CN113564172A - 一种液体活检肿瘤细胞dna适配体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，包括以细胞表面表达的Vimentin蛋白为靶向蛋白CSV，采用whole‑cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV‑Aptamer，本发明涉及生物工程技术领域。该液体活检肿瘤细胞DNA适配体，可实现以细胞表面表达的Vimentin(波形蛋白)蛋白(CSV)为靶向蛋白，采用whole‑cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体(CSV‑Aptamer)，并将筛选出来的核酸适配体进行功能研究，开发出在早期诊断和治疗中的用途。前期利用crisp‑9技术构建了Vimentin基因敲除的肿瘤细胞系，可以作为筛选核酸适配体过程中非常关键的阴性对照细胞系，通过筛选Vimentin阳性细胞和阴性细胞，双向筛选，达到快速筛选出目标分子的目的，具有高筛选效率和成功率。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体。
背景技术
根据世界卫生组织最新公布的数据，2020年有1930多万新发癌症病例，有1000万人死于癌症。全球癌症死亡人数占总死亡人数的近六分之一。预计到2030年这一数字将增加到2100多万。目前，早期诊断和早期治疗仍然是肿瘤预防和治疗的关键。临床上的早期诊断主要依赖影像学检查，比如B超和CT，但其在恶性肿瘤确诊方面存在不足，肿瘤组织病理学诊断仍是肿瘤确诊的主要手段。但由于肿瘤组织的异质性，肿瘤组织块常常不能完全反映体内肿瘤的真实情况，且往往标本难以获得。在缺乏有效的早期检测方法的情况下，患者在肿瘤确诊后常已经处于晚期或已经远处转移。因此，临床急需一种快速、无创、方便、准确的肿瘤早期检测方法。
近年来，液体活检(liquid biopsy)在肿瘤检测中的应用越来越受到人们的重视。液体活检使用病人的血液或尿液作为样本，因此比较容易获得，且损伤微小或无创，细胞表面表达的Vimentin(Cell Surface Vimentin，CSV)作为一种仅在肿瘤细胞上表达，而不存在于正常细胞表面的生物标志物，而且其作为EMT过程中过度表达的关键蛋白，有可能成为体外液体活检中筛选CTC的，能反映出肿瘤恶性程度的独特标志物，具有重要的临床指导意义。
随着研究的不断深入，Vimentin逐渐被公认为EMT的权威标志物，在肿瘤研究中发挥着重要作用，经研究测试，结果表明，该抗体能特异性地结合血液中肿瘤细胞的细胞表面Vimentin，有效地提高了检出率，同时，抗体与细胞表面Vimentin结合可导致肿瘤细胞死亡，而不影响正常细胞的存活，也显示了这一方法在肿瘤治疗方面的潜在价值。但抗体由于具有高免疫原性、稳定性差、化学修饰困难、生产方法有限及生产成本昂贵等缺点，在一定程度上限制了其临床应用。
核酸不仅是遗传信息的载体，也是生物体内具有生物活性的重要功能分子。一些单链核酸具有与蛋白质一样复杂的三级结构，可以进行配体结合、催化和基因表达调控等化学反应，称为核酸适配体(Aptamer)。Gold及其学生Tuerk利用大容量的随机核酸库及体外PCR扩增技术，筛选到能特异结合噬菌体T4 DNA多聚酶的RNA分子，并将这一技术命名为基于指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)，与抗原抗体反应一样，适配体以构象互补模式特异识别靶点，并以高亲和力与其结合。此外，由于小分子核酸的理化性质，核酸适配体在临床应用和生产中具有许多优势：如无/低免疫原性，组织渗透快，细胞内能力强，能识别更广泛的靶点等，提高了核酸适配体的临床应用潜力。同时，简单而经济的固相合成技术的发明使核酸适配体更易于大规模生产。由于具有同样的高亲和力、高特异性和靶结合能力，在化学修饰、稳定性和生产成本等方面具有明显的优势，核酸适配体取代或补充了上述抗体技术的不足，在肿瘤诊断中得到了广泛的应用。例如，核酸适配体可用于液体活检中循环肿瘤细胞(CTC)检测、免疫组织化学分析和体内成像。因此，靶向CSV的核酸适配体未来同样有可能被用于早期检测肿瘤细胞，确定预后，临床治疗和评估药物疗效等方面，而且易于构建、易于生产。
目前对肿瘤细胞膜表面而非正常细胞膜表面表达的生物标志物进行特异性鉴定，从而提高循环肿瘤细胞检测的特异性和有效性是非常重要和迫切的。尽管最近人们提出了各种方法和生物标志物，但大多数方法和生物标志物并不可靠。液体活检需要高度特异性和有效性的生物标志物的支持，这些标志物如果只在已经经历上皮间充质转变的恶性肿瘤细胞上特异性表达，且没有在正常细胞中表达，就能有效地区分循环肿瘤细胞，特别是恶性循环肿瘤细胞。因此，细胞表面Vimentin有潜力成为这一特殊要求的生物标志物，核酸适配体可以以其诸多优点承担这一生物标志物特异性高亲和力标记的任务，同时在肿瘤治疗方面也具有巨大的潜力。
