CN106520771A - 一种长非编码rna及其在诊断/治疗子痫前期中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，特别涉及TUG1在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用；在重度子痫前期孕妇胎盘组织中TUG1表达的下调与子痫前期的发生发展有关，低表达水平的TUG1与子痫前期发病机制有着密切的联系，通过体外试验中下调TUG1基因的表达对子痫前期孕妇滋养细胞HTR‑8/SVneo的增殖、凋亡、侵袭、迁移等表观现象产生影响。

Description

一种长非编码RNA及其在诊断/治疗子痫前期中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及长非编码RNA--TUG1在诊断及制备治疗子痫前期药物的应用。

背景技术

子痫前期是全球最常见妊娠期合并症之一，也是妊娠期并发症相关死亡的主要原因之一,世界卫生组织统计报道，子痫前期或者子痫直接导致全球每年约14％(约8500)的孕产妇死亡，同时是胎儿早产和胎儿生长受限以及孕产妇死亡最常见的原因之一。虽然目前内科治疗得到了很大的进步,但病人总体发生率依然相对较高。随着基因转录组测序技术和分子生物学的快速发展，基因诊断和分子靶向治疗成为子痫前期治疗中一个热点话题。其中长非编码的异常表达对疾病(例如子痫前期)的发生发展有一定的联系。因此,研究长非编码RNA异常表达参与子痫前期的发生发展和转移的的分子机制，对制定特定的诊断方法和个性化的治疗策略至关重要。

在过去的十年里,基于快速出现的高通量测序的基因表达分析技术和生物信息学推动了大规模的人类基因组学的研究,进而发现了非编码RNAs。人类基因组中只有2％的编码转录成蛋白,而绝大多数转录成非编码RNAs，包括小分子核糖核酸、长非编码rna(lncRNAs)和假基因。最近,miRNA在细胞进程的各个方面的作用已经得到证实，然而,lncRNAs的功能研究不是很透彻。ENCODE计划中GENECODE研究组新数据显示有成千上万的lncRNAs,但只有其中的一些有生物学功能。有趣的是,这些lncRNAs通过染色质重塑参与调控多种细胞进程,包括重组干细胞多能性,父母的印记和肿瘤细胞的扩散和转移以及表观遗传修饰和吸附miRNAs。

最近,大量的研究显示，异常lncRNAs表达与多样的人类疾病相关。例如,lncRNAROR可通过抑制甲基转移酶G9A,促进TESC的启动子区H3K9去甲基化参与肿瘤发生。同时,AOC4P通过与波形蛋白绑定和促进其降解，抑制上皮间质转化(EMT)从而抑制肝细胞癌转移。此外,上调的SPRY4-IT1通过与HUR绑定，抑制子痫前期滋养细胞增殖，迁移和血管形成能力。这些发现表明lncRNAs在人类疾病尤其是子痫前期的发生发展过程中扮演至关重要的角色。因此,发现更多的子痫前期相关的lncRNAs并研究他们的生物功能和机制，对更好地理解子痫前期发生发展的的分子生物学有重要的意义。

TUG1是一条长度为7598bp的lncRNA,其序列如SEQ ID NO：1所示，即

其位于人类染色体22q12.2。我们发现TUG1在子痫前期孕妇胎盘组织中较正常孕妇胎盘中表达量下调。在敲除TUG1后，研究了TUG1在子痫前期发生和发展的作用并研究了TUG1在子痫前期孕妇滋养细胞中的相关靶基因的功能。

发明内容

技术目的

本发明的目的是提供TUG1在诊断子痫前期及在制备治疗子痫前期药物中的应用。

本发明涉及一种长链非编码RNA，其核苷酸序列为SeqNO:1；

一种长链非编码RNA在制备治疗子痫前期药物中的应用；

一种长非编码RNA在制备诊断子痫前期试剂中的应用；

一种检测TUG1的引物，如SEQ ID NO：4、5所示，即：SEQ ID NO：4 TUG1 FTAGCAGTTCCCCAATCCTTG，SEQ I D NO：5TUG1R CACAAATTCCCATCATTCCC；。

两种干扰TUG1的siRNA,如序列2、3所示，即：SEQ ID NO：2 si-TUG1-1#(sense 5-GGGAUAUAGCCAGAGAACAAUUCUA-3)；SEQ ID NO：3(sense 5-GCUUGGCUUCUAUUCUGAAUCCUUU-3)

一种试剂盒，包括所述引物；

一种包括所述长链非编码RNA的药物组合物；

所述引物在制备诊断子痫前期试剂中的应用；

所述药物组合物在制备治疗子痫前期药物中的应用。

所述药物组合物，其中还包括辅料。辅料包括：(lip2000,Opti-mem培养液,PBS磷酸缓冲盐溶液，0.9％Nacl)。

所述试剂盒，所述引物中的浓度分别为10mol/L。

技术方案

通过qPCR筛查临床组织中TUG1的差异表达，发现在子痫前期孕妇胎盘组织中TUG1的表达量较正常孕妇胎盘中表达量低。固而猜想：TUG1是否参与了子痫前期疾病的发病过程。

