CN104694639B - 一种用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒 - Google Patents

一种用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒，其包括用于扩增miR‑214的引物。此外，本发明还涉及用于扩增miR‑214的引物在制备可用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒中的用途。

Description

一种用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒
本申请要求中国发明专利申请201410050513.3的优先权(申请日：2014年02月14日，发明名称：一种用于骨质疏松的辅助诊断的血液检测试剂盒)。
技术领域
本发明属于分子诊断领域，尤其涉及可用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒。此外，本发明还涉及用于扩增miR-214的引物在制备可用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒中的用途。
背景技术
骨质疏松症是指以单位体积内骨量低于正常为特征的骨胳疾病，骨质有机成分生成不足、继发性钙盐减少及骨组织微隙结构破坏是其主要表现。骨质疏松症目前已经成为世界性问题，是继肿瘤、心血管疾病之后又一严重危害人类健康的一种疾病。有研究显示，骨质疏松症其发病率居常见病、多发病的第7位。
骨质疏松发病现状
我国是世界上老年人口数量最多的国家，预测到2050年我国60岁以上的老年人将占全国总人口的20％。随着人口的日益老龄化，老年性疾病，特别是骨质疏松的发病率也在同步增长。目前我国有骨质疏松病人约9000万。到2050年将增至2亿多人，占人口的13.2％，但目前医学上还未有安全而有效的根治方法帮助已疏松的骨胳恢复原状。因此，正确认识、早期预防、早期干预、早期诊断显得尤为重要。
骨质疏松的现行诊断方法
骨质疏松症是一种发病隐匿、常见但又诊断不足的疾病，其早期准确诊治将有助于为更好的防治骨质疏松提供依据。目前骨质疏松的诊断仍沿用1994年WHO颁布的以骨矿含量(BMC)和骨密度(BMD)为基础的骨质疏松诊断标准，即以双能X线吸收法(DEXA)为基本测量方法。BMC或BMD在青年成人平均值的1个标准差(s)以内者为正常；若以T评分(T值)表示，即≥-1.0为正常，-2.5<T值<-1.0为骨量减少，≤-2.5为骨质疏松。但目前集中于-2.5的T评分阈值正在发生改变。利用该标准进行判断时，骨质疏松组和正常组有一定程度上的重叠，该标准有待进一步完善。除此之外，临床上还结合血、尿生化检测、内分泌功能测定、骨形成和骨吸收指标、骨骼X射线、双能X线骨密度吸收法(DEXA)及定量CT(QCT)以及定量超声(QUS)等检测指标，上述检查指标花费高，步骤繁琐，结果不准确，等诊断为骨质疏松时，病人已经发生了骨量和结构的改变，加之目前又缺乏真正有效的治疗药物，因而亟需发现更加灵敏、特异、易于检测、明确而有效的生物标志物，对骨质疏松作出准确、及时的诊断。
另一方面，近来，人们越来越认识到miRNA是在发育、病理与生理条件下发挥重要作用的调控因子，参与肿瘤的发生、病毒的感染、细胞的分化与功能的发挥等一系列的生命过程中。miRNA是单链的小RNA分子，大约21或22个核苷酸长。这些小RNA分子不编码蛋白，但是它们通过降低mRNA的水平或与mRNA 3’UTR相结合抑制翻译，从而降低体内的蛋白水平。令人意想不到的是非编码RNA分子占人类基因组总量的98％，非编码RNA与蛋白编码RNA的比例与发育的复杂性密切相关。因此，如果筛选出在骨质疏松发生过程中血液中异常表达的miRNA作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对骨质疏松的诊断现状必将是一次有力的推动。
关于miR-214
miR-214最早发现在斑马鱼的慢肌发育过程中发挥着重要的作用。后来证实，miR-214可以与Ezh2的3’UTR相结合，降低细胞内Ezh2的水平，从而促进骨骼肌细胞的分化和胚胎干细胞中发育调控因子的转录。在未分化的骨胳肌细胞中，PcG蛋白抑制miR-214的转录，随着发育的进行，伴随着PcG的解离和MyoD以及myogenin的募集，从而激活miR-214的转录。
已有研究表明，骨质疏松病人骨组织中的miR-214的表达水平明显升高，因此，骨组织中的miR-214可作为骨质疏松早期诊断及预防的生物标志物(中国专利申请公开号CN102335189A)。
但是，骨组织中的miR-214来源于成骨细胞，而成骨细胞成分不能进入到血液中，因此，骨组织中的miR-214与血液中的miR-214并无关联。
发明内容
本发明人长期从事miRNA相关的研究工作，在深入的研究中，我们通过大量的实验发现：
血液中的miR-214(5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’)是骨质疏松发病的特异性生物标志物，从而完成了本发明。
即，本发明包括：
1.一种血液检测试剂盒，其包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
用于从血液中提取miRNA的试剂；