本发明以细胞表面表达的Vimentin(波形蛋白)蛋白(CSV)为靶向蛋白，采用whole-cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体(CSV-Aptamer)，并将筛选出来的核酸适配体进行功能研究，开发出在早期诊断和治疗中的用途。前期利用crisp-9技术构建了Vimentin基因敲除的肿瘤细胞系，可以作为筛选核酸适配体过程中非常关键的阴性对照细胞系，通过筛选Vimentin阳性细胞和阴性细胞，双向筛选，达到快速筛选出目标分子的目的。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，解决了现有检测方法和生物标志物并不可靠的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，包括以细胞表面表达的Vimentin蛋白为靶向蛋白CSV，采用whole-cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV-Aptamer。
优选的，采用所述whole-cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV-Aptamer的方法具体包括：
S1、设计并合成一个含1014-1015个随机序列的核酸库(initialoligonucleotide pool)，每个随机序列由两端已知的引物区和中间随机区组成；
S2、将随机核酸库与目标生物靶点孵育(incubation)，形成核酸适配体-靶点复合体；
S3、将与靶点结合的核酸适配体与其他核酸分子进行分离(partitioning)；
S4、将与靶点结合的核酸适配体通过PCR扩增(amplification)，形成一个富集的次级核酸库(enriched sub-pool)，将其与靶点重新孵育，进行下一轮筛选；
S5、经过8-20轮筛选，当富集程度达到饱和后，对富集的核酸库进行测序分析(sequencing)，鉴定特异性核酸适配体序列；
S6、为消除非特异核酸分子与靶点的结合，在SELEX过程中引入2-5轮负向筛选(counter-selection)，即采用前期构建的Vimentin-KO细胞系，将会显著提将筛选得到的PCR产物克隆到质粒中，采用随机挑选100个克隆一代测序和PCR产物直接高通量测序相结合，分析筛选得到的Aptamer序列，并纯化获得更多的Aptamer分子，再与野生型肿瘤细胞和基因敲除细胞系做亲和度和特异性检测，选取最优序列的Aptamer分子。
优选的，所述步骤S1中中间随机区为30-50个碱基。
优选的，所述步骤S6中将最优Aptamer进行荧光化学基团修饰，与各类肿瘤细胞系结合，通过流式细胞仪检测肿瘤细胞的检出率，再采用临床血液标本检测CTC，对照临床资料，分析CSV-Aptamer在临床中的检出率和恶性肿瘤的相关性。
优选的，研究筛选出来的CSV-Aptamer在野生型肿瘤细胞系中的作用分析具体如下：将筛选出来的CSV-Aptamer加入培养的各种野生型肿瘤细胞系，观察其对肿瘤细胞的影响，如活力、凋亡率和基因表达差异，分析其作为靶向治疗的潜力。
优选的，将筛选出来的适配体CSV-Aptamer改造成携带各种药物靶向肿瘤细胞的治疗方法，如治疗性核酸适配体、核酸适配体偶联药物(aptamer-drug conjugates，AptDC)、核酸适配体靶向的纳米药物、核酸适配体介导的免疫治疗等。
(三)有益效果
本发明提供了一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体。与现有技术相比具备以下有益效果：该液体活检肿瘤细胞DNA适配体，通过采用(Whole-Cell SELEX，WCS)技术，利用前期构建的阴性选择细胞系Vemintin-KO胃癌细胞系，经20-30轮循环，筛选出特异性高、结合紧密的Aptamer，可实现以细胞表面表达的Vimentin(波形蛋白)蛋白(CSV)为靶向蛋白，采用whole-cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体(CSV-Aptamer)，并将筛选出来的核酸适配体进行功能研究，开发出在早期诊断和治疗中的用途。前期利用crisp-9技术构建了Vimentin基因敲除的肿瘤细胞系，可以作为筛选核酸适配体过程中非常关键的阴性对照细胞系，通过筛选Vimentin阳性细胞和阴性细胞，双向筛选，达到快速筛选出目标分子的目的，具有高筛选效率和成功率。
附图说明
图1为本发明采用所述whole-cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV-Aptamer的方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明实施例提供一种技术方案：一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，包括以细胞表面表达的Vimentin蛋白为靶向蛋白CSV，采用whole-cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV-Aptamer。
本发明实施例中，采用whole-cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV-Aptamer的方法具体包括：
