JP5640271B2 - 新規ペプチド及びその使用 - Google Patents
新規ペプチド及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5640271B2 JP5640271B2 JP2010060658A JP2010060658A JP5640271B2 JP 5640271 B2 JP5640271 B2 JP 5640271B2 JP 2010060658 A JP2010060658 A JP 2010060658A JP 2010060658 A JP2010060658 A JP 2010060658A JP 5640271 B2 JP5640271 B2 JP 5640271B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- enzyme
- cathepsin
- activity
- measured
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 152
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 144
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 144
- 102000004178 Cathepsin E Human genes 0.000 claims description 93
- 108090000611 Cathepsin E Proteins 0.000 claims description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 54
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 31
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 11
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 8
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 133
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 80
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 15
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 9
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 9
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 8
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 8
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 102000003908 Cathepsin D Human genes 0.000 description 4
- 108090000258 Cathepsin D Proteins 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 2
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 description 2
- 101710097160 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 108010064171 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014944 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710116782 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100038225 Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710116771 Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 231100000405 induce cancer Toxicity 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
酵素の存在量を知るためにその活性を直接測定する方法は、酵素の基質や検出方法に工夫を凝らし測定感度を高めることで微量に存在する酵素を検出することが可能であり、最も一般的に利用されている。また、抗体を使用して酵素を検出する方法として、ELISA法などが知られており、特異性の高い抗体を利用することで、高い精度で目的酵素の量を評価することが可能となる。これらの酵素検出方法は、すでにその方法論が確立しており、通常は、これらの方法を利用することである程度の目的を達成することができる。
抗体を利用して酵素などのタンパク質を検出する方法は、特異性の高い抗体を使用する限り精度が高く有効な方法であるが、特異性の高い抗体の調製は、それほど容易なことではない。サンドイッチELISA法に使用するためには、異なるエピトープに対する特異的な抗体が2種類以上必要となるため、抗体の調製にはさらに時間と費用が必要となってくる。
さらに、本発明は、疾患との関連が示唆されているカテプシンEと結合し、その活性を調節(促進又は阻害)するペプチドを提供する。