其中，所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214的cDNA的扩增引物。
2.根据项1所述的血液检测试剂盒，其用于骨质疏松的诊断。
3.根据项1或2所述的血液检测试剂盒，其中，所述miR-214的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据项1～3中任一项所述的血液检测试剂盒，其中，所述miR-214的cDNA的扩增引物是：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.用于扩增miR-214的引物在制备血液检测试剂盒中的用途，其中，所述血液检测试剂盒包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
用于从血液中提取miRNA的试剂；
其中，所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214的cDNA的扩增引物。
6.根据项5所述的用途，其中，所述血液检测试剂盒用于骨质疏松的诊断。
7.根据项5或6所述的用途，其中，所述miR-214的反转录引物的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
8.根据项5～7中任一项所述的用途，其中，所述miR-214的cDNA的扩增引物是：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
需要说明的是，在本说明书中，血液包括血浆、血清和全血，优选为血浆、血清，更优选为血清。
本发明通过控制年龄等对骨质疏松发展的影响因素，研究血液miRNA在骨质疏松诊断中的应用前景，阐述异常表达的miRNAs对骨质疏松进展的影响，揭示其筛查和早期诊断的价值。因此，本发明获得了骨质疏松发病特异性的血液miRNAs表达的特异性标志物。通过对血液生物标志物和诊断试剂盒的研制与应用，仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其他组织，通过最精简的引物库来检测血清miRNA水平能扩展骨质疏松的检测指标，提高检测的灵敏度，可使得骨质疏松的诊断和治疗更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果的评价奠定基础。
附图说明
图1显示骨组织中miR-214水平与血清中miR-214水平之间的关系的图。
图2显示临床骨质疏松病人血清中miR-214的水平与腰椎T值相关性的图。
图3显示临床骨质疏松病人血清中miR-214的水平与血清中骨吸收速率的敏感指标I型胶原羧基端肽(CTX)的相关性的图。
具体实施方式
在一个方面中，本发明提供一种血液检测试剂盒(本发明的血液检测试剂盒)，其包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
用于从血液中提取miRNA的试剂；
其中，所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214的cDNA的扩增引物。
本发明的血液检测试剂盒可用于骨质疏松的诊断。本说明书中，“诊断”可以是确诊，也可以是为确诊提供参考信息。
miR-214的核苷酸序列为5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’，针对已知核苷酸序列的miRNA设计其扩增引物(包括反转录引物和cDNA扩增引物)是本领域技术人员熟知的，例如可以按照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克(Sambrook.J.)等著，黄培堂等译，第3版，2005)的教导来进行设计，或者利用计算机软件(例如Premier公司开发的Premier 6.0)来进行设计。
特别是，在使用SEQ ID NO:1所示的miR-214的反转录引物、SEQ ID NO:2所示扩增miR-214的cDNA的上游引物、以及SEQ ID NO:3所示扩增miR-214的cDNA的下游引物时，本发明的血液检测试剂盒的检出率(灵敏度)可达(94.7)％，完全满足医疗器械法规中作为诊断试剂盒的要求。本说明书中，检出率是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。本技术领域确认骨质疏松的“金标准”是双能X线骨密度吸收法(DEXA)。
因此，所述miR-214的反转录引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。所述miR-214的cDNA的扩增引物优选是如SEQ ID NO:2所示的上游引物和/或如SEQ ID NO:3所示的下游引物。
其中：
SEQ ID NO:1
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTGCC
SEQ ID NO:2
GACAGCAGGCACAGACA
SEQ ID NO:3
GTGCAGGGTCCGAGG
上述用于扩增miR-214的引物是本发明的血液检测试剂盒实现高检出率的关键。因此，本发明还提供上述用于扩增miR-214的引物在制备血液检测试剂盒中的用途。其中，所述血液检测试剂盒可以是例如本发明的血液检测试剂盒。
用于从血液中提取miRNA的试剂及方法是本领域技术人员已知的，例如可以参照Qiagen血清microRNA检测试剂盒产品说明书。作为用于从血液中提取miRNA的试剂可以列举出例如：氯仿、RNAase抑制剂、DEPC水、乙醇等。
