KR102560831B1 - 위암 발병 가능성 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

위암 발병 가능성 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 위암 발병 가능성 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정함으로써 이시성 위암을 포함한 위암 발병 가능성을 예측할 수 있다. 본 발명에 따른 위암 발병 가능성 예측용 조성물은 위암 발병의 예측에 있어 높은 정확도를 가질 뿐만 아니라, 하나의 조직 검체로 multi-plex PCR을 이용함으로써 한 번의 측정방법으로 위암의 예측이 가능하므로 활용도가 높다. 또한 이시성 위암뿐 아니라 위암 발병을 예측할 수 있는 정량적인 방법으로 기저위염을 정량화할 수 있는 방법을 포함하므로, 위암 가족력이 있거나 위험인자가 있는 정상인에서도 위암 발병 위험도를 예측할 수 있는 방법을 제공한다. 이에 더하여, 내시경 점막하박리술로 치료된 조기위암환자에서 이시성 위암의 발병을 예측함으로써 환자의 예후를 예측할 수 있는 효과가 있다.

Description

위암 발병 가능성 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도 {Biomarker for predicting probability for onset of gastric cancer and Use thereof}
본 발명은 위암 발병 가능성 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
위암과 관련하여, 수술적 절차 및 이를 보조하는 화학적 항암 치료법뿐만 아니라, 조기 진단 방법에 대해서도 많은 진전을 이뤄왔지만, 위암은 세계적으로 성별을 불문하고 암으로 인한 사망 원인 중 두번째를 차지하며, 흔한 사망 원인중 하나로 남아있다. 그러나, 가장 중요한 위암 발병 및 종양 진행의 근본이 되는 정확한 기전은 아직 완전히 밝혀진 바 없다. 특히, 우리나라에서 위암 발생률이 전세계 1위인 것은 기저 위염이 많이 진행되었기 때문인 것으로 알려져 있다.
이시성 위암(Metachronous Gastric Cancer, MGC)은 위암이 진단되고 12개월 이후 발견된 경우를 의미하며, 구체적으로 내시경 절제술로 위암을 치료한 이후 추적관찰 중 원래 치료 부위 이외의 다른 부위에서 새로 발생하는 위암을 그 예로 들 수 있다.
내시경 점막하박리술(Endoscopic submucosal dissection, ESD)로 치료된 조기위암환자에서 완치된 위암이 절제된 부위 이외의 정상 위점막에서 이시성 위암이 발생할 확률은 연 발생률 3~5% 정도로 매우 높으며, 정상인의 약 100배 정도의 발생 위험도를 가진다. 따라서 이러한 이시성 위암 발생을 예측하는 것은 환자의 예후 예측을 위해 매우 중요하다.
다만, 위암에서 내시경 절제 후 이시성 위암 발생의 예측 인자가 없어, 모든 환자에서 내시경을 1년에 한번 평생 하도록 하나, 중간에 f/u loss 가 많은 실정이다.
종래 내시경에서 기저 위염(장상피화생, 위축성 위염)은 향후 위암 발생의 예측인자로 사용되나, 관찰자간(inter-observer) 또는 관찰자 내 변동성(intra-observer variability)이 심하며, 이를 극복하기 위해 OLGA(Operative Link on Gastritis Assessment), OLGIM(Operative Link on Gastritis Assessment based on Intestinal Metaplasia) stage가 개발되었으나, 이는 내시경에서 최소 5곳의 2개씩의 조직검사가 필요하여, 총 10개의 내시경적 조직 검체가 필요하며, 이에 따라 출혈 등의 합병증 위험이 증가하여 실제 임상에서 거의 쓰이지 않는다는 문제점이 있었다.
또한, 위암의 재발 특이적 마커에 관한 한국특허등록공보 제10-2253304호 등이 있으나, 본원발명의 이시성 위암 진단 또는 예측에 사용된 바이오마커는 개시된 바 없다.
한국특허등록공보 제10-2253304호
이러한 배경하에, 본 발명자는 조기위암으로 내시경 점막하박리술을 시행할 당시 위암 이외의 정상점막에서 측정한 CDK1, KDF1의 발현 정도로 향후 이시성 위암의 발생 예측에 사용 가능함을 확인하였으며, CREB5, AKT2 isoform 유전자 발현과 OLGIM stage과의 연관성을 확인하여, 하나의 조직 검체로서 한번의 유전자 발현 측정을 통해 이시성 위암의 예측뿐만 아니라 정상인에서도 위암 발생의 예측이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 CDK1, KDF1, CREB5, AKT2 isoform 유전자의 발현 양상을 통해 조기위암으로 내시경 점막하박리술을 시행한 환자에게는 위험계층화(risk stratification)를 통해 향후 이시성 위암 발생의 관찰에 대한 개별화된 접근이 가능할 뿐만 아니라, 정상인에서도 위암 발생을 예측할 수 있는 정량적인 방법으로 위암 가족력이 있거나 위험인자가 있는 정상인에서도 위암 발생을 예측할 수 있는 방법을 제공한다.