これまでに、微量に存在する酵素などの生体分子を検出する方法として、抗体を利用したELISA法あるいはサンドイッチELISA法が使用されてきた。この方法は、抗体を利用することから検出対象分子に対する特異性が非常に高く、正確な量の測定を可能にする方法として、優れている。しかしながら、この方法は、抗体の性質(特異性や親和性)によって検出結果が大きく影響されやすい。また、ELISA法で利用可能な検出対象に特異性の高い抗体を作製することは、時間、費用、手間が掛かり、容易なことではなく、親和性に関しても、通常、〜nM程度の結合強度の抗体を得るのが限界でそれ以上に強い結合親和性を有する抗体の作製は極めて困難である。
本発明者らは、in−vitro−virus(IVV)法を利用した、分子淘汰操作により、検出対象である酵素に特異的に結合するペプチドを使用することで、ELISA法に比較して、より簡便で高感度に酵素量の測定が可能になることを見出した。そして、カテプシンEの活性を有効に調節するペプチドをも見出した。
以下の(a)〜(c)の工程を含む酵素量測定方法である。
(a)酵素と特異的に結合する第1ペプチドを該酵素に結合させる工程、
(b)該酵素と第1ペプチドの結合体以外の夾雑物を除去する工程、
(c)該酵素と該ペプチドの結合体に該酵素の基質を接触させ、該酵素活性を測定する工程、
以下の(a)〜(d)の工程を含む酵素量測定方法である。
(a)酵素と特異的に結合する第1ペプチドを該酵素に結合させる工程、
(b)該酵素と特異的に結合する第2ペプチドを該酵素に結合させる工程、
(c)該酵素と第1及び第2ペプチドの結合体以外の夾雑物を除去する工程、
(d)第1又は第2ペプチドの存在量を測定する工程、
本発明を使用することができる試料は、測定対象酵素がある程度精製された試料の他、血液などの夾雑物が多数含まれている生体内試料などが含まれ、特に限定されるものではない。また、本発明の適用対象となる酵素は、従来技術においてその活性測定方法が確立されているものであれば、特に限定されるものではない。本発明は、例えば、酸化還元酵素、キナーゼなどの転移酵素、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ(あるいは、プロテアーゼ)などの加水分解酵素、デカルボキシラーゼなどのリアーゼ、ラセマーゼやエピメラーゼなどの異性化酵素及びリガーゼなど、各種酵素の試料中の存在量の検出に使用することができる。また、本発明は、活性測定法が確立している酵素であればいかなる酵素であってもその存在を迅速、簡便かつ高感度に検出することができる。特に本発明の測定法の対象として好ましい酵素は、カテプシンなどのプロテアーゼ又はペプチダーゼである。
(a)酵素と特異的に結合する第1ペプチドを該酵素に結合させる工程、
(b)該酵素と第1ペプチドの結合体以外の夾雑物を除去する工程、
(c)該酵素と該ペプチドの結合体に該酵素の基質を接触させ、該酵素活性を測定する工程、
本実施形態は、例えば、測定対象酵素をカテプシンEとした場合、図1Aのように示すことができる(本実施形態をここでは「通常型」と称する)。測定対象の酵素に特異的に結合するペプチドに測定対象酵素を結合させる(工程(a))。その後、測定対象酵素とペプチドの結合体(以下、「酵素−ペプチド結合体」と記載する)と試料中に存在する夾雑物(例えば、血液サンプルであれば、血球成分や、血清アルブミンなどのタンパク質成分など)を分離(又は除去)し、酵素−ペプチド結合体のみを取得する(工程(b))。ここで、酵素−ペプチド結合体と夾雑物を分離(又は除去)する場合、例えば、予めペプチドを担体に固定し(ペプチドと担体との固定は、ペプチドと酵素を結合させる前の段階で行うのが望ましい)、夾雑物をバッファー等で洗浄することによって、ペプチドを担体に固定したまま、夾雑物を洗い流すことができる。ここで、担体としては、夾雑物を洗い流す前のいずれかの段階においてペプチドを固定することができるものであれば如何なるものであってもよく、例えば、磁気ビーズ、プレート(例えば、細胞培養用のウェルを有するプレートなど)などが利用可能である。磁気ビーズを使用する場合、予めペプチドを磁気ビーズに結合させたものを、測定対象酵素が含まれる試料中に添加し、ペプチドと測定対象酵素との結合を行わせる(工程(a))。ペプチドと測定対象酵素を結合させるための条件、例えば、試料溶液のpH、温度、結合時間などは、測定対象酵素に依存して異なるが、これらの条件決定のための予備的な実験を行うことで、当業者であれば容易に決定することができる。次に、磁力などを利用して磁気ビーズ上に固定されている酵素−ペプチド結合体を適当なバッファーで洗浄等行い、夾雑物を洗い去る(工程(b))。夾雑物から分離した酵素−ペプチド結合体に、該酵素の基質を接触させ、適当な方法により酵素活性を測定する(工程(c))。以上のステップを行うことによって、試料中に存在する測定対象酵素の活性を特異的に測定することが可能となる。また、担体としてプレートを使用した場合には、プレートに結合したペプチドに測定対象酵素を結合させることにより、酵素をプレート上に固定し、プレート上を適当なバッファー等で洗浄することで、酵素をプレート上に固定したまま夾雑物を洗い流すことができる。
(a)酵素と特異的に結合する第1ペプチドを該酵素に結合させる工程、
(b)該酵素と特異的に結合する第2ペプチドを該酵素に結合させる工程、
(c)該酵素と第1及び第2ペプチドの結合体以外の夾雑物を除去する工程、
(d)第1又は第2ペプチドの存在量を測定する工程、
本実施形態は、例えば、測定対象酵素をカテプシンEとした場合、図1Bのように示すことができる(本実施形態をここでは「超特異性型」と称する)。測定対象の酵素に特異的に結合するペプチド(第1ペプチドとする)に測定対象酵素を結合させる(工程(a))。次に、該酵素に特異的な他のペプチド(第2ペプチドとする)を該酵素に結合させる(工程(b))。第1ペプチド及び第2ペプチドと測定対象酵素を結合させるための条件、例えば、試料溶液のpH、温度、結合時間などは、測定対象酵素に依存して異なるが、これらの条件決定のための予備的な実験を行うことで、当業者であれば容易に決定することができる。その後、測定対象酵素と第1及び第2ペプチドと結合体(以下、「酵素−第1及び第2ペプチド結合体」と記載する)と試料中に存在する夾雑物を分離し、酵素−第1及び第2ペプチド結合体のみを取得する(工程(c))。ここで、酵素−第1及び第2ペプチド結合体と夾雑物との分離は、上記「通常型」の場合と同様に、予め第1ペプチドを担体に固定し(第1ペプチドと担体との固定は、第1ペプチドと酵素を結合させる前の段階で行うことが望ましい)、夾雑物をバッファー等で洗浄することによって行うことができる。また、酵素と第1及び第2ペプチドの結合体と夾雑物との分離のために行う洗浄は、第1ペプチドと酵素を結合させた後の段階、又は、第2ペプチドをさらに結合させた後の段階、あるいは、その両方の段階において行うことができる。