本发明的血液检测试剂盒适用于利用实时定量PCR对血液中的miR-214进行检测的方法，因此，其还可以包含实时定量PCR反应所使用的酶和/或试剂，例如：逆转录酶、缓冲液、dNTPS、MgC12、去核酸酶水、荧光染料或探针、Taq酶等。这些酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，可根据具体采用的检测方法适当选择。此外，本发明的血液检测试剂盒还可以包含标准品和对照(如定量标化的线虫miR-39样本等)及正常参考值(1-3*105拷贝/ul)。采用本发明的血液检测试剂盒，只需要血液而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测miR-214，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。
实施例
实施例1.血清中miR-214的水平与骨组织中miR-214的水平相关性
构建了成骨细胞特异的转基因小鼠，提取骨组织及血清中的microRNA，通过Q-PCR对miR-214的含量进行测定。结果表明，血清中miR-214水平与骨组织中miR-214水平无相关性。具体方法如下：
成骨细胞特异转基因小鼠的构建：
利用成骨细胞特异表达的OCN启动子驱动miRNA-214表达的载体，将载体将外源基因直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，形成成骨特异转基因动物，即miR-214在成骨细胞特异高表达。
骨组织miRNA的提取：
鉴定成骨特异转基因阳性及同窝对照野生型小鼠，麻醉，处死，取胫骨和股骨，取液氮研磨，骨组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变碎，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
匀浆：骨组织样品按50-100mg/ml加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10％，否则匀浆效果欠佳，用超声裂解器或电动匀浆器充分匀浆。.4℃12000rpm离心10min，弃沉淀。.按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4℃12000g离心15min。吸取上层水相，至另一离心管中。注：尽量不要吸取中间界面。按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。4℃7000g离心5min，尽量弃上清。室温晾干或真空干燥10-15min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。可用50ul H2O，TE buffer或0.5％SDS溶解RNA样品，55-60℃，5-10min。测O.D值定量RNA浓度。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间；产率估计：组织标本：(ug RNA/mg组织)1-10ug。
血清中miRNA提取方法：
小鼠血清样本的制备
采集小鼠血液，室温或4度保存，一小时内进行下一步处理。1900g(3000rpm)4度离心10min；取上层黄色液体为血清；16000g离心10min
血清中miRNA的提取
使用美国QIAGEN公司miRNeasy Serum/Plasma kit(217184)，miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-control(219610).
具体方法如下：.将-80℃保存的血清融化，各取200ul；加入1ml的QIAzol LysisReagent(随试剂盒提供)，充分混匀；室温(15-25度)下放置5min。加入3.5ul miRNeaysSerum/Plasma Spike-in Control(1.6×108copies/ul)，充分混匀；加入200ul氯仿，充分混匀15秒；室温(15-25度)下放置2-3min；4度12000g离心15min；上清转至新的离心管中，加入900ul的100％乙醇，混匀；吸取700ul转至RNeasy MinElute spin(随试剂盒提供)，室温下8000g离心15秒；剩余的样品重复步骤9操作，去掉离心下来的液体；在RNeasy MinEluteSpin中加入700ul试剂RWT(随试剂盒提供)，8000g离心15秒，弃掉离心的液体；在RNeasyMinElute Spin中加入500ul试剂RPE(随试剂盒提供)，8000g离心15秒，弃掉离心的液体；在RNeasy MinElute Spin中加入500ul 80％的乙醇，8000g离心2min，弃掉液体；RNeasyMinElute Spin放入新的离心管中，13000g离心5min，以去掉酒精；RNeasy MinElute Spin放入新的离心管中，加入14ul的去RNA酶的水，离心机最大转速离心2min，收集得到血清中获得的RNA。
血清中成熟miRNA的颈环法反转录反应：
使用Takara公司RT kit
具体方法如下：
反转录反应如下：
混匀，37度反应60min；95度，5min，放置冰上；将得到的20微升反转录反应后的cDNA稀释25倍，到500微升，-20度保存以备下一步实时定量PCR检测。