이에, 본 발명의 목적은 CREB5 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암 발병 가능성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 위암 발병 가능성 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 이시성 위암 발병 가능성 예측용 조성물 또는 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CREB5 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위암의 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 이시성 위암의 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법, 또는 조기위암환자의 내시경 점막하박리술 치료 후 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 CREB5 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암 발병 가능성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 위암은 이시성 위암을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 CDK1 및 KDF1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자 또는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 위암 발병 가능성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 이시성 위암 발병 가능성 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서, CREB5 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 위암의 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 위암은 이시성 위암을 포함할 수 있고, 상기 방법은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 CDK1 및 KDF1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하고, 이를 대조군으로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 유전자의 mRNA 수준은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), 멀티플렉스 역전사 중합효소연쇄반응(Multi-plex PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBD-seq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법, 및 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단백질 수준은 웨스턴 블랏(western blot), 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역조직화학법(Immunohistochemistry, IHC), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 단백질 수준 측정은 하나의 생물학적 시료로 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변, 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 방법은 (c) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 상기 mRNA 또는 단백질의 수준이 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준 보다 높은 경우, 위암의 발병 위험이 높다고 판정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서, CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 이시성 위암의 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 조기위암환자에서 분리된 생물학적 시료에서, CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 조기위암환자의 내시경 점막하박리술 치료 후 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 따른 위암 발병 가능성 예측용 조성물은 위암 발병의 예측에 있어 높은 정확도를 가질 뿐만 아니라, 하나의 조직 검체로 multi-plex PCR 등을 이용함으로써 한 번의 측정방법으로 위암의 예측이 가능하므로 활용도가 높다. 또한 이시성 위암뿐 아니라 위암 발병을 예측할 수 있는 정량적인 방법으로 기저위염을 정량화할 수 있는 방법을 포함하므로, 위암 가족력이 있거나 위험인자가 있는 정상인에서도 위암 발병 위험도를 예측할 수 있는 방법을 제공한다. 이에 더하여, 내시경 점막하박리술로 치료된 조기위암환자에서 이시성 위암의 발병을 예측함으로써 환자의 예후를 예측할 수 있는 효과가 있다.
도 1a 내지 1e는 각각 종양 주변의 정상 위점막 조직의 DESeq2 분석 결과, 유전자 발현량과 위암의 개수, 선종의 개수, 위축성 위염(OLGA stage), 장상피화생의 정도(OLGMI stage)에 따른 상관분석 결과(도 1a), 이시성 위암 그룹에서 발현이 높은 것을 확인한 후보 유전자들 중 CDK1의 발현량을 나타낸 결과(도 1b), 자기조직화지도(Self organizing map, SOM)를 확인한 결과(도 1c), 대체 스플라이싱(Alteernative splicing analysis) 분석 결과(도 1d), 및 타겟으로 설정한 AKT2 isoform의 cDNA 서열 및 아미노산 서열(도 1e)을 나타낸 것이다.
도 2는 정상 위점막 조직으로 시행한 bulk RNA 시퀀싱 분석 결과 등을 고려하여 이시성 위암 바이오마커로서 후보 유전자를 선정한 결과이다.
도 3은 siRNA를 처리한 위암 세포주에서 세포 생존 능력을 평가한 결과이다.
도 4a는 CDK1, KDF1, POLR2L, CREB5, 및 AKT2-isoform 유전자 발현의 유효성 평가 결과이다.
도 4b는 종양 주변 정상 위점막 조직(control)과 이시성 위암이 발생한 환자 조직(mGC)에서 CDK1 및 KDF1 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 4c는 종양 주변 정상 위점막 조직(control)과 이시성 위암이 발생한 환자 조직(mGC)에서 CDK1 단백질 발현 정도를 면역조직화학법으로 확인한 결과이다.
도 4d는 종양 주변 정상 위점막 조직(control)과 이시성 위암이 발생한 환자 조직(mGC)에서 KDF1 단백질 발현 정도를 면역조직화학법으로 확인한 결과이다.
도 5a 내지 5d는 CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2-isoform 유전자와 위암 발생 예측의 ROC curve 분석 결과이다.
도 6은 OLGIM stage에 따른 CREB5 유전자 발현을 나타낸 결과이다.
도 7은 OLGIM stage에 따른 AKT2 유전자 발현을 나타낸 결과이다.