随后选用国际认可的正常滋养细胞(即HTR-8/SVneo细胞株)作为实验研究对象，设计TUG1的干扰序列，以lip2000为转染载体将已设计有效的干扰序列转入细胞后通过敲低滋养细胞中TUG1的表达来模拟子痫前期疾病疾病的发生，发展及预后等过程。通过相关实验检测在干扰序列转入细胞后细胞的功能表型如增殖，凋亡，迁移和侵袭能力等。从而证明在正常的滋养细胞HTR-8/SVneo中敲低TUG1的表达，影响了滋养细胞的功能，诱导或加速子痫前期疾病的发病进程。

通过基因转录组测序，检测TUG1的可能参与细胞功能(如增殖，凋亡或迁移)的相关下游靶基因，随后对TUG1调控机制作初步探讨，通过核质分离实验以及FISH手段发现TUG1更多的存在于滋养细胞的细胞核中，考虑到TUG1可能在转录水平调控相应的靶基因，通过RIP和CHIP实验检测TUG1通过绑定EZH2蛋白抑制下游靶基因KLF2和RND3的表达。

转染过程所需的各种试剂，

(1)lip2000，一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，进而将PVT1干扰序列转进到细胞内。

(2)Opti-mem培养液，含HEPES，2400mg/l碳酸氢钠，次黄嘌呤，胸腺嘧啶，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，微量元素，生长因子，以及减量至1.1mg/l的酚红，作为转染试剂的辅料，其本身对细胞无任何害处，而更好更有效的转进细胞中，以获得预期目的。

(3)PBS磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。排除其本身对实验对象的影响。

(4)0.9％Nacl，生理盐水(医用)：一般作为溶剂。在转染干扰序列之前用0.9％Nacl给预处理的细胞洗清，将死亡的细胞去掉，并增加转染的效果。排除其本身对实验对象的影响。

组织收集

我们收集了52对2015年至2016年在江苏省人民医院，江苏省妇幼保健院接受剖宫产手术，诊断患有子痫前期的孕妇胎盘组织和不含有任何基础疾病的正常孕妇胎盘组织。并记录临床的特点：包括孕妇年龄，有无吸烟史，孕周数，收缩压，舒张压以，蛋白尿以及胎儿体重。组织样本收集的均为第一时间液氮或储存在-80℃,直至RNA提取。该研究经过南京医科大学伦理委员会批准。获得所有病人的书面知情同意。

细胞系

选取滋养细胞(HTR-8/SVneo)来自加拿大女皇大学提供。HTR-8/SVneo细胞用RPMI1640培养基培养；培养基中均含有5％的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素。5％CO2的37℃恒温培养箱中常规培养。每2-3天更换新鲜培养基，当细胞融合度达到80％-90％时传代。所有细胞系被短串联重复序列的DNA分析验证。

RNA提取和定量PCR分析

根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(TaKaRa,大连,中国)。逆转录试剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

细胞转染

选用于转染的载体(即lip2000)。TUG1的干扰序列即：SEQ ID NO：2si-TUG1-1#(sense 5-GGGAUAUAGCCAGAGAACAAUUCUA-3)；SEQ ID NO：3(sense 5-GCUUGGCUUCUAUUCUGAAUCCUUU-3)及乱序对照(si-NC)均购自Invitrogen公司(Invitrogen公司，CA，USA)。将细胞HTR-8/SVneo按每孔2×105个细胞种于6孔培养板，待细胞贴壁后，于转染前6h吸弃原有培养基，换成无双抗培养基；取10μL脂质体稀释于240μL的OPTI-MEM中，温和吹打混匀室温下孵育5min；取100pmol siRNA,si-NC分别稀释于250μL OPTI-MEM中，吹打混匀室温下孵育5min；将孵育好的脂质体与siRNA或质粒稀释液混合，温和吹打混匀。于室温下继续孵育20min；将上述混合物均匀滴入事先加好1.5mL OPTI-MEM的6孔培养板中，轻轻混匀。37℃,5％CO2培养箱中继续培养6h后，换完全培养基。转染48h后，收集细胞提取RNA或蛋白进行实时定量RT-PCR或蛋白免疫印迹分析(western blotting)。

细胞增殖活性检测

MTT实验，将处理后的细胞按每孔2000-3000个细胞接种于96孔培养板。待细胞80％贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个复孔，每孔总反应体积为200μl。每孔加入20μl的MTT反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h。弃去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，震荡10min，酶标仪测定490nm波长处的吸光度。

