CN113564261B - 与肝细胞癌相关的lncRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于肝癌患者预后预测及肝癌患者治疗的lncRNA。前期通过对肝癌中差异表达的lncRNA进行分析，发明人发现lncRNA‑BF368575在肝癌组织和部分肝癌细胞系中高表达，其高表达与肝癌患者较短的DFS密切相关，lncRNA‑BF368575表达越低预后越好，其表达水平与肝癌患者的预后明显相关，可用于预测肝癌预后。功能实验显示lncRNA‑BF368575可通过直接与PI3K/AKT/mTOR信号通路磷酸化蛋白结合促进肝癌生长，其促癌作用可以被LY294002逆转，因此lncRNA‑BF368575可作为治疗肝癌的一个新靶点。

Description

与肝细胞癌相关的lncRNA及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤领域，具体涉及与肝细胞癌相关的lncRNA及其应用。
背景技术
肝癌是全球性的重大公共卫生问题，是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全球恶性肿瘤发病率的第五位，死亡率高居第四位，且发病率逐年上升，2021年肝癌新增病例已经超过90万，到2025年预计每年新增病例数将超过100万，每年可导致83万名患者死亡。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌，约占原发性肝癌的90%，下文中的肝癌均指肝细胞癌。HCC的危险因素包括长期饮酒、糖尿病或肥胖相关的非酒精性脂肪肝（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、HBV或HCV感染、黄曲霉毒素B1摄入、遗传性血色病等。虽然肝癌临床早期诊断和治疗有了很大提高，但因肝癌复发率高，患者的5年生存率仍偏低。因此迫切需要研究肝癌发生、发展的潜在分子机制，以便肝癌的诊断和治疗。
发明人目前的研究发现，多种lncRNA在肝癌患者中表达异常，这些异常表达的lncRNA参与肝癌的发生、发展、复发及转移，因此这类lncRNA能够作为HCC诊断、治疗的潜在生物标志物。HULC是第一个被发现的，在肝癌组织中异常高表达的lncRNA。与正常组织相比，HULC在肝癌组织和肝结肠转移瘤中明显高表达，且HULC与肿瘤组织学分级和HBV感染程度呈正相关。对患者血浆样本进行分析，发现HULC在肝癌患者血浆中显著高表达。HULC可以被cAMP、CREB和IGF2等调节，从而促进肝癌细胞增殖、转移，体内实验也证实HULC能够促进裸鼠皮下移植瘤的生长。
正常情况下，H19在胚胎发育期具有较高的表达丰度，而在成人肝脏中的表达量微乎其微。但是在肝组织再生和肝癌发生过程中，H19被重新活化，表达明显升高。深入研究表明，在肝癌中，H19有3个比较明显的甲基化表达位点，高甲基化与肝癌密切相关。基于上述H19的表达特性，有研究将H19纳为肝癌的特定治疗靶点。
MEG3在各类正常组织中均有表达，但是在某些肿瘤中，其表达会明显降低。在肝癌中，MEG3均存在不同程度的甲基化，进一步实验表明，MEG3的表达量降低的程度与甲基化程度呈正相关。而高甲基化的MEG3可以通过miR-29，调节肝癌的增殖。PTEN及同源的PTENP1，能够负向调控PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而抑制肿瘤的发生发展。但是，在肝癌中，PTEN及同源的PTENP1的表达量明显降低。在肝癌细胞中，过表达PTENP1能显著抑制细胞的增殖、迁移、侵袭及远处转移。
XIST和FTX在肝癌组织中的表达明显低于正常肝组织。XIST能够通过抑制miR-92b的表达，从而抑制HCC的增殖和转移。FTX是XIST的调节因素，功能与XIST类似，能作用于Wnt/β-catenin信号通路，减少EMT的表达，并与MCM2的复制起始段结合，影响MCM2的表达。XIST和FTX单独分析，与肝癌临床特征关联不大，但二者结合分析，能够较好地判断肝癌患者的预后，因此两者联合运用可能成为肝癌的潜在预后评估标志物。