본 발명의 일 실시예에서는 내시경 점막하박리술로 치료된 조기위암환자에서 진단 당시의 정상 위점막 조직을 획득하여 보관하고 있는 환자를 대상으로, 추적관찰 중 이시성 위암이 발생한 환자와 발생하지 않은 환자 사이의 차별 발현 유전자(Differentially expressed genes, DEG)를 확인하고, 유전자 발현량과 이시성 위암의 개수, 선종의 개수, 위축성 위염(OLGA stage), 장상피화생(OLGIM stage)의 정도에 따른 상관분석, 자기조직화지도(Self organizing map, SOM) 분석, 및 동형분석(isoform analysis) 등을 시행함으로써 후보 유전자로 CDK1, KDF1, ERCC6L, KLK8, MCM2, POLR2L, PTN, CREB5, 및 AKT2-isoform를 선정하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 후보유전자를 대상으로, 다양한 위암 세포주 및 정상 위점막 세포주에서의 유전자 발현 차이를 qRT-PCR을 통해 확인하고, siRNA 처리한 위암 세포주에서 생존능력 억제를 평가함으로써 CDK1, KDF1, CREB5 및 AKT2-isoform을 최종 타겟 유전자로 선정하였으며(실시예 2-1 참조), 웨스턴 블랏 및 면역조직화학법을 통해 CDK1 및 KDF1의 단백질 발현이 이시성 위암이 발생한 환자 조직에서 발생하지 않은 환자 조직에 비해 높은 것을 확인하였다(실시예 2-2 및 2-3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 CDK1, KDF1, CREB5 및 AKT2-isoform 유전자의 유효성 평가를 진행한 결과, 각 유전자 마커의 이시성 위암 예측에 대한 정확도가 높고, 특히 상기 CDK1, KDF1, 및 AKT2-isoform 마커를 조합하였을 때 가장 정확도가 증가되는 것을 확인하였다. 또한, CREB5 및 AKT2 isoform이 OLGIM stage에 따라 발현 차이를 보이는 것을 확인하여, 이시성 위암뿐 아니라 위암 가족력이 있거나 위험인자가 있는 정상인에서도 위암 예측이 가능할 것임을 확인하였다(실시예 3 참조).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 CREB5 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암 발병 가능성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 CDK1 및 KDF1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 이시성 위암 발병 가능성 예측용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 4종의 유전자 중 1종의 유전자 또는 2종, 3종, 4종의 유전자 조합을 모두 포함할 수 있다.
예컨대, CDK1; KDF1; CREB5; AKT2; CDK1 및 KDF1; CDK1 및 CREB5; CDK1 및 AKT2; KDF1 및 CREB5; KDF1 및 AKT2; CREB5 및 AKT2; CDK1, KDF1, 및 CREB5; CDK1, KDF1, 및 AKT2; CDK1, CREB5, 및 AKT2; KDF1, CREB5, 및 AKT2; 또는 CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면 CREB5는 OLGIM stage와 관련이 높은 유전자로 다른 유전자들에 비해 mGC 자체에는 큰 연관성을 나타내지 않으나, AKT2-isoform은 OLGIM stage와 관련이 높은 유전자이면서 mGC와도 높은 연관성을 보이는 바, CDK1, KDF1, 및 AKT2-isoform의 조합일 경우 이시성 위암 발병 가능성 예측에 있어 가장 정확도가 높게 나타날 수 있으나, 상기 유전자의 조합에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 상기 유전자의 발현이 증가할 경우 이를 측정하여 위암의 발병 가능성 예측을 위한 유용한 정보를 획득할 수 있는 것으로, 이는 지금까지 알려진 바 없으며, 본 발명에 의해 최초로 밝혀진 것으로, 조기위암으로 내시경 점막하박리술을 시행한 환자에게는 향후 이시성 위암 발생의 관찰에 대한 접근이 가능할 뿐만 아니라, 예후를 예측할 수 있고, 정상인에서도 위암 발병 가능성을 예측할 수 있는 정량적인 방법으로서 하나의 조직 검체로 multi-plex PCR을 이용하여 한번의 측정 방법으로 위암의 예측이 가능한 점에서 그 의의가 크다.
본 발명에 있어서, “CDK1(Cyclin Dependent Kinase 1)”은 세포 분열 주기 단백질 2 상동체로도 알려진 사이클린 의존성 키나제 1으로, 세린/트레오닌 단백질 키나제로 기능하는 고도로 보존된 단백질이며 세포 주기 조절의 핵심 역할을 하는 것으로 알려진 단백질이다. 상기 CDK1은 NCBI Reference Sequence: NP_001777.1의 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하는 것일 수 있고, NCBI Reference Sequence: NM_001786.5의 염기서열(서열번호 2)에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 위암 환자군에서 위암 예측의 정확도 판단을 위한 ROC curve 분석 결과 정확도(AUC 0.829)가 높음을 확인하여 위암 발병 가능성 예측에 유용하게 사용될 수 있는 바이오마커임을 확인할 수 있었다.
본 발명에 있어서, "KDF1(Keratinocyte Differentiation Factor 1)"은 초기 발달 동안 표피 형성을 조절하는 역할을 하는 단백질로, 기저 세포 증식의 억제제 및 기저 전구 세포 자손의 분화 촉진제 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 KDF1은 NCBI Reference Sequence: NP_689578.2의 아미노산 서열(서열번호 3)을 포함하는 것일 수 있고, NCBI Reference Sequence: NM_152365.3의 염기서열(서열번호 4)에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 위암 환자군에서 위암 예측의 정확도 판단을 위한 ROC curve 분석 결과 정확도(AUC 0.841)가 매우 높음을 확인하여 위암 발병 가능성 예측에 유용하게 사용될 수 있는 바이오마커임을 확인할 수 있었다.