EdU实验，将2.5ul的干扰序列处理24孔板中细胞，36h后在每孔中加入10μM EdU试剂。2h后，用4％多聚甲醛固定30分钟。清洗，使用Click-iTR Edu试剂盒染色30分钟，随后用DAPI染色15分钟，随后使用倒置荧光显微镜拍摄(奥林巴斯，日本)。最后，使用Image-ProPlus软件分析。

流式细胞术

凋亡检测，用胰酶消化收集转染48小时后的HTR-8/SVneo细胞，随后根据FITCAnnexin V凋亡检测试剂盒(BD)及其使用说明予以Annexin V-FITC荧光探针和碘化丙锭(PI)染色。流式细胞仪检测和分析。

细胞周期检测，根据说明书使用CycleTESTTM PLUS DNA试剂盒(BD)予以PI染色，随后用FACScan分析。

细胞迁移和侵袭实验

24孔板中放置8μm孔径大小的Transwell小室。细胞侵袭实验，用50mg/l BDMatrigel 1:6稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，包被好的小室放入24孔板中，孵箱中孵育6h。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS或者0.9％生理盐水清洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至3x105。取细胞悬液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入700μl含10％FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。细胞迁移实验，调整细胞密度至3x104。取细胞悬液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入700μl含10％FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。取小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用0.1％结晶紫将小室外底面的细胞染色利用倒置显微镜对Transwell小室底膜上下室侧附着的染色的细胞拍照计数。

亚细胞结构定位

根据使用说明书使用PARIS试剂盒(Life Technologies，USA)分离HTR-8/SVneo细胞的细胞核和细胞质。使用qPCR方法检测PVT1、GAPDH和U1在细胞质和细胞核中的分布。GAPDH为细胞质参照，U1为细胞核参照。以总RNA百分比呈现PVT1、GAPDH和U1在细胞质和细胞核中的表达情况。

原位杂交技术(FISH)

根据PVT1基因转录本的特点，设计相对应的探针(由上海博谷生物科技公司合成)，将HTR-8/SVneo细胞种植于含有15mm爬片6孔板里，待细胞至80％左右时，弃培养基用PBS清洗两遍后，加2ml的甲醇固定30min后送样，由上海博谷生物科技公司进行接下来的处理，选用倒置银光显微镜拍照，定性检测PVT1在细胞中的亚定位，进一步验证核质分离实验结果。

RNA测序

将细胞种植于六孔板中，待细胞长至80％左右后给于10ul的lip2000si-PVT1和si-NC处理，48h后用Trizol处理收集细胞，送样，由北京基因检测机构实施，选用Illumina进行随后的实验，得到并处理相应的数据。RNA免疫印迹(RIP)

裂解HTR-8/SVneo细胞供内源性PRC2复合物免疫印迹实验使用。将细胞上清与包被分别识别EZH2、SNRNP70和对照IgG的蛋白A/G琼脂糖磁珠在4℃孵育6个小时。随后，清洗磁珠，用0.1％SDS/0.5mg/ml蛋白酶K在55℃孵育30分钟以去除蛋白。提取RNA供qPCR分析。

染色质免疫共沉淀(CHIP)

使用4％多聚甲醛固HTR-8/SVneo细胞，孵育10分钟以产生DNA-蛋白交联。超声裂解细胞以产生200-300bp的染色体碎片，随后用EZH2和H3K27me3特异性抗体和对照IgG抗体孵育沉淀。恢复染色质DNA，随后使用qPCR检测分析。蛋白质免疫印迹(Westblotting)

将变性好的细胞蛋白裂解产物加入至预先制好的10％变性聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)的加样孔中，分离样本中蛋白。随后转至NC膜，并以特异性抗体孵育。最后用ECL发光液压片曝光。GAPDH抗体为对照，TP53INP1抗体购自CST公司，ANGPTL4抗体购自Proteintech公司。

数据处理

实验数据皆用SPSS17.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾Student’sT检验、秩和检验和卡方检验。单因素分析中p<0.05的随后再使用多因素分析。