S1、设计并合成一个含1014-1015个随机序列的核酸库(initialoligonucleotide pool)，每个随机序列由两端已知的引物区和中间随机区组成；
S2、将随机核酸库与目标生物靶点孵育(incubation)，形成核酸适配体-靶点复合体；
S3、将与靶点结合的核酸适配体与其他核酸分子进行分离(partitioning)；
S4、将与靶点结合的核酸适配体通过PCR扩增(amplification)，形成一个富集的次级核酸库(enriched sub-pool)，将其与靶点重新孵育，进行下一轮筛选；
S5、经过8-20轮筛选，当富集程度达到饱和后，对富集的核酸库进行测序分析(sequencing)，鉴定特异性核酸适配体序列；
S6、为消除非特异核酸分子与靶点的结合，在SELEX过程中引入2-5轮负向筛选(counter-selection)，即采用前期构建的Vimentin-KO细胞系，将会显著提将筛选得到的PCR产物克隆到质粒中，采用随机挑选100个克隆一代测序和PCR产物直接高通量测序相结合，分析筛选得到的Aptamer序列，并纯化获得更多的Aptamer分子，再与野生型肿瘤细胞和基因敲除细胞系做亲和度和特异性检测，选取最优序列的Aptamer分子。
本发明实施例，步骤S1中中间随机区为30-50个碱基。
本发明实施例，步骤S6中将最优Aptamer进行荧光化学基团修饰，与各类肿瘤细胞系结合，通过流式细胞仪检测肿瘤细胞的检出率，再采用临床血液标本检测CTC，对照临床资料，分析CSV-Aptamer在临床中的检出率和恶性肿瘤的相关性。
本发明实施例中，研究筛选出来的CSV-Aptamer在野生型肿瘤细胞系中的作用分析具体如下：将筛选出来的CSV-Aptamer加入培养的各种野生型肿瘤细胞系，观察其对肿瘤细胞的影响，如活力、凋亡率和基因表达差异，分析其作为靶向治疗的潜力或将筛选出来的适配体CSV-Aptamer改造成携带各种药物靶向肿瘤细胞的治疗方法，如治疗性核酸适配体、核酸适配体偶联药物(aptamer-drug conjugates，AptDC)、核酸适配体靶向的纳米药物、核酸适配体介导的免疫治疗等。
综上，本发明通过采用(Whole-Cell SELEX，WCS)技术，利用前期构建的阴性选择细胞系Vemintin-KO胃癌细胞系，经20-30轮循环，筛选出特异性高、结合紧密的Aptamer，可实现以细胞表面表达的Vimentin(波形蛋白)蛋白(CSV)为靶向蛋白，采用whole-cellSELEX技术筛选出相应的核酸适配体(CSV-Aptamer)，并将筛选出来的核酸适配体进行功能研究，开发出在早期诊断和治疗中的用途。前期利用crisp-9技术构建了Vimentin基因敲除的肿瘤细胞系，可以作为筛选核酸适配体过程中非常关键的阴性对照细胞系，通过筛选Vimentin阳性细胞和阴性细胞，双向筛选，达到快速筛选出目标分子的目的，具有高筛选效率和成功率。
随机DNA序列结果如下：
>random sequence 1 consisting of 150 bases.
ggtccattagcgctggatgcaaatgaaaatacgcttagggacgagtgtaatgtaggaagg
tgagatgtacgagtgatccttactctggggttatcgcactgtacagacgttctatggccc
ccactaaagatcagaacagatactttgtcc
>random sequence 2 consisting of 150 bases.
gtaagtcactggagctccttcgttgagcggagcttctttgctttgggcccaggaaatcca
aagcgtgtatcaatttggttctactcgaatatcgaatctgtcagatattaatatggattc
ggcttgttttaacagatggatgttattcac
>random sequence 3 consisting of 150 bases.
ttgaccctttgcagacttattaatcagtatctaaaagcgcgccggctggcttaatgcggc
acatggggggagttgaacagaatcgccaagtatcatcctgttctgtctatacccaaaggt
attacgttaggtatcaccgatcgacccgtg
>random sequence 4 consisting of 150 bases.
gttcgccgtagttatactatgacctcatatgttcacctccttcgccatgatgagttcctc
tccacttcctgttaactgccgccccagtactaagctagccctctaccaacgctctattaa
ttccatctaggcgtcataaacctacgctgt
>random sequence 5 consisting of 150 bases.
gcgaagacgccattctcacgcgtgcccggcaatctgggcggtggtagaaggccgtcgaaa
acggcagatctcgccctcgccgaattcacgattcgagggacctcctttaccaaatccgac
actactatttgcttctacggatacgactgg
>random sequence 6 consisting of 150 bases.