본 발명에 있어서, "CREB5(cAMP responsive element binding protein 5)"는 CRE- 결합 단백질 패밀리에 속하는 유전자로, 유전자 발현을 조절할 수 있는 진핵 세포의 전사 활성화 인자(transcriptional activator)의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 CREB5는 NCBI Reference Sequence: NP_878901.2의 아미노산 서열(서열번호 5)을 포함하는 것일 수 있고, NCBI Reference Sequence: NM_182898.4의 염기서열(서열번호 6)에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 장상피화생을 평가의 근거로 하는 OLGIM(Operative Link on Gastritis Assessment based on Intestinal Metaplasia) systems에서 단계(stage)가 높아짐에 따라 CREB5의 발현이 증가됨을 확인하였으며, 특히 위암발생의 고위험군인 stage 3 및 4에서 CREB5의 발현량이 현저히 증가됨을 확인하여 위암 발병 가능성 예측이 가능함을 확인할 수 있었다.
본 발명에 있어서, “AKT2(AKT Serine/Threonine Kinase 2, RAC-beta serine/threonine-protein kinase)”는 활성화된 타이로신 키나아제와 PI3K 하류의 신호전달 경로에서 매우 중요한 매개체(mediator) 역할을 하는 것으로, AKT에 의해 조절되고 있는 세포작용들은 세포증식, 세포생존, 세포크기 조절, 가용 영양분에 대한 반응성, 중간 대사과정, 혈관신생(angiogenesis), 조직침해(tissue invasion) 등 세포작용을 역할에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 본 발명의 AKT2는 AKT2 동형단백질(isoform)을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 AKT2 isoform은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 서열번호 8의 염기서열에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, AKT2 동형단백질의 발현을 측정한 결과, OLGIM stage가 낮은 환자군에 비해 높은 환자군에서 AKT2의 동형 단백질 발현이 현저하게 증가됨을 확인하여, 위암 발병 가능성 예측에 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, "mRNA의 수준을 측정하는 제제"는 시료에 포함된 본 발명의 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 상기 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자 또는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”란 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 유전자 또는 이의 mRNA의 cDNA 또는 genomic DNA의 염기서열을 참조하여 프라이머 쌍을 용이하게 디자인할 수 있다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다.
본 발명에 있어서, “프로브(probe)”는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA), DNA 등에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질(또는 대립유전자, allele)을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.
본 발명에서, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출하고자 하는 표적이 되는 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 상기 유전자 또는 이의 mRNA를 검출할 수 있는 것이라면 특정 서열로 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "압타머(aptamer)"란 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미하며, SELEX(Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment)라는 방법으로 원하는 다양한 목적 물질(단백질, 당, 염색물질, DNA, 금속이온, 세포 등)에 대한 압타머를 개발할 수 있다.
본 발명에 있어서, “항체(antibody)”란 항원성 부위에 대해서 지시되어 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 의미한다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법, 재조합 DNA 방법, 또는 파아지 항체 라이브러리 방법 등에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체의 단편은 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 낙타 등을 포함한, 상이한 유기체에서 유래될 수 있으며, 예컨대 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편, 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 또는 키메릭 항체 등일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 항체는 본 발명의 단백질을 검출할 수 있는 것이라면 특정 항체의 종류로 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, "위암"은 위에 생기는 암을 두루 이르는 말로서, 위암의 대부분을 차지하는 위선암(胃腺癌)은 위점막의 선세포(샘세포)에서 발생한 것이며 현미경에서 관찰되는 모양에 따라 다시 여러 종류로 나눌 수 있다. 그 외에 림프조직에서 발생하는 림프종, 위의 신경 및 근육 조직에서 발생하는 간질성 종양, 육종(肉腫, 비상피성 조직에서 유래하는 악성 종양), 그리고 호르몬을 분비하는 신경내분비암 등이 모두 위암에 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 위암은 원발성 또는 이시성 위암을 모두 포함할 수 있으며, 이에 따라 가족력이 있거나 위험인자가 있는 정상인에서도 위암 발생을 진단 및 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 이시성 위암 또한 예측이 가능하다.
본 발명에 있어서, “이시성 위암(Metachronous Gastric Cancer, MGC)”이란 위암이 최초 진단되고 12개월 이후 발견된 위암을 의미하는 것으로, 보다 구체적으로 조기위암에서 내시경 점막하박리술로 치료한 이후 추적관찰 중 원래 치료 부위 이외의 다른 부위에서 새로 발생하는 위암을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 위암에 의한 최초 진단 12개월 이후 새로 발생하는 위암이라면 모두 포함되는 개념이다.
