CN109750038B - 一种长非编码rna及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长非编码RNA及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用。本发明属于基因工程领域，特别涉及Linc00284在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用；在子痫前期孕妇胎盘中Linc00284的上调与子痫前期发生发展有关，高表达水平的Linc00284与子痫前期发病机制有着密切的关系，通过改变Linc00284的表达对子痫前期孕妇的滋养细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等产生影响，敲低Linc00284表达能够促进滋养细胞侵袭和迁移能力。

Description

一种长非编码RNA及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中 的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及长非编码RNA-Linc00284在诊断及制备治疗子痫前期药物的应用。

背景技术

子痫前期(PE)是在多基因遗传背景和环境因素共同影响下产生的妊娠特有疾病,母胎界面免疫平衡和免疫耐受失调,导致胎盘滋养细胞浸润能力减退,进而胎盘着床过浅和胎盘供血供氧不足,造成局部氧化应激反应,产生大量毒性因子及炎性介质,使全身多脏器血管内皮损伤、血管痉挛,出现多系统受累的临床表现。目前仍然是导致孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一。现唯一的治愈途径是胎儿和胎盘从母体娩出。由于发病机制尚不明确，疾病发生的分子机制不明，临床预防治疗仍缺乏有力有效的措施。随着基因研究工程的深入，科学家对运用基因诊断和分子生物学在早期诊断子痫前期并靶向治疗方面进行了很多研究。

近年来，高通量测序的基因表达分析技术和生物信息学推动了大规模的人类基因组学的研究，进而发现的一类非蛋白编码的RNA。长链非编码RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平。大量的研究显示，异常lncRNAs表达与多样的人类疾病相关。在子痫前期中曾有研究发现lncRNAHOTAIR、MEG3、SPRY4-IT1等的异常表达在该疾病的发生发展过程中起了重要的作用。因此，发现更多与子痫前期相关的lncRNAs，并对他们在疾病中所起的生物学功能进行研究，并深入探索其分子机制，对将来早期诊断及治疗该疾病提供坚实的理论基础。Linc00284是一条长非编码RNA，其位于人类染色体13q14.11。我们发现，相对于正常孕妇胎盘组织，子痫前期胎盘组织中的linc00284表达量显著上调。在敲低Linc00284后，研究了Linc00284在子痫前期发生和发展中的作用并研究了Linc00284在滋养细胞中的相关靶基因的功能。

发明内容

技术目的

本发明的目的是提供Linc00284在诊断子痫前期及在制备治疗子痫前期药物中的应用。

技术方案

通过qPCR筛查临床组织中Linc00284的差异表达，发现在子痫前期孕妇胎盘组织中Linc00284的表达量较正常孕妇胎盘中表达量高。猜想：Linc00284是否参与了子痫前期疾病的发病过程。

选用国际认可的正常滋养细胞(即HTR-8/SVneo细胞株)作为实验研究对象，设计Linc00284的干扰序列，以lip2000为转染载体将干扰序列转入细胞后抑制子痫前期疾病疾病的发生，发展和预后过程。通过检测在干扰序列转入细胞后细胞的表型功能如增殖，凋亡,迁移和侵袭能力等。从而证明在正常的滋养细胞HTR-8/SVneo中敲低Linc00284的表达，影响了细胞的功能,抑制子痫前期疾病的发病进程。

通过基因转录组测序，检测Linc00284的可能参与细胞功能(如增殖，凋亡或迁移)的相关下游靶基因，随后对Linc00284调控机制的初步探讨，通过核质分离实验检测Linc00284更多的存在于滋养细胞的细胞核中，考虑Linc00284可能在转录水平调控相应的靶基因。

转染过程所需的各种试剂。

(1)lip2000,一种多用途的脂质体转染试剂,适用于DNA、RNA和寡核苷酸的转染,对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，进而将PVT1干扰序列转进到细胞内。

(2)Opti-mem培养液，含HEPES，2400mg/l碳酸氢钠，次黄嘌呤，胸腺嘧啶，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，微量元素，生长因子，以及减量至1.1mg/l的酚红，作为转染试剂的辅料，其本身对细胞无任何害处，而更好更有效的转进细胞中，以获得预期目的。