附图说明

图1、TUG1在子痫前期孕妇胎盘组织中表达下调

1a TUG1在子痫前期孕妇胎盘组织(n＝52)表达较正常组织下调

1b TUG1在子痫前期孕妇胎盘组织(n＝52)表达较正常组织下调

图2、TUG1对滋养细胞HTR-8/SVneo细胞增殖能力的影响

2a在HTR-8/SVneo细胞中敲低TUG1的表达

2b敲低TUG1表达抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖能力

2c敲低TUG1能够使HTR-8/SVneo细胞克隆形成能力减弱

2d敲低TUG1能够减弱HTR-8/SVneo细胞的增殖能力

图3 TUG1对HTR-8/SVneo细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响

3a敲低TUG1能够促进滋养细胞HTR-8/SVneo凋亡

3b敲低TUG1诱导细胞周期阻滞在G0/G1期

3c敲低TUG1能够抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移能力

3e敲低TUG1能够抑制HTR-8/SVneo细胞的侵袭能力

图4通过测序检测参与TUG1介导滋养细胞生长的潜在下游靶基因

4a-c细胞测序的相关性分析以及GO分析

4d-e敲低TUG1验证KLF2和RND3是其潜在的靶基因

图5 TUG1通过结合EZH2蛋白,抑制KLF2和RND3启动子区域转录

5a-b TUG1定位于细胞核

5c RIP实验验证TUG1与EZH2结合

5d-f蛋白免疫印记实验(CHIP)，验证得到TUG1通过与EZH2蛋白的绑定抑制KLF2和RND3的表达

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。

实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

本发明的材料：本申请中提及的细胞株以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

实施例1

检测TUG1在组织和细胞中的表达情况

取0.1g组织，液氮研磨充分(成粉末状)或1-5×107细胞弃培养基，预冷的PBS润洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以无酶枪头吹打混匀，静置5min，将裂解液移入预先标记好的无酶1.5ml的离心管中。4℃7500g离心5分钟，取上清加入1/5体积的氯仿，颠倒混匀30s，静置2min。4℃，12000g离心，15min。溶液分三层(水相-白色沉淀-红色有机物)，转移水相层至新的1.5ml离心管中，尽量不要吸到白色沉淀。加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置5-10min。4℃，12000g离心，10min。吸弃上清，加入1ml 75％的乙醇(现配)，洗涤RNA沉淀。4℃，7500g离心，5min，弃上清。尽量去除75％的酒精，于室温中晾干，约15min。用无RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

紫外吸收测定法测定RNA的浓度。使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。在260nm处读值1为表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA纯度的检测，比值范围在1.8到2.1表明符合要求。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。配制1％的琼脂糖胶。加热溶解琼脂糖，冷却，加入1μl溴化乙锭(EB,10mg/ml)。摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×TAE缓冲液中平衡10min，待用。点样。按1:4(v/v)将5×核酸电泳上样缓冲液与样本混合，准确将各样本含有1μg的RNA加入凝胶孔中。80V恒压电泳50min。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。

Tris-乙酸(TAE)缓冲液配方(1L)50×：

实时定量PCR

子痫前期孕妇胎盘组织及正常孕妇胎盘组织标本，HTR-8/SVneo细胞的总RNA，逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。逆转录反应体系如下：

反转录反应条件如下：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)。根据Genebank提供的基因序列，设计引物序列，

QPCR应用7300PCR系统(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA样品采用三部法PCR扩增标准程序。反应体系：

反应条件：

结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

TUG1的引物如下：

Primer F 5’-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3’，见SEQ ID NO：4，

Primer R 5’-CACAAATTCCCATCATTCCC-3’，见SEQ ID NO：5。

结果表明,lncRNA TUG1在子痫前期孕妇胎盘组织表达较正常组织下调(图1A)。我们利用实时定量PCR检测了52对子痫前期孕妇胎盘组织表达较正常组织中TUG1的表达水平。结果显示与正常孕妇胎盘组织相比，TUG1的表达在67.31％(35/52)的子痫前期孕妇胎盘组织中较正常组织表达降低(图1B)。提示TUG1可能在子痫前期疾病的诊断，发生发展及治疗中扮演着重要的作用。

Table 1子痫前期孕妇和正常妊娠孕妇的临床数据

实施例2。

为了研究TUG1对正常滋养细胞HTR-8/SVneo细胞表型的影响。

首先，选取正常滋养细胞HTR-8/SVneo细胞系作为本实验的研究对象，利用lip2000作为载体，转染TUG1干扰序列以敲低TUG1的表达模拟子痫前期的发病过程，MTT增殖实验检测发现,在HTR-8/SVneo细胞中转染TUG1的干扰序列，敲低TUG1表达后抑制细胞生长。(图2B)。此外,克隆形成试验结果表明,下调TUG1后HTR-8/SVneo细胞克隆形成能力减弱(图2C)。此外,EDU染色证明,敲低TUG1后减少HTR-8/SVneo细胞的增殖,而过表达TUG1后HTR-8/SVneo细胞增殖增强(图2D)。由此可知，这些数据表明,TUG1敲低后抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖能力。

实施例3

TUG1对胎盘滋养细胞HTR-8/SVneo周期和凋亡的影响

为了研究是否TUG1对HTR-8/SVneo细胞的增殖影响了细胞周期转换,以正常滋养细胞HTR-8/SVneo细胞系作为研究对象，利用lip2000作为载体，转染TUG1干扰序列以敲低TUG1的表达模拟子痫前期的发病过程。利用流式细胞术分析细胞周期。结果表明,HTR-8/SVneo细胞转染TUG1干扰序列后，发现敲低TUG1的表达后细胞周期阻滞在G1/G0期(图3B)。此外,我们进行了流式细胞仪分析细胞凋亡是否参与了TUG1敲低后诱导的细胞生长受抑。如图3A所示,早期凋亡(UR)和晚期凋亡率(LR)在TUG1敲低的HTR-8/SVneo细胞中高于对照组细胞。TUG1影响了滋养细胞的周期和凋亡。