또한, 본 발명은 CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 내시경 점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “내시경 점막하박리술(Endoscopic submucosal dissection)”이란 위 용종, 선종 및 림프절 전이가 없는 조기위암을 내시경 장치를 이용하여 제거하는 시술을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 내시경 점막하박리술로 치료한 조기위암환자를 대상으로 CDK1, KDF1, CREB5, 또는 AKT2의 발현을 확인하여 이시성 위암의 발병 가능성을 예측하고, 이를 통해 내시경 점막하박리술 치료 후 조기위암환자의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 위암 또는 이시성 위암 발병 가능성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, “키트”는 상기 CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA, 또는 단백질을 측정하는 제제를 포함함으로써, 위암 또는 이시성 위암의 발병 가능성을 예측할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에는 상기 mRNA 또는 단백질을 측정하는 제제 외에도 이들의 검출 방법에 통상적으로 필요한 다른 구성성분, 조성물, 용액, 장치 등이 포함될 수 있다. 이때, 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 검출하는 물질은 1회 이상 횟수에 제한 없이 작용시킬 수 있으며, 각 물질을 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 물질의 적용은 동시에 진행될 수도 있고 미시에 진행될 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명의 키트는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 컨테이너; 지시서; 및 상기 mRNA 또는 단백질의 검출 제제를 포함할 수 있다. 상기 컨테이너는 상기 검출 제제를 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예컨대, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있고, 이들은 부분적 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있으며, 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 지시서를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서, CREB5 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 위암의 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 위암은 이시성 위암을 포함할 수 있고, 상기 방법은 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서 CDK1 및 KDF1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하고, 이를 대조군으로부터 분리된 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서, CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 이시성 위암의 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 조기위암환자에서 분리된 생물학적 시료에서, CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 조기위암환자의 내시경 점막하박리술 치료 후 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), 멀티플렉스 역전사 중합효소연쇄반응(Multi-plex PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBD-seq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법, 및 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 4종 유전자의 발현 정도를 멀티플렉스 역전사효소 중합효소반응(Multi-plex PCR)을 통해 한번에 분석할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수준은 웨스턴 블랏(western blot), 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역조직화학법(Immunohistochemistry, IHC), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준 또는 단백질 수준 측정은 하나의 생물학적 시료로 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 체내의 CDK1, KDF1, CREB5, 또는 AKT2의 mRNA, 또는 단백질의 발현 유무 또는 발현 수준을 확인할 수 있는 모든 시료를 의미하며, 예컨대 피검체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변, 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는 상기 조직은 위 점막(GM) 조직 또는 장상피화생(IM) 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 위암 또는 이시성 위암의 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법은 (c) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 상기 mRNA 또는 단백질의 수준이 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준 보다 높은 경우, 위암 또는 이시성 위암의 발병 위험이 높다고 판정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 조기위암환자의 내시경 점막하박리술 치료 후 예후 예측을 위한 정보제공방법은 (c) 조기위암환자에서 분리된 생물학적 시료에서 측정된 상기 mRNA 또는 단백질의 수준이 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준 보다 높은 경우, 내시경 점막하박리술 치료 후 예후가 좋지 않을 것으로 예측하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 생물학적 시료는 조기위암환자의 종양 주변 위점막 조직일 수 있으며, 내시경 점막하박리술 치료 전, 치료 후, 또는 치료 경과 시간과는 상관 없이 분리 가능할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “예측”은 본 발명의 목적상 위암 또는 이시성 위암의 발병 가능성 또는 위험도를 확인하는 것, 또는 조기위암환자의 내시경 점막하박리술 치료 후 예후를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, "피검체"는 위암의 발병 또는 위암의 재발, 조기위암으로 진단받고 내시경 점막하박리술 치료 전 또는 치료 후 이시성 위암의 발병 가능성 또는 예후를 예측하고자 하는 대상을 의미한다. 본 발명에 있어서, 피검체 또는 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼, 닭, 오리, 거위 등의 위암이 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, “대조군”이란 위암으로 진단되지 않은 개체, 및 조기위암을 진단받고 내시경 점막하박리술 치료 후 이시성 위암이 발생하지 않은 개체를 모두 포함하는 의미이다. 본 발명에 따르면, 위암으로 진단되지 않은 개체로부터 분리된 시료와 위암의 발병 가능성을 예측하고자 하는 피검체로부터 분리된 시료를 비교하여 피검체에서 위암의 발병 가능성을 예측할 수 있고, 내시경 점막하박리술 치료 후 이시성 위암이 발생하지 않은 개체로부터 분리된 시료와 이시성 위암의 발병 가능성을 예측하고자 하는 피검체로부터 분리된 시료를 비교하여 피검체에서 이시성 위암의 발병 가능성을 예측할 수 있다.
본 발명의 위암의 발병 가능성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은, 상기 4종의 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 개체의 시료를 여러 번 채취하는 기존의 방법 대신, 한번의 시료 채취로 단일의 시료로 측정 가능하며, 멀티플렉스 역전사효소 중합효소반응을 이용하여 유전자 발현 수준을 측정하여 위암의 진단 및 예측이 한번의 측정만으로도 가능할 수 있다.
또한, 상기 방법으로서 이시성 위암의 예측이 가능할 뿐만 아니라 정상인에서도 위암 발생 위험도 예측에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, “포함하는” 이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 위암 진단 및 발생 예측을 위한 후보 유전자 선정
내시경 점막하박리술로 치료된 조기위암환자에서 위 점막 조직의 유전체 분석을 통해 위암 발생을 예측하기 위한 바이오마커를 찾기 위해, 내시경 점막하박리술로 치료된 조기 위암 환자에서 진단 당시의 정상 위점막 조직을 획득하여 초저온 냉동고에 보관하고 있는 환자를 대상으로, 추적관찰 중 이시성 위암이 발생한 대상자 23명과, 3년 이상의 추적관찰기간 중 새로운 위암이나 위선종이 발생하지 않은 대상자 23명을 선정하였다.
