CN104726570B - 一种检测血清中lncRNA‑NEAT1的试剂盒及其在肝癌血清学诊断中的应用 - Google Patents
一种检测血清中lncRNA‑NEAT1的试剂盒及其在肝癌血清学诊断中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医学生物检测技术领域,本发明利用lncRNA芯片筛选与肿瘤干细胞相关的lncRNA,结果发现lncRNA‑NEAT1在肝癌干细胞中高表达并可以调节肝癌干细胞的功能。本发明提供了lncRNA‑NEAT1在制备肝癌诊断标志物中的应用,以及lncRNA‑NEAT1在制备诊断肝癌的检测试剂或试剂盒中的应用。进一步地,本发明人建立了人血清中lncRNA‑NEAT1的检测方法和提供了血清中lncRNA‑NEAT1检测的试剂盒,通过对肝癌病人血清的检测,发现在血清中能够检测到lncRNA‑NEAT1,并且HCC病人血清中的lncRNA‑NEAT1含量明显高于正常人。本发明为肝癌血清学诊断提供了新的临床手段。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域,具体涉及一种检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒及其在肝癌血清学诊断中的应用。
背景技术
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,其表达具有明显的组织和细胞特异性,作用方式多样,可以从表观遗传、转录、翻译等多个水平对基因表达进行调控。lncRNA能够广泛地参与细胞分化、个体发育等生命过程,其异常表达与包括肿瘤在内的多种人类重大疾病密切相关。
lncRNA-NEAT1(核旁斑组装转录本1,nuclear paraspeckle assemblytranscript 1)包括两个转录本,分别是3.7kb的NEAT1v1(NR_028272.1)和23kb的NEAT1v2(HG503867.1),均是核旁斑的重要组成部分。核旁斑能够通过调节基因转录、mRNA核转位等参与调控多种生理过程如应激反应、细胞分化(参见文献Fox,A,et al.P54nrb Forms aHeterodimer with PSP1That Localizes to Paraspeckles in an RNA-dependentManner.Molecular Biology of the Cell,2005,16(11):5304–15.)。lncRNA-NEAT1与肿瘤的关系也有报道,如缺氧诱导因子2(HIF-2)通过增强lncRNA-NEAT1的转录从而促进乳腺癌细胞的存活(参见文献Choudhry H,et al.Tumor hypoxia induces nuclear paraspeckleformation through HIF-2αdependent transcriptional activation of NEAT1leadingto cancer cell survival.Oncogene,2014:1-9)。此外,lncRNA-NEAT1作为雌激素受体的靶基因与前列腺癌的进展密切相关(参见文献Chakravarty D,et al.The oestrogenreceptor alpha-regulated lncRNA NEAT1is a critical modulator of prostatecancer.Nature communications,2014,5:1-16)。这些研究提示了lncRNA-NEAT1在肿瘤发生发展中的作用。
近些年来,血清学标志物的筛选鉴定和在疾病诊断中的应用一直是医学领域的研究热点。非编码RNA作为血清学诊断标志物的研究取得了很大进展,例如已有多种microRNA被发现可以用于疾病的诊断。但是,lncRNA在血清学诊断标志物中的应用研究还非常少。以肝癌为例,目前肝癌诊断标志物主要是甲胎蛋白(AFP),但有相当一部分肝癌病人(30~40%)AFP检测结果呈阴性。目前尚缺乏其他血清学检测方法可以用来发现这部分病人,使其失去了诊断和治疗的机会。因此,寻找和发现新的血清学标志分子弥补AFP临床诊断的不足以提高肝癌的诊断水平,是肝癌防治研究的重要内容。
Panzitt K等人应用PCR的方法首次在肝癌患者的血清中检测到了lncRNA-HULC,提出其可能是一个肝癌诊断及预后判断的血清学标志物(参见文献Panzitt K,etal.Characterization of HULC,a novel gene with striking up-regulation inhepatocellular carcinoma,as noncoding RNA.Gastroenterology,2007,132(1):330-42)。
lncRNA-NEAT1作为肿瘤血清学诊断标志物的价值至今尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA NEAT1(lncRNA-NEAT1)的新用途,具体是lncRNA-NEAT1作为肝癌血清学诊断标志物的应用,以及在制备肝癌血清学诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒,及其该试剂盒在肝癌血清学诊断中的应用。