实施例4

TUG1参与HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭

滋养细胞浸润和转移子痫前期发病机制中的一个重要方面。HTR-8/SVneo细胞系作为研究对象，利用lip2000作为载体，转染TUG1干扰序列以敲低TUG1的表达模拟子痫前期的发病过程。利用transwells实验研究了TUG1敲低以后对HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力影响。结果表明,敲低TUG1后与对照组细胞相比，抑制了滋养细胞HTR-8/SVneo迁移能力,抑制侵袭能力(图3C和D)。这些结果表明,敲低TUG1表达后抑制滋养细胞的表型,阻碍了滋养细胞HTR-8/SVneo的迁移和侵袭。可见，TUG1的低表达表达影响着正常滋养细胞HTR-8/SVneo的细胞迁移和侵袭能力，进一步影响着胎盘的浅着床，诱导子痫前期疾病的发生，给药TUG1可以治疗子痫前期疾病。

讨论

在过去的十年里,随着测序技术和生物信息学的快速发展,越来越多的lncRNAs被人们认知。在多种人类疾病中包括子痫前期中lncRNA呈异常表达。例如,在子痫前期中lncRNA MEG3的表达异常影响滋养细胞的增殖及凋亡能力。此外,一些研究显示,lncRNAs比蛋白质编码基因更具组织特异性,这说明lncRNA更有可能作为不同肿瘤更加敏感的生物标志物。因此,发现子痫前期相关的lncRNAs,研究他们的临床意义和生物功能，可促进lncRNA指导的子痫前期的诊断和治疗。

本研究中,我们发现了一个新的lncRNA TUG1并证明其在子痫前期组织中表达下调。下调的TUG1表达与子痫前期发病机制有着密切的关系。此外，敲低TUG1后抑制细胞增殖,迁移和侵袭,促进滋养细胞凋亡。此外,我们认为敲低TUG1介导的滋养细胞生长抑制在一定程度上依赖于KLF2和RND3的表达。在这里,我们首次证实TUG1在人类滋养细胞中行使相关功能，是通过抑制的滋养细胞抑制因子KLF2和RND3的表达。lncRNAs通过各种机制调节靶基因的表达,如招募染色质调节酶到靶基因和顺式或反式调节转录,作为脚手架结合相关分子原件或吸附miRNA。在这项研究中,我们发现在HTR-8/SVneo细胞中TUG1可以结合EZH2,招募他们到KLF2和RND3启动子区域抑制其转录。

EZH2-PRC2的核心单元,是一个组蛋白甲基转移酶，催化靶基因的H3K27三甲基化；本实验中，我们进一步证明，在滋养细胞HTR-8/SVneo中KLF2与RND3共同转录，可被TUG1募集的EZH2抑制。KLF2是一个细胞抑制因子大家庭的重要成员之一,已被确定为一个新的细胞平衡调节器。我们的结果也表明了,上调其表达水平可以抑制滋养细胞HTR-8/SVneo生长和诱导细胞凋亡，减弱细胞的迁移和侵袭能力。综上所述,我们的研究结果表明,lncRNATUG1表达减少可能导致胎盘的浅着床，诱发子痫前期的发生和发展。

我们的研究首次发现,在子痫前期孕妇胎盘组织和细胞TUG1表达下调。在子痫前期孕妇胎盘滋养细胞HT-8/SVneo敲低TUG1的表达，表现出细胞抑制功能，表现为细胞增殖、迁移减少以及细胞凋亡增加。此外。我们的发现会进一步丰富子痫前期发病机制,并促进lncRNA指导的诊断和治疗。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省人民医院

<120> 一种长非编码RNA及其在诊断／治疗子痫前期中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7598

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcctgctttc ctgaccctct ccgccattta aagaaacagt accgggggcg ggccgagcga 60

