CN106554991A - 可用于冠状动脉血管钙化诊断的血液miR-134检测试剂盒 - Google Patents
可用于冠状动脉血管钙化诊断的血液miR-134检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种可用于冠状动脉血管钙化诊断的血液miR-134检测试剂盒,其包括用于扩增miR-134的引物。此外,本发明还涉及用于扩增miR-134的引物在制备可用于冠状动脉血管钙化的诊断的血液检测试剂盒中的用途。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域,尤其涉及可用于冠状动脉血管钙化的诊断的血液检测试剂盒。此外,本发明还涉及用于扩增miR-134的引物在制备可用于冠状动脉血管钙化的诊断的血液检测试剂盒中的用途。
背景技术
冠状动脉血管钙化在其最初发现时被认为是一种良性的、随着年龄增长而出现的的老化现象,但后来随着大量的研究的证明,人们发现冠状动脉血管钙化是严重心血管事件的一个很重要的危险因素。冠状动脉血管钙化会导致血管顺应性的降低、异常的血管收缩反应,甚至阻碍心肌的灌注。在70岁以上的人群中,90%的男性和67%的女性均有冠状动脉血管钙化的发生,很多因素如高血压、糖尿病、血脂异常、超重肥胖、吸烟等,都被证实是冠状动脉血管钙化的危险因素。冠状动脉血管钙化本身在临床上并没有特征性的表现,但病人在发现冠状动脉血管钙化是已经有了很严重的心血管事件了,因此,冠状动脉血管钙化的早期诊断就变得尤为重要了。
骨质疏松现行的诊断方法
冠脉CT造影是目前主要的非侵略性诊断冠状动脉血管钙化的手段,而由Agararon等人在1990年首次提出的以冠脉CT造影为基础的冠状动脉血管钙化积分,也成为了定量描述血管钙化程度乃至动脉粥样硬化负担的最常用的标准。
但是,上述检查花费高、步骤繁琐,因此亟需发现更加灵敏、特异、易于检测、明确而有效的生物标志物,对冠状动脉血管钙化作出准确、及时的诊断。
microRNA作为生物标志物的研究现状
目前的研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs,这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测,且存在显著的疾病特异性。现有的成熟技术,包括定性、定量miRNA分子检测技术表明利用血清miRNAs作为分子标志物的方法比传统的特异蛋白分子检测方法更加有效,为分子标志物开拓了新境界。
已经发现了许多与心血管系统疾病相关的microRNA分子,分别参与心肌肥大,血管内皮细胞功能与活性、内皮细胞与平滑肌细胞功能的调节,但是目前还未见血清/血浆中microRNA作为冠状动脉血管钙化标志物的报道。如果筛选出在冠状动脉血管钙化发生过程中血清/血浆中异常表达的血清/血浆miRNAs作为生物标志物,并研制相应的诊断试剂盒,对冠状动脉血管钙化的诊断现状必将是一次有力的推动。
发明内容
本发明人长期从事miRNA相关的研究工作,在深入的研究中,我们通过大量的实验发现:
血液中的miRNA-134(5’-UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG-3’),是冠状动脉血管钙化发病的特异性生物标志物,从而完成了本发明。
即,本发明包括:
1.一种血液检测试剂盒,其包括:用于扩增miR-134的引物,其中,所述用于扩增miR-134的引物是miR-134的的反转录引物和miR-134的cDNA的扩增引物。
2.根据项1所述的血液检测试剂盒,其用于冠状动脉血管钙化的诊断。
3.根据项1或2所述的血液检测试剂盒,其中,所述miR-134的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1:
5’-GAATCGAGCACCAGTTACGCAATGCCGAGGTCGACTTCCTAGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
4.根据项1~3中任一项所述的血液检测试剂盒,其中,所述miR-134的cDNA的扩增引物包括:
上游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;和/或
下游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO:2:
5’-TGTGACTGGTTGACCAGAGGGG3’
SEQ ID NO:3:
5’-GAATCGAGCACCAGTTACGC-3’
5.根据项1~4中任一项所述的血液检测试剂盒,其还包括:用于从血液中纯化miR-134的试剂。
6.用于扩增miR-134的引物在制备用于诊断冠状动脉血管钙化的血液检测试剂盒中的用途,该血液检测试剂盒包括:用于扩增miR-134的引物,其中,所述用于扩增miR-134的引物是miR-134的的反转录引物和miR-134的cDNA的扩增引物。
7.根据项6所述的用途,其中,所述miR-134的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
8.根据项6或7所述的用途,其中,所述miR-134的cDNA的扩增引物包括:
上游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;和/或
下游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
9.根据项6~8中任一项所述的用途,其中,该血液检测试剂盒还包括:用于从血液中纯化miR-134的试剂。
需要说明的是,在本说明书中,血液包括血浆、血清和全血,优选为血浆、血清。
本发明人通过控制年龄等对冠状动脉血管钙化发展的影响因素,研究血清/血浆miRNA在冠状动脉血管钙化诊断中的应用前景,阐述异常表达的miRNAs对冠心病进展的影响,揭示其筛查和早期诊断的价值。因此,本发明人获得了冠脉钙化发病特异性的血清/血浆miRNAs表达的特异性标志物。通过对该血清/血浆生物标志物和诊断试剂盒的研制与应用,仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其他组织来检测血清miRNA水平,能扩展冠脉钙化的检测指标,提高检测的灵敏度,可使得冠脉钙化的诊断和治疗更加方便易行,为临床医生快速准确掌握患者病情,为临床治疗效果的评价奠定基础。
附图说明
图1显示了血清中miR-134表达水平同冠状动脉钙化积分的相关性。
具体实施方式
在一个方面中,本发明提供一种血液检测试剂盒(本发明的血液检测试剂盒),其包括:用于扩增miR-134的引物,其中,所述用于扩增miR-134的引物是miR-134的的反转录引物和miR-134的cDNA的扩增引物。
本发明的血液检测试剂盒可用于冠状动脉血管钙化的诊断。本说明书中,“诊断”可以是确诊,也可以是为确诊提供参考信息。
miR-134的核苷酸序列为5’-UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG-3’,针对已知核苷酸序列的miRNA设计其扩增引物(包括反转录引物和cDNA扩增引物)是本领域技术人员熟知的,例如可以按照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克(Sambrook.J.)等著,黄培堂等译,第3版,2005)的教导来进行设计,或者利用计算机软件(例如Premier公司开发的Premier 6.0)来进行设计。
特别是,在使用SEQ ID NO:1所示的miR-134的反转录引物、SEQ IDNO:2所示扩增miR-134的cDNA的上游引物、以及SEQ ID NO:3所示扩增miR-134的cDNA的下游引物时,本发明的血液检测试剂盒的检出率(灵敏度)可达95%,完全满足医疗器械法规中作为诊断试剂盒的要求。本说明书中,检出率是指:用“金标准”方法确认的阳性样本中,被其他方法测定为阳性样本的比例。本技术领域确认冠状动脉血管钙化的“金标准”是冠脉CT造影。
因此,所述miR-134的反转录引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。所述miR-134的cDNA的扩增引物优选是如SEQ ID NO:2所示的上游引物和/或如SEQ ID NO:3所示的下游引物。
本发明的血液检测试剂盒还可以包含用于从血液中纯化miR-134的试剂。用于从血液中纯化miRNA的试剂及方法是本领域技术人员已知的,例如可以参照Qiagen血清microRNA检测试剂盒产品说明书。作为用于从血液中纯化miRNA的试剂可以列举出例如:氯仿、RNAase抑制剂、DEPC水、乙醇等。
本发明的血液检测试剂盒可适用于利用实时定量PCR对血液中的miR-134进行检测的方法,因此,其还可以包含实时定量PCR反应所使用的酶和/或试剂,例如:逆转录酶、缓冲液、dNTPS、MgC12、去核酸酶水、荧光染料或探针、Taq酶等。这些酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的,可根据具体采用的检测方法适当选择。此外,本发明的血液检测试剂盒还可以包含标准品和对照(如定量标化的线虫miR-39样本等)及正常参考值(1-3*105拷贝/ul)。采用本发明的血液检测试剂盒,只需要血液而不需要其它组织样品,通过荧光或探针法检测miR-134,检测方便,且定量精确,大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。
在另一个方面中,本发明还提供上述用于扩增miR-134的引物在制备血液检测试剂盒中的用途。其中,所述血液检测试剂盒可以是例如本发明的血液检测试剂盒。
实施例
实施例1
确认了血清中miRNA-134的表达情况同病人中检测的冠脉钙化积分水平的明显正相关性。
血浆样本的制备
1).利用EDTA抗凝管采集受试者血液,室温或4度保存,一小时内进行下一步处理。
2).1900g(3000rpm)4度离心10分钟
3).取上层黄色液体为血浆
4).16000g离心10分钟
5).取上清,-80度保存待用。
血浆中miRNA的提取
使用美国QIAGEN公司miRNeasy Serum/Plasma kit(217184),miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-control(219610).