上述异常表达的lncRNA参与肝癌的发生发展，但其具体分子机制并未完全发掘，因此它们作为肝癌诊断标志物或治疗靶点的可靠性有待进一步验证。LncRNA应用于临床，应该具有方便、低成本等特点，但上述lncRNA的检测很多包含多个蛋白分子，或DNA双链甲基化、转录起始位点等的检测，大部分医疗机构并不具备相关检测能力，且检测成本较为昂贵，因此其推广应用价值有限，也未能对肝癌患者分级及预后进行确切诊断。因此迫切需要寻找新型分子标记物，以提高肝癌诊断的灵敏性和预后判断的准确性，明确其在肝癌患者中的临床价值，这对于提高肝癌患者的生存率具有重大的临床意义。
LncRNA-BF368575是人们发现的众多lncRNA中的一条，有关其功能报导罕见，CN107460234A公开了由48个lncRNA组成的分子标签，可以高准确性地区分正常、慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌四个人群。lncRNA-BF368575是48个lncRNA组成的分子标签中的一条，其变化倍数(患者/HC)为7.7倍，处于中游，未有数据显示其单独具有何种效用。
发明内容
本发明的目的在于提供基于lncRNA-BF368575的新应用。
本发明所采取的技术方案是：
发明人通过lncRNA表达谱芯片筛选出BF368575，通过qRT-PCR技术检测了16对肝癌临床组织样本及相应的正常肝组织中lncRNA-BF368575的表达情况，结果显示lncRNA-BF368575在肝癌组织中的表达水平高于正常组织。后又通过人肝癌组织芯片（HLivH180Su15）对lncRNA-BF368575表达进行验证，证实lncRNA-BF368575不仅在肝癌组织中高表达，且其表达量与肝癌患者的病理分级呈正相关。进一步分析lncRNA-BF368575与患者生存期，发现lncRNA-BF368575高表达患者的无疾病生存期（DFS）明显短于低表达患者，单因素分析表明lncRNA-BF368575与肝癌患者总生存期（OS）和无疾病生存期（DFS）密切相关，提示lncRNA-BF368575可能是肝癌发生发展中的重要调控因子。
接着，发明人对lncRNA-BF368575进行了体外细胞功能学的研究，进一步的实验研究表明，与对照组细胞株相比，高表达lncRNA-BF368575的肝癌细胞株具有更强的增殖能力。沉默内源性lncRNA-BF368575表达后，MHCC97H和SNU-423肝癌细胞株增殖能力减弱，过表达lncRNA-BF368575后，HepG2和BEL7402肝癌细胞株增殖能力明显增强。体内实验证实，过表达lncRNA-BF368575能有效促进裸鼠皮下成瘤。由此可见，lncRNA-BF368575在肝癌中起着促进肿瘤发生发展的作用。进一步的机制研究表明，lncRNA-BF368575可能通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路关键蛋白的磷酸化水平，激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，进而促进肝癌细胞增殖。而lncRNA-BF368575的促癌作用可以被靶向药物LY294002抑制，这表明lncRNA-BF368575可以作为肿瘤抑制剂等相关药物的作用靶点。RNA结合蛋白免疫共沉淀实验（RIP）证实lncRNA-BF368575可与p-mTOR（Ser2448）、p-AKT（Thr308）和p-4E-BP1（Thr37/46）直接结合，从而抑制磷酸化蛋白降解。
本发明的第一个方面，提供：
lncRNA-BF368575表达量的定量试剂在制备肝细胞癌预后检测试剂中的应用。
在一些实例中，所述定量试剂选自高通量lncRNA芯片、组织芯片或PCR试剂。
在一些实例中，lncRNA-BF368575表达量显著升高时，判定为肝细胞癌治疗后复发。
在一些实例中，所述定量试剂检测的样本为患者血清和/或组织。
本发明的第二个方面，提供：
一种肝细胞癌预后分析系统，包括：
lncRNA表达量检测装置，用于检测样本中lncRNA-BF368575的表达量；
预后分析装置，基于lncRNA-BF368575的表达量，确定肝细胞癌预后；
结果输出装置，用于输出预后分析装置分析得到的结果。
在一些肝细胞癌预后分析系统的实例中，所述lncRNA表达量检测装置选自高通量lncRNA芯片、组织芯片或PCR试剂。