ttagacatgaagctactaatgagcctagccatagtatatcgttactatcgcagtttgatc
atggtagagccttccccctagcgaggtactgcagaaccccacggcccagaactacgacca
tgaaaagtcctcgtaaggtcatcgcggcac
>random sequence 7 consisting of 150 bases.
cacacaggggggaatctgggcaatgcgaaatttatggaaagagaaggacttgaacatgca
ttgacttggatcacccacaccctggctacagccaagcgtgatgcggggcggcctccagct
ttctgttgtctgatgacctaatccccgaaa
>random sequence 8 consisting of 150 bases.
ctaagtgcattcgtcatcctgcactgtccactataagatccgtcaagtttcacggaggca
ataaccgactgtcgaagattgtatactctacccatagcaacgatccactctctgcgatca
gcctattatcattagtgtaagccaaagtta
>random sequence 9 consisting of 150 bases.
actcactgtcccgccaagggtatcgttatctggagcaagccgaaatagtgacacgtcggt
cagggccttacttgtgcctctcgagaccttatattagtttgcccttagtagtgcccttgc
tgactaaatttatggcagccagatcattgg
>random sequence 10 consisting of 150 bases.
gcacaccacagacttcccaggctcataactaacggaccgcaattgtcctagcacggataa
ttaattcaatgagtgtgattcctgtttacgcaggcgcccgaacggtgcataagctcaacc
Gggacataacatttaaaggctgctgtaaaa.
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：包括以细胞表面表达的Vimentin蛋白为靶向蛋白CSV，采用whole-cellSELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV-Aptamer。
2.根据权利要求1所述的一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：采用所述whole-cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV-Aptamer的方法具体包括：
S1、设计并合成一个含1014-1015个随机序列的核酸库，每个随机序列由两端已知的引物区和中间随机区组成；
S2、将随机核酸库与目标生物靶点孵育，形成核酸适配体-靶点复合体；
S3、将与靶点结合的核酸适配体与其他核酸分子进行分离；
S4、将与靶点结合的核酸适配体通过PCR扩增，形成一个富集的次级核酸库，将其与靶点重新孵育，进行下一轮筛选；
S5、经过8-20轮筛选，当富集程度达到饱和后，对富集的核酸库进行测序分析，鉴定特异性核酸适配体序列；
S6、为消除非特异核酸分子与靶点的结合，在SELEX过程中引入2-5轮负向筛选，即采用前期构建的Vimentin-KO细胞系，将会显著提将筛选得到的PCR产物克隆到质粒中，采用随机挑选100个克隆一代测序和PCR产物直接高通量测序相结合，分析筛选得到的Aptamer序列，并纯化获得更多的Aptamer分子，再与野生型肿瘤细胞和基因敲除细胞系做亲和度和特异性检测，选取最优序列的Aptamer分子。
3.根据权利要求2所述的一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：所述步骤S1中中间随机区为30-50个碱基。
4.根据权利要求2所述的一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：所述步骤S6中将最优Aptamer进行荧光化学基团修饰，与各类肿瘤细胞系结合，通过流式细胞仪检测肿瘤细胞的检出率，再采用临床血液标本检测CTC，对照临床资料，分析CSV-Aptamer在临床中的检出率和恶性肿瘤的相关性。
5.根据权利要求2所述的一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：研究筛选出来的CSV-Aptamer在野生型肿瘤细胞系中的作用分析具体如下：将筛选出来的CSV-Aptamer加入培养的各种野生型肿瘤细胞系，观察其对肿瘤细胞的影响，分析其作为靶向治疗的潜力。
6.根据权利要求5所述的一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：将筛选出来的适配体CSV-Aptamer改造成携带各种药物靶向肿瘤细胞的治疗方法。
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| CN (1) | CN113564172A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109355294A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-02-19 | 温州医科大学附属第医院 | 特异性识别Vimentin的核酸适配体及其应用 |
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| US20070265185A1 (en) * | 2004-09-17 | 2007-11-15 | Genome Express Sa | Phosphorylated Vimentin Serving as a Marker of the Aggressiveness and/or Invasiveness of Tumors |
| WO2016018934A1 (en) * | 2014-07-29 | 2016-02-04 | Companion Dx Reference Lab, Llc (Texas) | Biomarkers and morphology based aptamer selection of same |
| CN109355294A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-02-19 | 温州医科大学附属第医院 | 特异性识别Vimentin的核酸适配体及其应用 |
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Patent Citations (3)
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| 李慧等: "以完整细胞为靶子的SELEX技术研究进展", 《生物技术通讯》 * |
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