cgcagccggg acggtagctg cggtgcggac cggaggagcc atcttgtctc gtcgccgggg 120

agtcaggccc ctaaatcgaa gaagccctgg cgcgccctcc ccccctcccg ggtctggtag 180

ggcgaaggaa cgggcgtgcg gtcgatcgag cgatcggttg gcggctcttt ctcctgctct 240

ggcatccagc tcttggggcg caggcccggc cgccgcggcg cgcgcccggt ggccgttggc 300

gctcgcgccg cgtctttctt ctcgtacgca gaactcgggc ggcggcctat gcgtttgcga 360

ttcgacgagg agtcgtccgg gtggtcggcg gcggcgggca gctgctccgc cccgctccgg 420

gggaggcggc ggcggcagcg gccgcgggat ttggagcggc cggggaggcg ggggtggccg 480

gggccggctt ggaggcctgg cgccaccctt cggggcctgc aaggacccag ttgggggggc 540

aggagggggc cggaggatgg ttggttgtgg gatttctact ttgccttttc ctccttatgc 600

cgccttagtg aggggcggga gctctggcgg cagccccggg gtggggagac gagctccgga 660

gtcggaagag ctgggttttc ttccgggcct agccaccagt tggcggagtg accttaggcg 720

agtcactctg taatttgtct gcgcctcagt ttcctcctct gcctatcaat gtgtgtgggg 780

ttgaaatcgc tttgtaaact ataaagcgtg ggtgtacgta aaggatggtt attgtttata 840

attttttttg agttgtaaga aaacttagca gttccccaat ccttgggttt tgaacctggg 900

aaccttggat tggagttggg gatccccaaa cttcctgaaa ttgtgggaat gtgcggtttg 960

ggggaatgat gggaatttgt gggaatgtgc gttttagggg aatgatgatc catcgctagc 1020

aagttttcca agggggctgt gacccagaag agttaagaat cacaatttct tcatgctaca 1080

gagaggaaac tgaggcctag atgtcatttg ggacccttca caaccatttt gaagccctgt 1140

ttgagtccct gggatatgtg agctgtttct atgcataatg gatattcggg gttaacaaca 1200

gtcccctgct tggcttctat tctgaatcct tttctttcac catggggtgc ctgaagggtg 1260

gctgatgcat atggtacaat ggcacccagt gtaaagcagc tacaattagg agtggatgtg 1320

ttctgtagca tcctatttaa ataagcctat tttatccttt ggcccgtcaa ctctgttatc 1380

tgctgcttgt actggtgcct gtacttttct gactctcatt gaccatattc cacgaccatg 1440

gttgtcatcc attacttgat cctactttac atgtctaggc tgtgtggttg gtggtgaata 1500

ggcttctttt tacatggtgc tgccagccca gctaattaat ggtgcacgtg gacttttagc 1560

aagcgggctc actggaagag actgaacctg gcatggaatt cctgaagatg tttggggttt 1620

ttttctttct taatcgaaag ttaacattgt ctgaaaagtt ttgttagaac tactgcggaa 1680

cctcaaaatc agtagatttg gaagtgattc aaagctaaac tttttccttg gccctccttg 1740

tgttctaatt gcttgcaagt gtaatactag gatgtccaag atgccagttt ttgcttcttt 1800

gttagttgtc agctgctttt atcaaatttc aggccattat ccaacaaaca ctataaaaat 1860

gtttgaacaa ttggatttca aacattttcg ttttgtggag tggtgctcac caagtggtac 1920

agccctaagc aagtgaacac aaacacattt aagtgtattt tgtctgatta gatgttagcc 1980

agttatgcta tttcattcaa atgtctgaaa aaatcaattg actattccct tttcctaaag 2040

ggcagagaca gataatctca cttccagaga aatgacttgg agaaaaaaaa gtgttggtct 2100

ttttgctctt ttgtaattaa atccggatgt acctcaaaag acttaagact gtggtgataa 2160

gatgctttcc tcagcagaaa ggagggaaaa aaaacaactg gaactcaaag cttgaaattc 2220

tgtggcaaaa catgagatgt ccaggattgg aggttgaaaa gatttcacta cagtgttctg 2280

caatagttgg agcagataac tttcagtgta gccacagcca tggactccag atttccagat 2340

tttcaagacc tggacctgga acccgaaaga gcttgtcacg atgcggcagg aacactggag 2400

gtagattttt ttttattttt gaattttggg actgttgacc ttgctgtgag aaaagagaca 2460

acgactgagc aagcactacc accagcactg ttactgggaa ttagaagacc tgagtttctg 2520

tccagaccct cagtgcaaac tgaggatgct ccatccaaag tgaattatga tagcagactc 2580

cttgaaagca gggtccttgt ttagtgcatc tttgcccaca tacaccacaa catatcaaga 2640

tgcatttatt aggaaggagg agtttagaga gcaggctatc agaataacca ctcacctaca 2700

gacctggtac ctggattttt gcccgagatg attcctacca ccttactact gacgaagaca 2760

cccattccag tggaccactg tgacccagga ggcattcagc catcatgatg tggcctttac 2820

ctccactcct gtcttgttct acccagattc agcacagccc tttatagtga agtcagagtc 2880