선정된 대상자에서 진단 당시 초저온냉동고에 보관된 정상 위점막 조직으로 RNA 시퀀싱을 시행하여 차별 발현 유전자(Differentially expressed genes, DEG)를 확인하였다.
또한, 유전자 발현량과 이시성 위암의 개수, 선종의 개수, 위축성 위염, 장상피화생의 정도에 따른 상관분석을 시행하고 자기조직화지도(Self organizing map, SOM) 분석, 동형분석(isoform analysis)을 시행하여 후보 유전자를 선정하였다.
한편, 대상자의 포르말린고정 파라핀 내장 내시경점막하박리 조직을 이용하여 종양 조직에 대해 전 엑솜 시퀀싱(whole exome sequencing, WES)을 시행하였다. 후보 유전자를 대상으로 다양한 위암 세포주 및 정상 위점막 세포주에 대해 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 시행하여 정상 위점막 세포주와 비교하였을 때, 위암 세포주에서 유의한 차이를 보이는 유전자를 선정하였으며, 선정한 유전자를 대상으로 위암 세포주에서 siRNA를 처리하여 세포 생존능력의 차이를 평가하였다.
유효성 평가를 위해 상기 46명과는 독립적으로 내시경 점막하박리술 치료 후 이시성 위암이 발생한 대상자 50명과 이시성 위암이 발생하지 않은 대상자 100명으로 구성된 유효성 평가셋을 구축하여 후보유전자에 대해 real-time qPCR, Western blot, 및 면역조직화학법을 시행하여 비교하였다.
선정된 대상자에서 진단 당시 조직검사를 시행하여 초저온냉동고에 보관된 정상 위점막 조직으로 RNA 시퀀싱을 시행하였고, DESeq2를 이용하여 차별 발현 유전자(DEG)를 확인하였다. 분석 과정에서 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 에 의한 배치 효과(batch effect)가 확인되어 배치 수정(batch correction)을 시행하였다.
그 결과, 총 24개의 DEG가 확인되었으며, 9개는 mGC(내시경 점막하박리술 치료 후 이시성 위암이 발생한 대상자) 군에서, 15개는 control(내시경 점막하박리술 치료 후 이시성 위암이 발생하지 않은 대상자)에서 발현이 유의미하게 증가하였다(도 1a).
또한, 대상 환자군의 임상 정보를 검토하여 이시성 위암의 개수, 선종의 개수, 신생물(위암+선종), 위축성 위염의 정도(OLGA stage), 장상피화생의 정도(OLGMI stage)와 DESeq2를 이용해 확인한 각 유전자별 발현량간의 상관분석을 시행하고 자기조직화지도(Self organizing map, SOM) 및 대체 스플라이싱(Alternative splicing analysis) 분석을 시행하였다.
그 결과, SOM analysis에서 mGC에 따른 유의미한 차이를 보이지는 않았으나, OLGIM stage와 MLH-1 IHC로 분석하였을 때 CREB5가 포함된 unit V7에서 공통적으로 유의미한 연관성이 확인되었다(도 1c).
대체 스플라이싱(Alternative splicing)으로 확인한 동형 단백질(isoform) 분석에서는 mGC 군과 control 군간에 유의미한 isoform 차이는 없었으나, OLGA stage와 OLGIM stage를 분석하였을 때 AKT2의 isoform(도 1d)과 KDM5C의 isoform에서 유의미한 차이를 보였다. 이때, OLGIM stage에 따라 발현에 유의미하게 차이가 있어 타겟으로 설정한 AKT2 isoform의 cDNA 서열(서열번호 7) 및 아미노산 서열(서열번호 8)을 도 1e에 나타내었다.
종양 주변의 정상 위점막 조직으로 시행한 벌크(bulk) RNA 시퀀싱 분석결과와 해당 분석결과를 토대로 추가로 시행한 상관분석, 자기조직화지도, 동형분석 등의 결과, 그리고 이전 연구에서 확인된 유전자들의 기능과 보고 빈도를 토대로 몇 가지 후보 유전자로서 CDK1, KDF1, ERCC6L, KLK8, MCM2, POLR2L, PTN, CREB5, 및 AKT2-isoform을 선정하였다(도 2).
실시예 2. 위암 세포주에서의 후보 유전자 발현 정도 확인을 통한 타겟 유전자 선정 및 단백질 발현 확인
2-1. qRT-PCR을 통한 유전자 발현 확인
종양 주변 정상 위점막 조직으로 시행한 RNA 시퀀싱을 통해 선정한 후보유전자와 종양의 WES로 선정한 후보유전자를 대상으로, 다양한 위암 세포주(장형: SNU216, MKN1, AGS, 미만형: SNU1, SNU5, SNU16, SNU488, SNU601, SNU620, SNU638, MKN45) 및 정상 위점막 세포주(HFE145)에 대해 유전자 발현 정도를 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 시행하여 비교하였다.