在一些肝细胞癌预后分析系统的实例中，lncRNA-BF368575表达量显著升高时，判定为肝细胞癌治疗后复发。
在一些肝细胞癌预后分析系统的实例中，所述lncRNA表达量检测装置分析的样本为患者血清和/或组织。
本发明的第三个方面，提供：
抑制lncRNA-BF368575表达的试剂在制备肝细胞癌治疗药物中的应用。
在一些实例中，所述试剂选自针对lncRNA-BF368575的miRNA、siRNA或shRNA、lncRNA-BF368575启动子抑制剂。
本发明的有益效果是：
本发明通过lncRNA表达谱芯片筛选出BF368575，并检测肝癌组织中lncRNA-BF368575表达情况，发现肝癌组织中lncRNA-BF368575高表达，且lncRNA-BF368575的表达水平与肝癌患者的预后明显相关。本发明的一些实例，通过检测肝癌患者lncRNA-BF368575的表达量，可以有效预测肝癌患者的预后，明确患者肝癌复发的风险，可以更好地进行个性化用药，提高患者的生存质量。
本发明对lncRNA-BF368575进行细胞功能学的研究，发现高表达lncRNA-BF368575的肝癌细胞具有更强的增殖能力，而沉默内源性lncRNA-BF368575表达后，肝癌细胞增殖能力减弱。本发明的一些实例，通过抑制lncRNA-BF368575的表达，有望辅助肝癌的治疗。
附图说明
图1是lncRNA-BF368575在肝癌组织和肝癌细胞中的表达量；
图2是lncRNA-BF368575表达量及与预后相关的结果；
图3、4、5、6是lncRNA-BF368575促进肝癌细胞增殖的结果；
图7是lncRNA-BF368575促进裸鼠皮下成瘤的结果；
图8、9是lncRNA-BF368575正向调节PI3K/AKT/mTOR信号通路；
图10 是LY294002能部分逆转lncRNA-BF368575的促癌作用；
图11是lncRNA-BF368575能与p-mTOR（Ser2448）、p-AKT（Thr308）和p-4E-BP1（Thr37/46）相互结合。
具体实施方式
下面结合实验数据，进一步说明本发明的技术方案。
研究表明lncRNA-BF368575在肝癌组织和大部分肝癌细胞系中高表达：
首先，采用qRT-PCR检测了16对肝癌临床组织样本和相应的正常肝组织中lncRNA-BF368575的表达情况，结果显示肝癌组织中lncRNA-BF368575的表达水平高于正常组织（图1A）。qRT-PCR检测4株肝癌细胞和1株正常肝细胞系，发现lncRNA-BF368575在MHCC97H、SNU-423、HepG2高表达（图1B）。
由于lncRNA的生物学功能与其细胞内定位密切相关，因此发明人对HepG2细胞进行核质RNA分离后，逆转录成cDNA，并进行qPCR及DNA凝胶电泳，结果显示lncRNA-BF368575在细胞质中明显高表达（图1C和1D）。上述实验表明，lncRNA-BF368575在肝癌组织和大部分肝癌细胞系中高表达，且lncRNA-BF368575在肝癌细胞细胞质中的表达量明显高于其在细胞核中的表达量。
研究表明lncRNA-BF368575表达水平与肝癌的发展相关：
为了探讨lncRNA-BF368575在HCC中的临床意义，发明人从芯超生物技术公司获得了人肝癌组织芯片（HLivH180Su15）。对上述获得的人肝癌组织芯片进行原位杂交，结果显示lncRNA-BF368575在肝癌组织与癌旁组织的表达存在显著差异（表2、图2A和2B）。
接下来发明人分析了lncRNA-BF368575表达水平与肝癌患者临床病理特征的相关性（表1），结果显示lncRNA-BF368575表达水平与肿瘤分级密切相关。
肿瘤分级是判断肝癌预后的重要标志，生存分析结果提示低表达lncRNA-BF368575是患者无疾病生存期（DFS）的有利预后因素（图2C和2D）。
从lncRNA-BF368575对肝癌患者总生存期影响的单因素和多因素分析看，lncRNA-BF368575的表达量与肝癌患者的总生存期并未存在明显相关性（表3）。
上述实验及分析表明，lncRNA-BF368575在肝癌组织中显著高表达，高表达lncRNA-BF368575严重影响了肝癌患者的无病生存期，且与肝癌病理分级较高密切相关。