本発明の方法を使用してカテプシンEの量を測定するためには、カテプシンEに特異的に結合するペプチドが必要となる。そのようなペプチドとしては、例えば、特開2007−332085号公開公報中の〔表2−1〕、〔表3−1〕に記載されるアミノ酸配列からなるペプチドの他、本願明細書に添付される配列表の配列番号1〜配列番号35に示されるアミノ酸配列を挙げることができる。これらのペプチドは、IVV法を利用した分子淘汰操作によって取得することができる(例えば、特開2007−332085などを参照のこと)。これらのペプチドのうち、配列番号12〜配列番号23及び配列番号32〜配列番号35に示されるペプチドは、カテプシンEの活性を促進することができるため、本発明の実施形態の「通常型」の実施において好適に使用することができる。
本発明の配列番号1〜11のアミノ酸配列を含むカテプシンE活性阻害ペプチド、及び、さらに、配列番号12〜23のアミノ酸配列を含むカテプシンE活性促進ペプチドは、カテプシンEが関連する疾患の治療又は予防剤の開発に使用することができる。また、本発明のカテプシンE活性阻害剤又はカテプシンE活性化剤は、カテプシンEの活性の低下あるいは亢進に起因する疾患の治療又は予防に利用することができる。
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の酵素量測定方法を用いて、マウス臓器中に存在するカテプシンEの酵素量を「通常型」で測定した。
野生型雄マウス及びコントロールとして、カテプシンEを欠損した雄マウスから、脾臓及び胃の上皮粘膜を各々採取した。採取した脾臓と胃の粘膜上皮をLysis bufferA(20mMリン酸緩衝液(pH7.4)、Triton X−100(最終濃度 0.1%))で抽出し、これらの抽出物をpH4.5の緩衝液で置換した後、カテプシンEの酵素量を測定した。本実施例では、第1ペプチドとして、配列番号1(ペプチドAとする)及び配列番号2(ペプチドBとする)を使用し、カテプシンEの基質として、KYS−1(ペプチド研究所)、また、カテプシンE及びカテプシンDの基質として3200−v(ペプチド研究所)を使用した。
マウスから調製した脾臓細胞抽出物及び胃の上皮粘膜細胞抽出物を反応用緩衝液(50mM酢酸ナトリウム、100mMNaCl pH4.0)を用いて、滴定して、pH4.5にあわせた。この段階で、細胞抽出物は白濁するため、さらに、15,000rpm、5分間遠心し、その上清を得た。酵素活性の測定は、白濁状態のサンプルと遠心後の上清サンプルの両方について行った。
その結果、ペプチドAを使用した場合、脾臓組織中のカテプシン活性については、野生型マウス由来のサンプル(W)とカテプシンE欠損マウス由来のサンプル(KO)で比較的良好な測定活性の差が認められた(図2及び図3の「脾臓組織」を参照)。また、白濁したサンプルと上清サンプルによる測定結果もほぼ同様の傾向を示していた。胃粘膜については、カテプシンE欠損型マウス由来のサンプルについても、比較的高い酵素活性の存在が認められた。この点については、胃には、カテプシンEと構造及び機能的類似性の高いペプシンが分泌されているため、用いたペプチドがペプシンと結合した可能性、あるいは、用いた基質がペプシンによって認識された可能性が想定され、その結果、酵素活性として高めの活性が検出されたものと考えられる(図2及び図3の「胃粘膜細胞」を参照)。
ペプチドBについても同様に測定を行った(図4及び図5)。その結果、野生型とカテプシンE欠損型で、酵素活性の相違は認められたものの、ペプチドAの方が良好な結果を示していた。
次に、マウス血清についても上記と同様にしてカテプシンEの酵素量を「通常型」で測定した。血清については、pHを4.5にしても白濁は生じなかったため、遠心等を行わずにそのまま測定を行った。
ペプチドAを使用した場合、基質としてKYS−1及び3200−vのいずれを用いた場合も、カテプシンE欠損マウスの血清中の酵素活性は有意に減少していた。従って、ペプチドAを使用して本発明の活性測定方法を実施した場合、血清に対しても良好な結果を得ることができた(図6)。また、ペプチドBについても、3200−vを使用して測定したところ、カテプシンE欠損マウスの血清中の酵素活性は有意に減少しており、良好な結果が得られた(図7)。各図に示される結果は、ペプチドを入れずに行った一連の操作から得られた数値を0%(バックグラウンドとほぼ同じ値)とし、カテプシンE(40nM)を投入して測定した数値を100%として表示した。
本実施例の1と2は、カテプシンEの活性を阻害するペプチドを使用して、「通常型」によるカテプシンEの酵素量を測定したものであるが、カテプシンEの酵素量を有効に測定することができた。次に、カテプシンEの活性を促進するペプチドを使用して、「通常型」による測定を行った。
活性促進ペプチドとして配列番号12(ペプチドCとする)(ペプチドの促進活性については表1を参照のこと)を使用して、上記と同様にカテプシンEの酵素量を測定した(図8)。基質には、KYS−1を使用した。図8に示される結果は、ペプチドを入れずに行った一連の操作から得られた数値を0%(バックグラウンドとほぼ同じ値)とし、カテプシンE(40nM)を投入して測定した数値を100%として表示した。
その結果、活性促進ペプチドのペプチドCを使用した場合(図8A)の方が、活性阻害ペプチドのペプチドAを使用した場合(図8B)より、カテプシンE欠損マウス血清と野生型マウス血清中の酵素活性の差がより顕著に検出されることが分かった。
従って、「通常型」の測定において、同じ親和性ならば、酵素活性を促進するペプチドを用いると、より高感度な結果が得られると考えられる。