선정한 유전자를 대상으로 위암 세포주에서 siRNA를 처리(0 nM, 25 nM, 50 nM)하여 유전자 발현의 억제를 확인하고, siRNA를 처리한 위암 세포주에서 세포 생존능력 억제를 평가하여 비교하고, 상관분석(Correlation analysis)을 이용하여 control 그룹보다 mGC 그룹에서 발현이 높은 것을 확인(도 1b)한 CDK1를 포함하여, mGC 군에서 높은 발현을 보이는 타겟 유전자 3종(CDK1, KDF1, POLR2L)을 선정하였다(도 1a, 도 1b, 및 도 3). 그런 다음, 도 1a 내지 1e및 도 3의 총 5개의 유전자(CREB5, AKT2-isoform, CDK1, KDF1, POLR2L) 중에서 control과 mGC 사이의 발현 차이가 크지 않은 POLR2L을 제외한 CDK1, KDF1, CREB5 및 AKT2-isoform을 최종 타겟 유전자 4종으로 선정하였다(도 4a).
2-2. 웨스턴 블랏(western blot)을 통한 CDK1 및 KDF1 단백질 발현 확인
도 4a에서 이용한 평가 셋 중 일부 환자의 조직에서 단백질을 분리하여 mGC 군에서 높은 발현을 보이는 CDK1 및 KDF1의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.
내시경 점막하박리술 치료 후 이시성 위암이 발생한 대상자 5명과 발생하지 않은 대상자 5명을 임의로 선별하여 CDK1의 단백질 발현을 확인한 결과, 이시성 위암이 발생한 대상자 조직에서 발생하지 않은 대상자의 조직보다 CDK1의 발현이 높음을 확인하였다(도 4b의 상단).
또한, 각각의 군에서 8명의 환자를 임의로 선별하여 KDF1의 단백질 발현을 확인한 결과, CDK1과 마찬가지로 이시성 위암이 발생한 대상자의 조직에서 발생하지 않은 대상자의 조직에 비해 높은 KDF1 발현이 나타난 것을 확인하였다(도 4b의 하단).
이러한 결과는 앞서 qPCR을 통해 mRNA 발현량을 확인한 결과와 동일하게 CDK1 및 KDF1 모두 이시성 위암이 발생한 대상자에서 더 높게 발현됨을 나타내었다.
2-3. 면역조직화학법(Immunohistochemistry, IHC)을 통한 CDK1 및 KDF1 단백질 발현 확인
도 4a에서 이용한 평가 셋 중 일부 환자의 병리 슬라이드에서 앞서 선정한 후보 유전자 CDK1 및 KDF1의 발현을 면역조직화학법을 이용하여 확인하였다.
내시경 점막하박리술 치료 후 이시성 위암이 발생한 대상자 2명과 발생하지 않은 대상자 2명을 임의로 선별하여 CDK1(도 4c) 및 KDF1(도 4d)의 단백질 발현을 확인한 결과, 두 후보 유전자 모두 이시성 위암이 발생한 대상자 조직에서 발생하지 않은 대상자 조직보다 더 강하게 염색되는 것을 확인하였다(도 4c 및 4d). 이는 CDK1 및 KDF1의 단백질이 이시성이 발생한 대상자의 조직에 더 많이 존재함을 의미하며, 이는 상기 실시예 2-1의 qPCR 및 실시예 2-2의 웨스턴 블랏 결과와 동일한 결과이다.
실시예 3. 타겟 유전자 유효성 평가
상기 실시예 1 및 2에서 선정한 타겟 유전자의 유효성 평가를 진행하고자, 후보 유전자 선정을 위해 설정한 대상 환자군인 46명과는 독립적인 유효성 평가 셋을 구축하였다. 해당 셋은 내시경 점막하박리술 치료 후 이시성 위암이 발생한 대상자 50명과 발생하지 않은 대상자 100명으로 구성되며, 역시 나이, 성별, H. pylori 감염 상태를 매칭하여 선정하였다.
상기 실시예 2에서 선별된 네 개의 유전자(CDK1, KDF1, CREB5 및 AKT2-isoform)로 환자군에서 위암 예측의 정확도 판단을 위해 ROC curve를 그렸으며(도 5a 내지 5d), 그 결과 가장 정확도가 높게 나타난 유전자 조합을 하기 표 1 및 도 5c에 나타내었다.
Gene AUC SD 95% Cl P value
CDK1 0.829 0.041 0.749 ~ 0.910 < 0.000
KDF1 0.841 0.038 0.766 ~ 0.916 < 0.000
AKT2-isoform 0.771 0.054 0.664 ~ 0.877 < 0.000
CDK1 + KDF1 + AKT2-isoform 0.890 0.033 0.826 ~ 0.954 < 0.000
Age + Sex + Hp + OLGIM + CDK1 + KDF1 + AKT2-isoform 0.904 0.031 0.843 ~ 0.964 < 0.000
상기 표 1의 결과와 같이, CDK1 ROC curve 분석 결과 정확도는 AUC 0.829 였으며, KDF1 ROC curve 분석 결과 AUC 0.841, AKT2-isoform ROC curve의 AUC는 0.771을 보여 각 유전자의 위암 예측에 대한 정확도가 높음을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 CDK1, KDF1, 및 AKT2-isoform을 조합하여 발현량을 측정하고, ROC curve를 분석한 결과, AUC 0.890으로 정확도가 현저하게 증가됨을 확인하여 상기 네 유전자를 각각 사용할 경우 대비 조합하여 사용할 경우 위암 예측 정확도가 증가됨을 확인하였다.