(3)PBS磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。排除其本身对实验对象的影响。

组织收集

我们收集了50对2014年至2015年在江苏省人民医院,江苏省妇幼保健院接受剖宫产手术，诊断患有子痫前期的孕妇胎盘组织和不含有任何基础疾病的正常孕妇胎盘组织。并记录临床的特点：包括孕妇年龄,有无吸烟史，孕周数，收缩压，舒张压以，蛋白尿以及胎儿体重。组织样本收集的均为第一时间液氮或储存在-80℃,直至RNA提取。该研究经过南京医科大学伦理委员会批准。获得所有病人的书面知情同意。

细胞系

选取滋养细胞(HTR-8/SVneo)由来自加拿大女皇大学提供。HTR-8/SVneo细胞用RPMI 1640培养基培养；培养基中均含有5％的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素。5％CO2的37℃恒温培养箱中常规培养。每2-3天更换新鲜培养基，当细胞融合度达到80％-90％时传代。所有细胞系被短串联重复序列的DNA分析验证。

RNA提取和定量PCR分析

根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(TaKaRa,大连,中国)。逆转录试剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

细胞转染

Linc00284的干扰序列及乱序对照(si-NC)均购自Invitrogen公司(Invitrogen公司，CA，USA)。将细胞HTR-8/SVneo按每孔2×105个细胞种于6孔培养板，待细胞贴壁后，于转染前6h吸弃原有培养基，换成无双抗培养基；取10μL脂质体(即lip2000)稀释于240μL的OPTI-MEM中，温和吹打混匀室温下孵育5min；取100pmol siRNA和si-NC分别稀释于240μLOPTI-MEM中，吹打混匀室温下孵育5min；将孵育好的脂质体与siRNA或质粒稀释液混合，温和吹打混匀。于室温下继续孵育20min；将上述混合物均匀滴入事先加好1.5mL OPTI-MEM的6孔培养板中，轻轻混匀。37℃,5％CO2培养箱中继续培养4-6h后，换完全培养基。转染后48h，收集细胞提取RNA或蛋白进行实时定量RT-PCR或蛋白免疫印迹分析。

细胞增殖活性检测

MTT实验，将处理后的细胞按每孔3000-5000个细胞接种于96孔培养板。待细胞80％贴壁后，细胞同步化6h，弃去原有培养基。每个样本设置5个复孔，每孔总反应体积为200μl。每孔加入20μl的MTT反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h。弃去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，震荡10min，酶标仪测定490nm波长处的吸光度。

流式细胞术

凋亡检测，用胰酶消化收集转染48小时后的HTR-8/SVneo细胞，随后根据FITCAnnexin V凋亡检测试剂盒(BD)及其使用说明予以Annexin V-FITC荧光探针和碘化丙锭(PI)染色。流式细胞仪检测和分析。

细胞周期检测，根据说明书使用Cycle TESTTM PLUS DNA试剂盒(BD)予以PI染色，随后用FACScan分析。

细胞迁移和侵袭实验

24孔板中放置8μm孔径大小的Transwell小室。细胞侵袭实验，用50mg/l BDMatrigel 1:6稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，包被好的小室放入24孔板中，孵箱中孵育2h。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至3x105。取细胞悬液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入700μl含10％FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。细胞迁移实验，调整细胞密度至1-10x104。取细胞悬液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入700μl含10％FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。取小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用0.1％结晶紫将小室外底面的细胞染色利用倒置显微镜对Transwell小室底膜上下室侧附着的染色的细胞拍照计数。

RNA测序

将细胞种植于六孔板中，待细胞长至80％左右后给于10ul的lip2000si-linc00284和si-NC处理，48h后用Trizol处理收集细胞，送样，由华大基因检测机构实施，选用Illumina机器进行随后的实验，得到数据并做相应的处理。

数据处理

实验数据皆用SPSS17.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾Student’s T检验、秩和检验和卡方检验。单因素分析中p<0.05的随后再使用多因素分析。