ctcaagccaa atagctaaag ctgttttatc acaacaaagg cctagtttgt tccatgagtg 2940

tgcatttcat ttcttcagtt aaagccttca gagacacaca ataaatttgg accaggggat 3000

tttttagtta ttaatgctct ctgaagaaag gcaacatctt tttgagagca gcattggacc 3060

acaccccaca atctcaaatg attgaaattc atgaacatct aggatcccgt gaaggtcact 3120

ggaccctgtt ttttctactt caaatcctgt agtagcctac tgaatgagaa aacatattct 3180

gacccattgg gatcaaatca aaggcacagt gaactcctca tagcatcttc tttggaatta 3240

ctcaggaacc agaacttttt acacaaatgt aagaaattct accaaggagt ccccttacct 3300

aacagcatct cacaaggctg caccagattc cagaaaaggc ttctcttgat acatcaaggt 3360

agaacctcta tgcattttgt gaccgactta ttcttagatc attggttttc caaaggcttt 3420

gtggccatga agccctttga gtgaaaactg tgcagaagcc cagagtaaaa gtgaagctgc 3480

tctggatgaa gtagtgaagc aagagtaggg gcctgaatcc tgctacaact atcttccttt 3540

accaccgtgg tgacacctaa ggggacttcc ttacaacacc ttgaactctt ccgaacacag 3600

tttgaaaacc actgccccag acagcaatat gtttgacctg aatggcattc caatcttttc 3660

tgtacctcca ctcagcacag ttcatgttca gtagatgctg aacattctta gaaatactgt 3720

gtgtgaactt agaaaagtgc aagaagacag gcatgtcttt gaccccagga atgatcattt 3780

gctgaagatg gtgtcaagtg aacctagatt aacagccctc cactccagat ggatatccag 3840

tgattcctag aatgggatat agccagagaa caattctatg caccctacac tgacagactc 3900

ccttaagcaa caccagatgc tctactggta cttgaagtac atgactttga agtcttgacc 3960

ctccatgaat acctgaatta tcagcaagcg ggttttgaag ctggtgcctc attgaggcca 4020

tattagagca acttgtacat ttgacctctt gttatcagcc atggtactct acttcgtgtg 4080

caagagataa ctatgaaagc caaattcaaa tactggcaac atttcctaaa ggggctcaat 4140

atctatcatt cgtcttcttt tccaaactac acatcactgt atgactcaac cagtagcagt 4200

tatattgccc cttggttttt attcagttta actactgttt ccaagataaa tgagctaata 4260

agctttaaaa aaaaaaaaaa aaaaggctga attctttttt cttcatcact ggcatatctg 4320

cctattctcc agaattatta tgactattca gctcacttta acagttgaac ttcaagcgac 4380

aatctttgaa caccccttct catgtgattt aaaatgaaac catttggaaa agtttcttct 4440

agccagtaat agattttttt tttaattgct ctgccttgtg ccgagagatg ttcttttaag 4500

atgaatcttt tgatgtctga taccaccaaa tataggtggt agggagagtt ggaggctggc 4560

cctttgagca ggccattagc ttacttgctg ggcatttccg atagcttatt gcctaccttt 4620

ttgctggaaa caaactgatt tgaaaaacaa aatctatgaa gactgcagct aaggatttta 4680

tcggtagact taagagcttt tgtccttgtg gatattttag tggaaccaca tcagtctcaa 4740

tactgtcatt ttacactgac tcagagcagc tgacttcatt ccttgccatg atatatattt 4800

aaggcaggca ttgtaacaga cataaagaca acttatctgt ttcagcagga aggattcagt 4860

ttatgaactc tcagaccaga tcatgttgaa caaggagact ttgatgtgtg tcatgagaaa 4920

actcattctt tacttcccag tcaatttaaa ggccagctat cctgagctac tcgaatgaat 4980

gcactggtta aacattggaa atagtttgtt tatatccttg tctctctcta ggccaattgt 5040

gattacatga ctcgactcta catctcgtca aacaaggcct aggtctggtt gctgtagact 5100

gctcgccctc aacaaataaa atctggttga ctagcctcct tgtatataca actattattt 5160

gttaagaaga aattatcgtc aattttctac taccttccaa ttgtcagctc tttttttcct 5220

ctctggtttt tcctatactt tacagaaaaa gacattgatc tatactgcca ttccctctaa 5280

tcctgccata ctcagtcaaa aggaatgact taagatgaag atgatcatct gctcgagtct 5340

aaaatataca ttgtatataa gaattggtga ttagaaaagc aaaaaaccta aaacttaaat 5400

ctaggagtct gtatactgtc tccatgtctc catgcctcag atctcatcta aatctttgaa 5460

cagcaccatt caaccaatct gaggccttga cttgcttgta agatgattct cagagatcgg 5520

ctgagttaaa aaagatgacg acttgattac caaagaaagt agggccaact ttgacaaatc 5580

tggctctgct gaccctgtca ctcccagatg tagcatagac tcctaaacag aacctcaagt 5640