다음으로, Bulk RNA 시퀀싱 데이터에서 OLGIM(Operative Link on Gastritis Assessment based on Intestinal Metaplasia) stage에 따라 발현 차이를 보이는 CREB5 및 AKT2가 150명의 평가 셋에서도 같은 결과를 나타내는지 확인하고자 RNA를 추출하여 qPCR을 진행하였다. OLGIM stage의 경우 위축의 정도와 범위를 평가하여 총 5단계(stage 0-Ⅳ)로 나누어 나타내고, OLGA stage와 함께 위암 발병 가능성을 예측하는 지표로 사용하는 것이 여러 연구를 통해 보고되었다.
먼저, CREB5의 경우 OLGIM stage가 높아짐에 따라 CREB5의 발현이 강하게 나타나는 것을 확인하였다(도 6). 즉, 장상피화생을 평가의 근거로 하는 OLGIM 시스템에서, 위암 발생의 고위험군인 stage 3 및 4에서 CREB5의 발현량이 현저히 증가됨을 확인하여 위암 예측이 가능함을 확인할 수 있었다.
또한, 대체 스플라이싱을 분석한 결과, 전체 발현되는 AKT2의 RNA양은 OLGIM stage와 큰 연관이 없었으나, 특정 isoform의 발현이 OLGIM stage에 따라 크게 차이 나는 것을 확인하였는 바(도 1d), 이후 보유하고 있는 평가 셋 샘플 중 OLGIM stage가 높은 환자군과 낮은 환자군을 나누어 실험을 진행하였다.
각각의 그룹에서 앞서 확인한 AKT2 특정 동형 단백질의 발현을 qPCR을 통해 확인한 결과, OLGIM stage가 낮은 환자군에 비해 높은 환자군에서 AKT2의 특정 isoform 발현이 상당히 높음을 확인하였다(도 7).
상기 결과로부터, 위암의 발병 가능성 예측 인자로서 CDK1, KDF1, CREB5, 및 AKT2 isoform의 활용 가능성을 확인할 수 있었으며, 상기 유전자들의 발현 증가에 따라 이시성 위암 또는 원발성 위암의 발생 예측 마커로서의 활용이 가능하다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 위암 발병 가능성 예측은 하나의 조직 검체로 확인 가능한 것으로서, multi-plex PCR 등을 이용하여 한번의 측정 방법으로 위암의 발병 가능성 예측이 가능하므로 활용도가 높다는 점에 기술적 이점이 있다. 또한, 이시성 위암뿐 아니라 정상인에서도 위암 발병을 예측할 수 있는 정량적인 방법으로 기저위염을 정량화할 수 있는 방법을 포함하므로, 위암 가족력이 있거나 위험인자가 있는 정상인에서 위암 발생 위험도를 예측할 수 있는 방법을 동시에 제공한다. 아울러, 내시경 점막하박리술로 치료된 조기위암환자에서 이시성 위암의 발생을 예측함으로써 환자의 내시경 점막하박리술 치료 후 예후를 예측할 수 있다.

Claims (20)

  1. KDF1의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 CDK1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 KDF1의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측용 조성물.
  6. 제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측용 키트.
  8. 삭제
  9. KDF1의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 예후 예측용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 CDK1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 예후 예측용 조성물.
  11. (a) 피검체에서 분리된 생물학적 시료에서, KDF1의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 방법은 (a) 및 (b) 단계 사이에 CDK1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 KDF1의 mRNA 수준은 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), 멀티플렉스 역전사 중합효소연쇄반응(Multi-plex PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay), 메틸화된 DNA 결합 도메인 시퀀싱(MBD-seq: Methylated DNA binding domain sequencing) 분석 방법, 및 중아황산염 처리 시퀀싱(RRBS: Reduced representation bisulfite sequencing) 분석 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 단백질 수준은 웨스턴 블랏(western blot), 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역조직화학법(Immunohistochemistry, IHC), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법.
  15. 삭제
  16. 제11항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 피검체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 소변, 및 대변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법.
  17. 제11항 내지 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (c) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 상기 mRNA 또는 단백질의 수준이 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준 보다 높은 경우, 이시성 위암의 발병 위험이 높다고 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 내시경점막하박리술로 치료된 조기위암환자의 이시성 위암 발병 가능성 예측을 위한 정보제공방법.
  18. 삭제
  19. (a) 조기위암환자에서 분리된 생물학적 시료에서, KDF1의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 mRNA 또는 단백질 수준을 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 조기위암환자의 내시경 점막하박리술 치료 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 방법은 (a) 및 (b) 단계 사이에 CDK1, CREB5, 및 AKT2로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조기위암환자의 내시경 점막하박리술 치료 후 예후 예측을 위한 정보제공방법.
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