在前期的研究中,本发明人所在的国际生物信号转导研究中心利用lncRNA芯片筛选了与肝癌干细胞相关的lncRNA,结果发现lncRNA-NEAT1在肝癌干细胞中高表达并可以调节肝癌干细胞的功能。目前认为肿瘤来源于肿瘤干细胞,因此这些结果提示lncRNA-NEAT1在包括肝癌等恶性肿瘤发生的早期即可能有作用,也提示了其在肿瘤诊断标志物方面可能具有一定的应用价值。
进一步地,本发明人建立了人血清中lncRNA-NEAT1的检测方法和提供了血清中lncRNA-NEAT1检测的试剂盒,通过对肝癌病人血清的检测,我们首先发现在血清中能够检测到lncRNA-NEAT1,并且12例HCC病人血清中有2例lncRNA-NEAT1含量明显高于正常人,其中1例AFP<400ug/L,提示lncRNA-NEAT1可以作为肝癌血清学诊断标志物,并且作为AFP肝癌诊断的补充,也提示lncRNA-NEAT1在肿瘤血清学诊断中的应用前景。
因此,我们认为,lncRNA-NEAT1具备作为肝癌诊断血清学标志物的可能性。
本发明的第一方面,提供了一种长链非编码RNA NEAT1(lncRNA-NEAT1)在制备肝癌诊断标志物中的应用。
本发明的第二方面,提供了lncRNA-NEAT1在制备诊断肝癌的检测试剂或试剂盒中的应用。
特别是,lncRNA-NEAT1在制备诊断肝癌的血清学检测试剂或试剂盒中的应用。
所述的检测试剂或试剂盒,是通过逆转录、实时定量PCR技术等方法检测生物样品中lncRNA-NEAT1的表达量。
所述的检测试剂或试剂盒,包括:对lncRNA-NEAT1具有检测特异性的探针、基因芯片,或PCR引物等。
所述的生物样品选自:获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液等。
所述的生物样品,优选为血清。
所述的检测试剂或试剂盒,优选为通过定量实时PCR技术检测血清中lncRNA-NEAT1的表达量。
所述的对lncRNA-NEAT1具有检测特异性的PCR引物如下:
上游引物为:GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQ ID NO:15);
下游引物为:CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT(SEQ ID NO:16);
本发明的第三方面,提供了一种检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒。
本发明提供的一种检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒,该试剂盒的组成包括:
1.逆转录系统
由逆转录体系缓冲液、随机引物N6、dNTPs、逆转录酶和RNA酶抑制剂组成;
2.引物系统
由1对Real-time PCR的上、下游引物组成,引物序列如下:
上游引物为:GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQ ID NO:15);
下游引物为:CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT(SEQ ID NO:16);
引物由上下游引物等量混合至5μM。
3.扩增系统
由SYBR Premix Ex TaqTM试剂组成。
本发明的第四方面,提供了上述用于检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒的检测方法,具体步骤如下:
按常规方法抽血并取血清,富集血清中的小RNA;
由逆转录系统将RNA逆转录成cDNA;
用扩增系统进行Real-time PCR扩增,测定lncRNA-NEAT1的含量。
本发明的第五方面,提供了上述的检测血清中lncRNA-NEAT1的试剂盒在制备诊断肝癌的检测试剂盒中的应用。
本发明所述的肝癌为原发性肝细胞癌等。
本发明的lncRNA-NEAT1可以作为肝癌诊断血清学标志物,本发明为诊断肝癌提供了新临床手段。
附图说明
图1为10个lncRNA在肝癌干细胞中的表达检测;
图2为8对引物检测lncRNA-NEAT1在血清中的表达量;
图3为正常人与肝癌病人血清中lncRNA-NEAT1的表达检测。
具体实施方式
现结合实施例和附图,对本发明作详细描述,但本发明的实施不仅限于此。
实施例1:lncRNA-NEAT1的筛选、鉴定
前期我们利用高通量的lncRNA芯片筛选了与肝癌干细胞相关的lncRNA,从筛到的lncRNA中选出了变化最显著的10个lncRNA,然后对其从Huh7肝癌细胞中富集的肝癌干细胞中的表达进行PCR验证,结果发现lncRNA-NEAT1在肝癌干细胞中表达最高(见图1)。
目前认为肿瘤来源于肿瘤干细胞,因此这些结果提示lncRNA-NEAT1在包括肝癌等恶性肿瘤发生的早期即可能有作用,也提示了其在肿瘤诊断标志物方面可能具有一定的应用价值。