本実施例では、第1ペプチドにペプチドAを使用し、第2ペプチドにペプチドCを使用した。まず、ペプチドAをTakara Peptide Coating Kit(TAKARA社)を使用し、添付の仕様説明書の記載に従って、96ウェルプレート中に固定化した。ペプチドを固定化した各ウェルに、上記と同様の血清サンプル(野生型マウス由来及びカテプシンE欠損マウス由来)を30μlずつ添加し、25℃で20分間インキュベートして酵素とペプチドを結合させた。その後、未結合の夾雑物を反応用緩衝液で洗浄し、次に、ペルオキシダーゼ標識したペプチドC(0.5ng/μl)を、50μlずつ添加し、室温で20分間のインキュベートによりカテプシンEとペプチドCを結合させた。その後、未結合のペプチドCを反応用緩衝液で洗浄し、ペルオキシダーゼ基質であるQuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate(TAKARA社)を100μl添加し、37℃で10分間インキュベート後Ex:360nm、Em:430nmで蛍光を測定した。結果は、カテプシンE(40nM)を使用して測定した結果を100%として表示した(図9)。図に示される結果は、ペプチドを入れずに行った一連の操作から得られた数値を0%(バックグラウンドとほぼ同じ値)とし、カテプシンE(40nM)を投入して測定した数値を100%として表示した。
本発明のペプチドのカテプシンE活性に及ぼす影響について検討した。
カテプシンEに対する影響は、ペプチド(40nM)とカテプシンE(40nM)を反応用緩衝液95μl中で混合し、そこに100μMの3200−v溶液を5μl加えて40℃で10分間反応させた後、Ex:360nm、Em:430nmで蛍光を測定した。測定結果はペプチド、カテプシンEを入れずに行った一連の操作から得られた数値を0%(バックグラウンドとほぼ同じ値)とし、カテプシンE(40nM)のみを投入して測定した数値を100%として表示した。測定結果を表1に示す。
Claims (9)
- 以下の(a)〜(d)の工程を含む酵素量測定方法。
(a)酵素と特異的に結合する第1ペプチドを該酵素に結合させる工程、
(b)該酵素と特異的に結合する第2ペプチドを該酵素に結合させる工程、
(c)該酵素と第1及び第2ペプチドの結合体以外の夾雑物を除去する工程、
(d)第1又は第2ペプチドの存在量を測定する工程、 - 前記第1ペプチド又は第2ペプチドが担体に結合していることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記担体がプレート又は磁気ビーズであることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記酵素がプロテアーゼ又はペプチダーゼであることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。
- 前記酵素がカテプシンであることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 前記カテプシンがカテプシンEであることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記酵素に特異的に結合するペプチドが配列番号1〜配列番号24で表されるペプチドのいずれかであることを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 請求項1乃至6のいずれかに記載の方法を実施するための、前記第1ペプチド及び/又は第2ペプチドを含んで成る酵素量測定用キット。
- 請求項6に記載の方法を実施するためのキットであって、前記第1ペプチド又は第2ペプチドとして、配列番号1〜配列番号24で表されるペプチドを含んで成る、請求項8に記載の酵素量測定用キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010060658A JP5640271B2 (ja) | 2009-10-26 | 2010-03-17 | 新規ペプチド及びその使用 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009245763 | 2009-10-26 | ||
JP2009245763 | 2009-10-26 | ||
JP2010060658A JP5640271B2 (ja) | 2009-10-26 | 2010-03-17 | 新規ペプチド及びその使用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011115146A JP2011115146A (ja) | 2011-06-16 |
JP5640271B2 true JP5640271B2 (ja) | 2014-12-17 |
Family
ID=44281244
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010060658A Active JP5640271B2 (ja) | 2009-10-26 | 2010-03-17 | 新規ペプチド及びその使用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5640271B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7199691B2 (ja) * | 2018-08-20 | 2023-01-06 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | カテプシンeに強く結合し活性化するペプチド |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2589563A1 (en) * | 2004-06-25 | 2006-01-05 | Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of screening compound directly activating glycogen synthase |