ctgattgagg ataaggcctt ctcctgagct gaaagttctt tggcagatga gcaagaaact 5700

gaaagctgat gtacctgact ggctctgtaa gatcagaaaa ctgtatccag aataagccct 5760

atggattaac ccctgagtac ccagagtaaa aactaattta cagaacttcc ttattgatct 5820

gctggttctt ccagatcata ttctggctat tggtatggct ggcctttctg aaggtaccct 5880

gcttgtctat tttcctgact cagctcttgc ctgccttttt cacatgttgc tgcaattaga 5940

ctcaccgtga ggactacagt caatttcagt ctatcttgtg cccaatacaa caaggatttt 6000

taatagtaac aacccacacc tcacccacta ggactcaatg ttcacaacag gaaggaccat 6060

tgctgcatac tccttgacca gcaacttttt tgaagatatt tttaagtgca gagtaggcct 6120

ctattcctgt atgtaattgt tcattttcag cacctggaac ctcatctatc gggtctggaa 6180

ggaatacagc agttcgaaag ccgcgtccat ttctctcctt cagtagtgca gaaatgagtc 6240

cgattcacca gtacacacag aactgtacca gttcaaccta gcaaaagaag aaaagtttcc 6300

actgtactta aaatttacag ctgactcaaa ttgcctcaca gaattatttg atgtagaagg 6360

ctagttgtct tacttcagat cagcaggaca gttgggctct cagactcatg accactgagt 6420

ttgcttgtgt tgaaactgtg gtttcatcca acatatgcta ttggacatga ttattattcc 6480

attcaaatgg attacagact tcttgaggac aggacaaact tatctctcat ggtgtttttt 6540

tagaatactt ttataaccaa ggaagaaacc atgccagctg ttaccattca acttcttaag 6600

cagagattaa gctttttcat atctgttctt atcctggaca tcagtagttt ttaattgccc 6660

agcatccgtt ccatcttgta acaactccct gatgtttctt aaaaccacct cttcctattt 6720

tcagtctgtg gtttggacag tctgacccaa ccttgagctt tgtgggtgaa catgtaattc 6780

agacctcatc aatcagcaaa tccatctgaa ctgtggagga gaagctctct ttactgaggg 6840

tgctttagct ttgtaggatg aaaacctcaa actaacaggg cctaccatgt agagaatgaa 6900

gccagtgcag gggaaagcag agccaaaata tggagagact tgaatcctga tgacagcgtt 6960

tgtgcccctg gatccaaccg tgcctgaagc tagaatatcc cctggacttt tcagttatgt 7020

gaaccaataa ataccctttt ttgcttaagt tactttgagt tgggtttctg ttacttgaaa 7080

ttgaatccac actaatatat ctaccaacat tgagacttga cagatccaag tatttattaa 7140

gctagaggtc atggtcactg aaattacttt ccaaagtgga agacaaaatg aaacaggaac 7200

tgagggaata tttaagatcc cacagaagcg taaaaatgac atggtagaaa gtaatagaaa 7260

acctaaatgt ctgtcattaa aggataggtt aaggtgtggt tcagccatat aggaatatct 7320

cgtatctgtt aaaatgaata aagtacattc attgtgtatg gaaaaatggc catgatacat 7380

taggtgaaac aagttattaa tagaaaagtg tacagtgtga actcatttta aaatgtgtgt 7440

gcttatgttt ataaatgcat agaaaggtct attcacagct ttctttgaac agtgtagatc 7500

acatgaaact ttcaacttta tacatttctg tattaatatt ttacactacc cacattattt 7560

ttaaacttta ttttaaataa agaattttta aaattaaa 7598

<210> 2

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggauauagc cagagaacaa uucua 25

<210> 3

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcuuggcuuc uauucugaau ccuuu 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tagcagttcc ccaatccttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cacaaattcc catcattccc 20

Claims (11)

1.一种长非编码RNA，TUG1，长度为7598bp。其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，即：

2.如权利要求1所述一种长非编码RNA在制备诊断子痫前期试剂中的应用。

3.如权利要求1所述一种长非编码RNA在制备治疗子痫前期药物中的应用。

4.一种检测TUG1的引物，如SEQ ID NO：4、5所示，即：SEQ ID NO：4 TUG1FTAGCAGTTCCCCAATCCTTG，SEQ ID NO：5 TUG1 R CACAAATTCCCATCATTCCC；。

5.两种干扰TUG1的siRNA,如SEQ ID NO：2、3所示，即：SEQ ID NO：2 si-TUG1-1#(sense5-GGGAUAUAGCCAGAGAACAAUUCUA-3)；SEQ ID NO：3(sense5-GCUUGGCUUCUAUUCUGAAUCCUUU-3)。

6.一种试剂盒，包括权利要求4所述引物。

7.一种包括权利要求1所述RNA的药物组合物。

8.如权利要求4所述引物在制备诊断子痫前期试剂中的应用。

9.如权利要求7所述组合物在制备治疗子痫前期药物中的应用。

10.根据权利要求7所述药物组合物，其中还包括辅料。

11.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述引物中的浓度分别为10mol/L。