附图说明

图1 Linc00284在子痫前期孕妇胎盘组织(N＝60)中表达上调。

1A Linc00284在子痫前期孕妇胎盘组织(N＝60)表达较正常组织上调。

图2 Linc00284对HTR-8/SVneo细胞增殖能力的影响。

2A MTT实验检测在敲低Linc00284后能够促进HTR-8/SVneo细胞的增殖能力。

2B MTT实验检测在过表达Linc00284后能够抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖能力。

图3 Linc00284对HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响。

3A流式细胞术检测在过表达Linc00284后较正常组能够促进细胞凋亡。

图4 Linc00284对HTR-8/SVneo细胞迁移的影响。

4A划痕实验检测在敲低Linc00284能够促进HTR-8/SVneo细胞的迁移能力。

4B划痕实验检测在过表达Linc00284能够抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移能力。

4C Transwell实验检测在敲低Linc00284能够促进HTR-8/SVneo细胞的迁移能力。

4D Transwell实验检测在过表达Linc00284能够抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移能力。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。

一般性说明：

实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

本发明的材料：本申请中提及的细胞株以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

实施例1

检测Linc00284在胎盘组织中的表达情况

取0.1g组织，液氮研磨充分(成粉末状)或1-5×107细胞弃培养基，预冷的PBS润洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以无酶枪头吹打混匀，静置5min，将裂解液移入预先标记好的无酶1.5ml的离心管中。4℃7500g离心5分钟，取上清加入1/5体积的氯仿，颠倒混匀30s，静置2min。4℃，12000g离心，15min。转移水相层至新的1.5ml离心管中。加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置5-10min。4℃，12000g离心，10min。吸弃上清，加入1ml 75％的乙醇(现配)，洗涤RNA沉淀。4℃，7500g离心，5min，弃上清。尽量去除75％的酒精，于室温中晾干，约15min。用无RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。

实时定量PCR

子痫前期孕妇胎盘组织及正常孕妇胎盘组织标本，HTR-8/SVneo细胞的总RNA，

反转录反应条件如下：37℃ 15min(反转录反应)；85℃ 5sec(反转录酶的失活反应)。根据Genebank提供的基因序列，设计引物序列，

QPCR应用7300PCR系统(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA样品采用三部法PCR扩增标准程序。反应体系：

反应条件：

结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

lincRNA 00284的引物如下：Primer F 5’-TCCTGTTCCCTGGAGGCATA-3’，见SEQNO：3，Primer R 5’-TGTGGTGAGGTGGTTTGCTT-3’，见SEQNO：4。

我们利用实时定量PCR检测了50对子痫前期孕妇胎盘组织表达较正常组织中Linc00284的表达水平，其中选用的Linc00284的引物如下：Primer F 5’-TCCTGTTCCCTGGAGGCATA-3’，见SEQNO：3，Primer R5’-TGTGGTGAGGTGGTTTGCTT-3’，见SEQNO：4

结果表明,与正常孕妇胎盘组织相比，Linc00284在子痫前期孕妇胎盘组织表达上调(图1，P<0.05)。提示Linc00284可能在子痫前期疾病的诊断，发生发展及治疗中扮演着重要的作用。

Table 1子痫前期孕妇和正常妊娠孕妇的临床数据

实施例2

为了研究Linc00284对HTR-8/SVneo细胞功能的影响。

首先，选取正常滋养细胞HTR-8/SVneo细胞系作为本实验的研究对象，利用lip2000作为转染试剂载体，转染Linc00284干扰序列si-Linc00284 1#GAGAAAUAGUCUGUGUUGCCCUGA以有效的敲低Linc00284的表达，MTT检测发现,在HTR-8/SVneo细胞中敲低Linc00284表达后促进细胞生长。(图2A)。此外,过表达Linc00284后抑制HTR-8/SVneo细胞生长(图2B)。由此可知，这些数据表明,Linc00284可抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖能力。

实施例3

Linc00284对滋养细胞凋亡的影响

流式细胞术Annexin V/PI双染色法测细胞凋亡：为了研究是否Linc00284对HTR-8/SVneo细胞的增殖影响了细胞周期转换,以正常滋养细胞HTR-8/SVneo细胞系作为研究对象，利用Furgern作为载体，转染Linc00284质粒以过表达Linc00284的表达。

1)细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，而贴壁细胞先用滴管轻轻吹打，凋亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02％的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为(1～5)×10⁶，500～1000r/min离心5min弃去培养液。

2)用孵育缓冲液洗1次，500～1000r/min离心5min。

3)用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。

4)500～1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。

5)加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

6)流式细胞仪测定细胞凋亡。

如上述方法，将HTR-8/SVneo/pcDNA-Linc00284(对照为HTR-8/SVneo/pcDNA)细胞种在6孔板上，3×105个细胞/孔。转染48h后流式细胞术测细胞凋亡水平。

结果测定：如图3A所示。

结果分析：与对照组HTR-8/SVneo/pcDNA相比，HTR-8/SVneo/pcDNA-Linc00284给予处理均出现细胞凋亡增多，提示过表达Linc00284表达可促进滋养细胞的凋亡。这些数据表明,Linc00284可抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖能力。

实施例4

Linc00284参与HTR-8/SVneo细胞迁移。

滋养细胞浸润和转移子痫前期发病机制中的一个重要方面。我们用划痕实验和transwells研究了Linc00284对HTR-8/SVneo细胞迁移能力影响。结果表明,转染Linc00284干扰序列以敲低Linc00284后与对照组细胞相比，促进了滋养细胞HTR-8/SVneo迁移能力(图4A和4C)。过表达Linc00284后与对照组细胞相比，抑制了滋养细胞HTR-8/SVneo迁移能力(图4B和4D)。这些结果表明,敲低Linc00284表达后促进滋养细胞的表型,促进了滋养细胞HTR-8/SVneo的迁移，过表达Linc00284后抑制滋养细胞HTR-8/SVneo的迁移。

近年来，LncRNAs作为热点，受到广泛的关注与研究，极大推动了该领域的飞速发展。目前，lncRNA研究已显示出它在人类多种疾病发病中的重要作用，面对如此庞大的lncRNAs家族，人们的认识是有限的，已鉴定出其功能的lncRNA并不多。关于lncRNA与子痫前期相关联的证据并不多，要想使其成为子痫前期的诊断标志物，需要进一步确定lncRNA在人群中的表达水平，以及具有临床诊断意义的变化程度。在这里，我们首次证实了Linc00284在子痫前期患者中行使的功能。在滋养细胞中敲低Linc00284的表达，表现出滋养细胞增殖增加，细胞凋亡减少，血管形成能力增加。随着生命科学的发展，我们可以利用分子生物学、细胞生物学及动物整体等实验进一步来研究子痫前期发生发展过程中lncRNA的表达变化及其作用机制，为子痫前期早诊早治提供新的靶向分子。