JP4979992B2 (ja) * | 2006-06-16 | 2012-07-18 | 独立行政法人科学技術振興機構 | カテプシンe特異的阻害剤 |
JP5210620B2 (ja) * | 2007-12-19 | 2013-06-12 | 独立行政法人科学技術振興機構 | ペプチドアプタマーライブラリーの作製方法および用途 |
-
2010
- 2010-03-17 JP JP2010060658A patent/JP5640271B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2011115146A (ja) | 2011-06-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5630757B2 (ja) | Psaの分析方法、及び前記分析方法を用いた前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別方法 | |
US20070254317A1 (en) | Method for Detecting the Activatable Free Form of Psa and the Use Thereof for Diagnosing Benign Pathologies of the Prostate and Adenocarcinoma of the Prostate | |
JP2012510618A (ja) | 補体固定抗体の検出のための方法および組成物 | |
KR101219519B1 (ko) | 렉틴을 이용한 암 진단 방법 | |
CN101523213A (zh) | 天然形式人自分泌运动因子特异的抗体、其筛选方法、以及通过测定自分泌运动因子而检测恶性淋巴瘤的方法和检测试剂 | |
US6824988B2 (en) | Method and compositions for use in diagnosing and characterizing chronic immune disease | |
JP4593117B2 (ja) | 炎症性疾患および敗血症を診断するための、カルバモイルリン酸シンテターゼ1(cps1)およびその断片の使用 | |
JPH11500302A (ja) | プロテアーゼ類の検出用の検定法 | |
JP2024026847A (ja) | 完全長の高分子量キニノーゲン(hmwk)と切断されたhmwkとを区別するためのペプチド定量アッセイ | |
JP4621593B2 (ja) | フォンヴィルブランド因子分解酵素の測定による血栓症の検出方法 | |
US20210018502A1 (en) | Method for presymptomatic diagnosis of coeliac disease and gluten sensitivity | |
JP5640271B2 (ja) | 新規ペプチド及びその使用 | |
KR20150140657A (ko) | 자간전증의 진단을 위한 방법 및 조성물 | |
EP3362473B1 (en) | Use of a fibrinogen capture agent to detect a ciz1 b-variant | |
WO2011138955A1 (ja) | Siaα2-8Siaα2-3Galβ-R糖鎖を持つムチン1の分析方法 | |
WO2021065306A1 (ja) | 血液試料を検体とするタウタンパク質検出方法 | |
JP2020504311A (ja) | 固定分析物 | |
US7527938B2 (en) | Methods for diagnosis and treatment of chronic immune diseases | |
KR102677901B1 (ko) | 보체 C4d 분석 | |
WO2024130093A2 (en) | Assays and methods for detection of biomarkers associated with neurological diseases | |
KR20230020820A (ko) | 유방암 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
CN115925846A (zh) | 用于检测针对Ses iPR-10变应原的抗体的方法和试剂 | |
US20190383816A1 (en) | Method and composition for detection of proteolytic products and diagnosis of malignant neoplastic disease | |
Elliott-Friend | Investigation into inter-alpha trypsin inhibitor heavy chain 4 (ITIH4) as a biomarker for prenatal screening of Down syndrome using maternal plasma samples | |
WO2014064528A2 (ja) | α‐ガラクトシダーゼ濃度を測定する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130314 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140714 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140827 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141003 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141008 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5640271 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |