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재를 확인하여, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측할 수 있다.
상기 검출 방법들을 통하여, 남성의 생식세포 내 안지오제닌의 발현 수준이 대사성 질환이 없는 남성의 생식세포 내 안지오제닌의 발현 수준보다 높거나 임계값(cut-off)보다 높을 경우 차세대에서 대사성 질환의 발병 위험성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
도 1은 정상 식이(CD) 생쥐 및 고지방 식이(HFD) 생쥐의 고환에서 qPCR을 통해 안지오제닌의 유전자 발현을 비교한 결과를 나타내며, 고지방 식이를 한 생쥐의 고환에서 안지오제닌 유전자 발현이 증가하였다. 데이터는 평균 ± SE 로 나타내었고 Student's t-test 로 분석하였다 (**, P < 0.01).
도 2는 정상 식이(CD) 생쥐 및 고지방 식이(HFD) 생쥐의 고환 조직을 용해하고 웨스턴 블랏을 통해 mTOR 의 내재적 활성을 분석한 결과를 나타내며, 고지방 식이를 한 생쥐의 고환에서 mTOR 활성이 증가하였다. 데이터는 평균 ± SD 로 나타내었고 Student's t-test 로 분석하였다 (*, P < 0.05).
도 3은 정상 식이 (CD) 생쥐 및 고지방 식이 (HFD) 생쥐의 정자를 이용하여 small RNA sequencing 을 진행한 결과를 나타내며, 정상 식이 생쥐에 대비하여 고지방 식이 생쥐의 정자에서 감소한 tRNA fragment 보다 증가한 tRNA fragment의 수가 더 많으며, 그 예를 보여주고 있다.
도 4는 생쥐 유래 NIH/3T3 세포주에 Compound C (CC)를 처리하여 mTOR 단백질 활성을 유도한 후 RNA 를 추출하여 안지오제닌의 유전자 발현을 확인한 결과를 나타내며, Compound C (CC) 를 처리한 세포주에서 안지오제닌 유전자 발현이 유의적으로 증가하였다. 데이터는 평균 ± SD 로 나타내었고 Student's t-test 로 분석하였다 (**, P < 0.01).
도 5는 Compound C를 처리한 NIH/3T3 세포주로부터 추출한 total RNA 를 젤 전기영동한 결과를 나타내며, tRNA 단편에 해당하는, 20 - 50 nt 의 small RNA 가 증가하였다.
도 6은 Compound C를 처리한 생쥐 유래 NIH/3T3 세포주와 처리하지 않은 세포주로부터 추출한 RNA를 이용하여 small RNA sequencing 을 진행한 결과를 나타내며, tRNA fragment 의 양이 Compound C 처리시 변화함을 보이며 그 예를 보여주고 있다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1. 실험대상
1-1. 동물모델
C57BL/6 수컷 생쥐모델에서 고지방 식이를 이용하여 대사적 스트레스를 유발하였다. 고지방 식이는 전체 에너지의 60%가 지방으로 이루어져 있으며, 대사 스트레스의 대조군의 경우 전체 에너지의 16%가 지방으로 이루어져 있다. 약 7주간의 고지방 식이 급이 후 생식세포와 관련한 고환과 정자를 확보하였다.
1-2. 세포모델
생쥐 유래 NIH/3T3 세포주는 한국 세포주 은행으로부터 분양 받아 사용하였다. NIH/3T3 세포는 실험목적에 따라 100mm 플레이트나 6-well plate에 각각 seeding한 후, CS (Calf serum, 10%) 및 P/S (antibiotics, 1%)를 함유한 고농도 포도당 DMEM(89%)에서 배양하였다. 약 60% confluency가 된 30시간 후에, AMPK 단백질 억제제인 Compound C를 함유한 DMEM으로 바꾸어 24시간 동안 mTOR 활성을 유도하였다.
실시예 2. Total RNA 추출
생쥐로부터 확보한 고환과 각 세포주의 total RNA는 Trizol을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였고, 추출된 total RNA는 1.5%의 아가로스 젤에서 전기영동하여 분해되는 정도를 확인 후 Nanodrop Lite(Thermo)를 이용하여 정량하였다.
실시예 3. 정량적 실시간(Quantitative real-time) PCR (qRT-PCR)
RNA를 cDNA(complement DNA)로 합성하기 위해 Reverse transcriptase(Thermo)를 사용하였으며, 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA 합성을 진행하였다. cDNA를 합성한 후 이것을 1:4로 희석하여 그 중 2μl을 이용하여 qRT-PCR의 주형으로 사용하였다. qRT-PCR은 cDNA 2μl, SYBER green master mix(Qiagen) 5μl, 각 유전자의 상보적인 프라이머 10pmole을 포함한 10μl을 95℃ 에서 5분동안 반응한 후, 40 cycle(95℃에서 5초, 60℃에서 10초) 반복하여 증폭하였다. mTOR 활성 조절에 의해 영향을 받지 않을 만한 Actin mRNA 발현을 internal control로 사용하였으며, 각 유전자의 발현은 internal control의 발현 수준으로 보정하였다.