具体方法如下:
1).将-80度保存的血清融化,各取200ul。
2).加入1ml的QIAzol Lysis Reagent(随试剂盒提供),充分混匀。
3).室温(15-25度)下放置5分钟。
4).加入3.5ul miRNeays Serum/Plasma Spike-in Control(1.6×108copies/ul),充分混匀。
5).加入200ul氯仿,充分混匀15秒。
6).室温(15-25度)下放置2-3分钟。
7).4度12000g离心15分钟。
8).上清转至新的离心管中,加入900ul的100%乙醇,混匀。
9).吸取700ul转至RNeasy MinElute spin(随试剂盒提供),室温下8000g离心15秒。
10).讲剩余的样品重复步骤9操作,去掉离心下来的液体。
11).在RNeasy MinElute Spin中加入700ul试剂RWT(随试剂盒提供),8000g离心15秒,弃掉离心的液体。
12).在RNeasy MinElute Spin中加入500ul试剂RPE(随试剂盒提供),8000g离心15秒,弃掉离心的液体。
13).在RNeasy MinElute Spin中加入500ul 80%的乙醇,8000g离心2分钟,弃掉液体。
14).RNeasy MinElute Spin放入新的离心管中,13000g离心5分钟,以去掉酒精。
15).RNeasy MinElute Spin放入新的离心管中,加入14ul的去RNA酶的水,离心机最大转速离心2分钟,收集得到血清中获得的RNA。
血浆中miRNA-134的加尾法反转录反应
使用美国QIAGEN公司miScript II RT kit(货号:218161).
具体方法如下:
1).将10×miSript Nucleics Mix和5×miScript Hispec buffer(随试剂盒提供)充分融化
2).反转录反应如下:
3).混匀,37度反应60分钟
4).95度,5分钟,放置冰上。
5).将得到的20微升反转录反应后的cDNA稀释25倍,到500微升,-20度保存以备下一步实时定量PCR检测。
实时定量PCR检测血浆中miRNA-134的表达
使用美国QIAGEN公司miScript SYBR Green PCR kit(货号218073)进行实时定量PCR检测。
具体步骤如下:
1)构建PCR反应体系如下:
2)混匀,反应程序如下:
95℃,15min;(94℃,15sec,变性;55℃,30sec,退火;70℃,30sec,延伸)进行40个循环;
3)血清中miRNA-134的表达以cel-miR-39的表达为对照,以2Ct(cel-miR-39 –miRNA-134)的数值为血清中miRNA-134的表达情况。
血清中miRNA-134表达同病人检测的冠脉钙化积分的相关性分析
利用血清中miRNA-134的表达情况同病人中检测的冠脉钙化积分进行线性相关性分析,其中血清中miRNA的表达以Log2表示,以GraphPadprism5做统计分析。结果显示,血清中miR-134水平与冠脉钙化积分的水平呈现明显的正相关(R=0.7174)(图1)。
实施例2检出率验证
受试者招募标准:
年龄在50-70岁的男性,身体健康,身高162-175cm,无药物依赖,无精神、心理疾病、遗传病和传染病病史;无严重过敏史;无营养不良。
临床检测指标:
(1)冠脉CT造影,求出冠脉钙化积分
(2)血清中miRNA-134的表达水平检测
受试者血清中miR-134的提取与检测、结果分析同实施例1。
实验结果:
根据目前临床冠状动脉钙化检测标准,通过冠脉CT检测,CAS大于100为冠脉钙化病人。在本研究中收集了200个受试者的血清,按照上述实施例1进行了检测,以microRNA拷贝数大于1*104拷贝/ul为阳性指标(即确定为骨质疏松),共有95人,同时对该批人用冠脉CT的方法进行了冠脉钙化检测,共有100人钙化积分大于100,包含前述95人中的全部,因此,检出率为95%(95/100)。
Claims (9)
1.一种血液检测试剂盒,其包括:用于扩增miR-134的引物,其中,所述用于扩增miR-134的引物是miR-134的的反转录引物和miR-134的cDNA的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的血液检测试剂盒,其用于冠状动脉血管钙化的诊断。
3.根据权利要求1所述的血液检测试剂盒,其中,所述miR-134的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的血液检测试剂盒,其中,所述miR-134的cDNA的扩增引物包括:
上游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;和/或
下游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求1所述的血液检测试剂盒,其还包括:用于从血液中纯化miR-134的试剂。
6.用于扩增miR-134的引物在制备用于诊断冠状动脉血管钙化的血液检测试剂盒中的用途,该血液检测试剂盒包括:用于扩增miR-134的引物,其中,所述用于扩增miR-134的引物是miR-134的的反转录引物和miR-134的cDNA的扩增引物。
7.根据权利要求6所述的用途,其中,所述miR-134的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
8.根据权利要求6所述的用途,其中,所述miR-134的cDNA的扩增引物包括:
上游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2-5所示;和/或
下游引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
9.根据权利要求6所述的用途,其中,该血液检测试剂盒还包括:用于从血液中纯化miR-134的试剂。
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