实施例2:血清样本的采集、处理及提取其中的小RNA
(1)血清样本收集:收集约4ml肝细胞癌病人术前的外周血放入含EDTA的抗凝管中,静置约1小时。
(2)血清样本处理:采集的外周血样品4000rpm 4℃离心10min,取上清分装于EP管中,-80℃保存。
(3)提取血清中小RNA:每个血清样品均取350μl,按照从Ambion公司购买的mirVanaTMPARISTMKit提取小RNA。
(4)逆转录成cDNA:每个样品取相同量RNA,用随机引物N6进行逆转录。按照5×M-MLV RT Buffer 5μl、M-MLV Reverse transcriptase1μl、rRNasin0.5μl(Promega公司)、dNTPs1μl、随机引物N61μl、提取的小RNA 15ul、DEPC水(补充H2O使总体积达到25μl)进行逆转录。以上步骤所用的tip头、EP管均经过RNA酶灭活处理。
实施例3:引物设计与筛选
(1)引物设计:利用NCBI查得lncRNA-NEAT1的全长序列(NR_028272.1),针对lncRNA-NEAT1的序列利用Primer Premier 5软件设计Real-time PCR的上下游引物8对(如表1所示),由invitrogen公司负责引物合成。
表1:用于检测血清中lncRNA-NEAT1设计的8对引物
(2)引物筛选:采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂和美国AppliedBiosystems公司的ViiA7Dx实时定量PCR仪,按照下述体系进行PCR反应:
PCR条件:
按照上述Real-time PCR条件,利用3例前期制备的血清样本逆转录产物对8对lncRNA-NEAT1引物进行检测。每个样本均做2个复孔,取其平均值分析。
结果8对引物均能检测出信号,且溶解曲线为单峰,其中第8对引物扩增的片段的表达量明显高于其它引物(见图2),将PCR产物送公司测序,测序结果经比对确实为lncRNA-NEAT1。
因此,本发明经过筛选提供了最优化的1对用于检测血清中lncRNA-NEAT1的Real-time PCR引物,序列如下:
上游引物为:GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQ ID NO:15);
下游引物为:CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT(SEQ ID NO:16);
实施例4:正常人与肝癌病人血清中lncRNA-NEAT1的差异表达检测
按照实施例2、3相同的方法,用筛选出的引物对12例正常人血清与10例肝癌病人术前血清中的lncRNA-NEAT1进行检测,结果发现与12例正常人相比,10例肝癌病人有2例病人的血清lncRNA-NEAT1含量明显升高(见图3),而且其中1例病人AFP<80ug/L。
这一结果提示:lncRNA-NEAT1可作为肝癌血清学诊断标志物使用;lncRNA-NEAT1可能成为AFP在肝癌诊断方面必要和有益的补充。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (4)
1.检测lncRNA-NEAT1表达量的试剂在制备诊断肝癌的血清学检测试剂或检测试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的检测lncRNA-NEAT1表达量的试剂在制备诊断肝癌的血清学检测试剂或检测试剂盒中的应用,其特征在于,所述的检测lncRNA-NEAT1表达量的试剂为:对lncRNA-NEAT1具有检测特异性的探针、基因芯片,或PCR引物。
3.根据权利要求2所述的检测lncRNA-NEAT1表达量的试剂在制备诊断肝癌的血清学检测试剂或检测试剂盒中的应用,其特征在于,所述的对lncRNA-NEAT1具有检测特异性的PCR引物如下:
上游引物为:GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQ ID NO:15);
下游引物为:CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT(SEQ ID NO:16)。
4.根据权利要求1所述的检测lncRNA-NEAT1表达量的试剂在制备诊断肝癌的血清学检测试剂或检测试剂盒中的应用,其特征在于,所述的检测试剂或检测试剂盒包括:
A、逆转录系统,由逆转录体系缓冲液、随机引物N6、dNTPs、逆转录酶和RNA酶抑制剂组成;
B、引物系统,由1对Real-time PCR的上、下游引物组成,引物序列如下:
上游引物为:GGGTGGTCTGAGGAGTGATG(SEQ ID NO:15);
下游引物为:CCTGGAAAATAAAGCGTTGGT(SEQ ID NO:16);
C、扩增系统,由SYBR Premix Ex TaqTM试剂组成。
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