실시예 4. 웨스턴 블랏 (Western blot)
수컷 생쥐모델에서 확보한 고환 조직을 단백질 lysis buffer를 이용하여 용해하였다. 그 후, 보고자 하는 단백질의 크기에 맞는 퍼센트의 젤에 단백질을 전기영동하였다. PVDF membrane에 젤의 단백질을 옮긴 후 적절한 항체를 붙여 보고자 하는 단백질의 밴드를 확인하였다.
실시예 5. Small RNA 전기영동
Compound C를 처리한 NIH/3T3 세포주로부터 추출한 total RNA를 10% TBE-urea gel을 이용하여 전기영동을 진행하였다. 젤 상에서 small RNA를 잘 확인하기 위해 25ug의 RNA를 로딩하였다. 전기영동이 완료된 후, SYBR Green1을 이용하여 젤 염색을 진행하였다. 약 20분간의 염색이 끝나면 UV 기계를 이용하여 젤 사진을 확보하였다.
실시예 6. Small RNA 시퀀싱(sequencing)
수컷 생쥐 모델에서 확보한 정자 및 NIH/3T3 세포주로부터 추출한 total RNA를 이용하여 size selection 후 small RNA sequencing를 진행하였다. TruSeq Small RNa library를 이용하여 small RNA library를 만든 후 NextSeq 500 플랫폼을 이용하여 시퀀싱이 진행되었다. 시퀀싱은 3 반복으로 진행되었고, 정자의 경우 RNA 양 확보에 한계가 있어, 세 마리의 생쥐에서 얻은 정자를 풀링하여 하나의 샘플로 진행하였다.
실험 결과
고지방 식이로 유도된 비만 생쥐 모델을 이용하여 tRNA fragmentation에 주요 효소로 알려진 안지오제닌의 유전자 발현 정도를 비교한 결과, 고지방 식이를 한 생쥐의 고환에서 안지오제닌 유전자 발현이 증가한 결과를 확인할 수 있었다 (도 1).
고지방 식이로 유도된 안지오제닌의 유전자 발현 증가 기전을 확인하기 위해 nutrient sensing의 중심조절인자로 알려진 mTOR 경로의 활성을 조절하여 안지오제닌 유전자 발현 정도를 확인해보았다. 우선, 웨스턴 블랏을 통해 고지방 식이를 한 생쥐의 고환에서 phospho-mTOR 단백질의 수준이 증가하여 mTOR 의 내재적 활성이 올라간 결과를 확인하였다(도 2). 또한, 고지방 식이에 의한 tRNA fragment의 변화를 확인하기 위해 진행된 small RNA sequencing 결과를 통해, 고지방 식이 생쥐 정자에서 tRNA fragment의 양이 증가함을 확인할 수 있고, 특히 Gly-GCC/CCC와 Glu-CTC 유래 5’ tRNA fragment이 증가함을 확인하였다(도 3). mTOR 의 내재적 활성이 올라간 생쥐의 고환과 같은 조건을 세포 모델을 이용하여 만들기 위해, 생쥐 유래 NIH/3T3 세포주에 AMPK 단백질 억제제인 Compound C를 처리하여 결과적으로 mTOR 단백질 활성을 유도하였다. Compound C를 처리한 세포주에서 추출한 RNA를 이용하여 안지오제닌 유전자 발현을 정량적으로 측정하였을 경우 유의적으로 증가함을 확인하였으며(도 4), 젤 전기영동을 통해 tRNA fragment에 해당하는 small RNA(30-40nt)의 양이 증가하는 것 역시 확인하였다(도 5). Compound C를 처리한 세포주를 이용한 small RNA sequencing 결과 역시 tRNA fragment의 양이 Compound C 에 의해 변화하였으며, 특히 Gly-GCC/CCC 유래 5’ tRNA fragment 양이 Compound C에 의해 증가함을 확인하였다 (도 6).
결론적으로, 고지방식이로 유도된 mTOR 경로 활성에 의해 안지오제닌 유전자 발현이 증가함에 따라 small RNA, 즉 tRNA fragment가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이는, 안지오제닌이 대사 스트레스의 세대 전달을 예측하는 표지자 및 바이오마커로 사용될 수 있음을 나타내며, 다시 말해, 차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하는 바이오마커로 사용될 수 있음을 나타낸다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

  1. 남성의 생식세포 내 안지오제닌(Angiogenin)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는,
    차세대의 대사성 질환의 발병 위험성을 예측하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생식세포는 정자, 정세포, 정모세포, 또는 정원세포인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 안지오제닌의 발현 수준을 측정하는 제제는 안지오제닌 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 안지오제닌의 발현 수준을 측정하는 제제는 안지오제닌에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는,
    차세대의 대사성 질환의 발병 위험성 예측용 키트.
  6. 남성의 생식세포 내 안지오제닌(Angiogenin)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는,
    차세대의 대사성 질환의 발병 위험성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Chen, Qi, et al. "Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder." Science 351.6271 (2016): 397-400
Sharma, Upasna, et al. "Biogenesis and function of tRNA fragments during sperm maturation and fertilization in mammals." Science 351.6271 (2016): 391-396
Zhang, Yunfang, et al. "Dnmt2 mediates intergenerational transmission of paternally acquired metabolic disorders through sperm small non-coding RNAs." Nature cell biology 20.5 (2018): 535-540

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