实时定量PCR检测血浆中miRNA的表达
使用美国Takara公司SYBR Premic ex Taq进行实时定量PCR检测。
具体步骤如下：
构建PCR反应体系如下：
混匀，反应程序如下：
血清中目的miRNA的表达以cel-39的表达为对照，以2Ct(cel-miR-39–目的miRNA)的数值为每个血清中成熟miRNA的表达情况。
结果分析
以PCR反应后溶解曲线为标准，验证PCR反应的特异性。血清中miRNA的表达表示，以GraphPad prism5做统计分析
结果：骨组织中miR-214的水平升高了15倍，而血清中miR-214的水平保持不变(如图1所示)。
实施例2.血清中miR-214的水平与腰椎骨密度的T值相关性研究
病人血清中miR-214的提取与检测：
同实施例1
病人腰椎骨密度的检测：
应用双能X线骨密度仪,对病人腰椎(Ll一14)骨密度测量,将所得结果标准化处理并经骨密度仪计算出T值后分组并进行相应统计学分。
统计分析：
使用GraphPad Prim5.1中相关性分析方法可以用来验证血清中miR-214的水平与腰椎骨密度的T值的线性关系，从相关系数r我们可以知道两个变量是否呈线性关系、线性关系的强弱，以及是正相关还是负相关。
结果：血清中miR-214的水平与腰椎骨密度的T值呈现明显的负相关(R2＝0.5221)(如图2所示)。
实施例3.血清中miR-214的水平与骨吸收速率的敏感指标I型胶原羧基端(CTX)的量的相关性研究
病人血清中miR-214的提取与检测：
同实施例1
病人血清中骨吸收速率的敏感指标I型胶原羧基端(CTX)的检测：
使用Elisa方法检测血清中I型胶原羧基端(CTX)的含量。
统计分析：
使用GraphPad Prim5.1中相关性分析方法可以用来验证血清中miR-214的水平与CTX值的线性关系，从相关系数r我们可以知道两个变量是否呈线性关系、线性关系的强弱，以及是正相关还是负相关
结果：
血清中miR-214的水平与骨吸收速率的敏感指标I型胶原羧基端(CTX)的量呈现显著的正相关(R2＝0.4864)(如图3所示)。
实施例4检出率验证
临床骨质疏松病人的收集标准
女性骨质疏松病人：绝经5年以上(建议大于60岁)；无肿瘤、糖尿病、甲状腺功能亢奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃肠道疾病、严重感染性疾病、严重妇科疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物使用史(双膦酸盐类、降钙素类、骨化三醇类、雌激素类等)。
男性骨质疏松病人：年龄60岁以上，无肿瘤、糖尿病、甲状腺功能亢奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃肠道疾病、严重感染性疾病、严重妇科疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物使用史(双膦酸盐类、降钙素类、骨化三醇类、雌激素类等)。
对照遴选标准：
无肿瘤、糖尿病、甲状腺功能亢奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃肠道疾病、严重感染性疾病、严重妇科疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物使用史(双膦酸盐类、降钙素类、骨化三醇类、雌激素类等)。
临床检测指标：
(1)骨密度的检测：双能X线骨密度仪测定腰椎骨密度；
(2)生化指标的检测:建议测定TRACP5b(骨吸收)和Bone ALP(骨形成)作为比对和初步分类标准。
(3)病人血清中miR－214的检测。
受试者血清中miR-214的提取与检测、结果分析同实施例1。
实验结果：
根据目前临床骨质疏松检测标准，通过DEXA检测，T值小于-2.5的骨质疏松病人。在本研究中收集了200个受试者的血清，按照上述实施例1进行了检测，以microRNA拷贝数大于3*105拷贝/ul为阳性指标(即确定为骨质疏松)，共有90人，同时对该批人用DEXA的方法进行了骨质疏松检测，共有95人T值小于-2.5，包含前述90人中的全部，因此，检出率为94.7％(90/95)。

Claims (4)

1.用于扩增miR-214的引物在制备用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒中的用途，其中，所述血液检测试剂盒包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
用于从血液中提取miRNA的试剂；
其中，所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214的cDNA的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述miR-214的反转录引物的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述miR-214的cDNA的扩增引物是：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述血液为血清。
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