Sequence listing

序列2 si-Linc00284 1#CCUAAUGUAGAGCAUCUUUTT

序列3 Linc00284引物F TCCTGTTCCCTGGAGGCATA

序列4 Linc00284引物R TGTGGTGAGGTGGTTTGCTT

SEQUENCE LISTING

<110> 烟台毓璜顶医院

<120> 一种长非编码RNA及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用

<130> CP11804625C

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2562

<212> DNA

<213> Linc00284

<400> 1

attcttcaaa agtttcactg acatgaacct cacttgtggg tgccaggtta tgaccacatg 60

catagtttca tcttcatctt atgcaacatt tggggtaaaa ggaaggttat gtggtaacca 120

gtttatgact tgaactatag gcaaagattg accagaccaa gccctgagac acagtgttga 180

gagccaagac ataaagttgt gaagattcag acccagagcc cagcagggca caggctggag 240

gggtgatgtg agtgatcagt aacaccatga agactctgct cctgggtcag gaatgctttt 300

ttgtccctgt ttttggattt tccaccatga tcagccaatg cagaaagaaa tctaaaggtg 360

aaggaaaggc agcgttcagc actgagcaag tccatgttgg agaaagttca cagggaattg 420

gaaatccttg tcttcgtggt tcctggctca gcaggacccc tgtggggcct ctccctctct 480

tgggaaagag attgctctag aaggtttact acaccagtga ggagaagatg agcgcaaggg 540

ggattggccg gctgagggcg aaatcaagac tggagccaag tgcgctgagc tctcacatga 600

ggtcctttgc tcctgttccc tggaggcata agtggctggg gtagagagaa gcaggggtat 660

ttcttctgtc ctttcttgct tagggattgg gggtggaaat ctccccgcat ctaaggaaat 720

ttgaaaagac aaactatggc tgcttcttca agcaaacacc tcaccacact atccagggga 780

taaaacccgc ttgctgctgc taaattatgc caagagagaa cattctgata tttctcctca 840

attctaggca tgacagcgtg acttggtgct taaaggcatg gagttttgag ttgcagacct 900

aggtttgagt gctgaatcta ctagcttcag ggtgttaaaa aagtttctta atctctctaa 960

accttatttt tctcaaagat aaaaaactgg gtgtagttgt gagtatagtg aatgcacata 1020

gtatgtgcct ttggcatgtt aattcactat tattctggac ataatttctc ctaagaaaaa 1080

ggatgaacta attgcagggc ctagcctaag ctctgagaag tcattcgtta tagcatttca 1140

gtccatagta aacaagaaga aatgaggtaa agagtttaaa ccagggaagg catagctgtg 1200

gtcaccaaac aacctgttaa aggcgagctg taggcaccaa aaaacctatt atggactgaa 1260

ttgtgttcct caaattcata tgttgaagtg ctaaccccaa gtaccaaatg tgactgtatt 1320

tggggatagg gtccctgaag aagtcactca gctggaagga gtcatattgg attaggtgtt 1380

gggaattggc tggccaaggg agaaatcaag gctggaacca agtgctgaac tctcacatca 1440

ggtcctttgc tcctgttccc tggaccctaa tccaatatga ctggcatctt tatatgaaga 1500

ggaagaggca ccagagggta cacacgcaga gaaaaggcca tgtgtggaca cagtaagatg 1560

acggacatct gtaagccaag gagggaaacc tcagaagaaa ccagccttgc ctgcaccttg 1620

atcttggagg tccagtctcc agaactgtga aaaaaatgaa ctggtgttgt ttaaatcccc 1680

cagtcgtggt attttgtcat ggtggcccta gaagacaata tacaacccaa aggaatattc 1740

tttccacttt ctccctcttc cactttatag ttttttctcc ttcgtttctt tctttttctc 1800

ttttactttc cttttcttct cttctctttc ctctggtttt taattttaat tttaattttt 1860

ggccttccta tacctccatt tgcctctcca ggaagctgaa ttccagacaa ttaatcattc 1920

atctcatcag ttcagcaaag caaatgccct caatggtttc ttttgtgatt cgattattat 1980

gggatcagaa tgtatcttat tcctctggga aaaatgaaac ataaaaattt cagaaataag 2040

gttttgggcc agcttcattg gttttaagag aaggaaggga ggagactcat gcaggtttga 2100

cgctgagcag caccatgtgg ttgggcctgg caggcactcg aggctttagg tcttgtttga 2160

atccagacta gaaaatcatt acttattaaa agccttgagg atatgggtct aggaaagtct 2220

atgtgaagag ataatagttt ggaaaaagtt ttgcagaact aaagaaaagt ttccacagtt 2280

accttttctg tcctaatgta gagcatcttt gttaactagg tcttggatca atccaagctg 2340

tgtctgagaa taaccattta taatttctca ctggccagca ctaacaccct ttagaaaagg 2400

aactcaaagc agccctagca gccagagtca tgcgatcatg gtgggagtac agctcctcac 2460

caaggtcagc tcctcagtga aatccatgcc ttctggagga ctgcttgtaa ataaatatta 2520

agcacaacca ttaaaaaata atttggctgt gaccatcaaa ta 2562

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> si- Linc00284 1#

<400> 2

ccuaauguag agcaucuuut t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Linc00284 引物 F

<400> 3

tcctgttccc tggaggcata 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Linc00284 引物 R

<400> 4

tgtggtgagg tggtttgctt 20

Claims (2)

1.一种检测Linc00284的引物在制备诊断子痫前期试剂盒中的应用，其技术特征为：序列如序列3、4所示。

2.一种干扰Linc00284的siRNA在制备治疗子痫前期药物中的应用，其技术特征为，其序列如序列2所示。

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