表1、lncRNA-BF368575与肝癌患者临床病理特征的关系
Figure 768414DEST_PATH_IMAGE001
Figure 747871DEST_PATH_IMAGE002
*统计学显著(p<0.05)。
表2、 lncRNA-BF368575在肝癌组织和癌旁组织的表达量
Figure 527608DEST_PATH_IMAGE003
表3、 lncRNA-BF368575对肝癌患者总生存期影响的单因素和多因素分析
Figure 486599DEST_PATH_IMAGE004
*统计学显著(p<0.05)。
研究表明lncRNA-BF368575在HCC中促进肝癌细胞增殖：
鉴于lncRNA-BF368575在肝癌组织中高表达，并与肝癌患者预后密切相关。为研究lncRNA-BF368575在肝癌发生发展中的作用，发明人构建了lncRNA-BF368575稳定过表达和敲降细胞株。在HepG2和BEL-7402细胞中稳定过表达lncRNA-BF368575，在SNU-423和MHCC97H稳定敲降lncRNA-BF368575。构建完成后，提取肝癌细胞RNA，并用qRT-PCR进行检测，发现lncRNA-BF368575在HepG2和BEL-7402的稳定过表达（图3A），以及在SNU-423和MHCC97H的稳定敲降（图3B），均符合预期，表明lncRNA-BF368575稳定过表达和敲降细胞株构建成功。
过表达或敲降lncRNA-BF368575后，用CCK-8试剂对4株肝癌细胞的增殖能力进行检测，发现过表达lncRNA-BF368575能显著促进肝癌细胞的增殖，而敲降lncRNA-BF368575则抑制肝癌细胞的增殖（图4）。
为进一步验证lncRNA-BF368575对肝癌细胞增殖的影响，对稳定过表达和敲降lncRNA-BF368575的肝癌细胞株进行平板克隆实验。实验结果表明过表达lncRNA-BF368575能显著促进肝癌细胞的克隆形成能力（图5），而敲降lncRNA-BF368575则显著抑制肝癌细胞的克隆形成能力（图6）。
上述实验结果表明，过表达lncRNA-BF368575可促进肝癌细胞的增殖，而抑制lncRNA-BF368575则发挥抑制肝癌细胞增殖的作用。
研究表明lncRNA-BF368575在裸鼠皮下成瘤模型中促进肝癌细胞的肿瘤形成：
为进一步确定lncRNA-BF368575在体内是否也具有促进肝癌细胞增殖的作用，发明人将lncRNA-BF368575高表达的HepG2细胞注射到裸鼠皮下，并设置对照组。
与对照组相比，lncRNA-BF368575过表达组可以显著促进裸鼠皮下肿瘤的生长，肿瘤出现的时间较对照组提前了近一周（图7B）。过表达lncRNA-BF368575的HepG2细胞，裸鼠皮下肿瘤体积明显较大（图7A和B），肿瘤重量显著增加（图7C）。从裸鼠肿瘤组织中提取RNA，并进行qRT-PCR检测，发现裸鼠肿瘤组织中lncRNA-BF368575表达显著上升（图7D），表明裸鼠皮下成瘤源于稳定过表达lncRNA-BF368575的HepG2细胞，且在成瘤过程中，lncRNA-BF368575一直发挥作用。
上述实验结果说明，lncRNA-BF368575过表达能有效促进裸鼠皮下成瘤。
研究表明lncRNA-BF368575通过正向调控PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肝癌细胞生长：
为探究lncRNA-BF368575促进肝癌发生发展的分子机制，对稳定过表达lncRNA-BF368575的HepG2和BEL-7402细胞以及稳定敲降lncRNA-BF368575的SNU-423和MHCC97H细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号通路的关键蛋白PI3K、p-PI3K（Tyr607）、AKT、p-AKT（Thr308）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）、4E-BP1、p-4E-BP1（Thr37/46）、S6和p-S6（Ser235/236）进行蛋白印迹检测，并计算灰度值，进行统计学分析。
结果显示在过表达lncRNA-BF368575的HepG2和BEL-7402肝癌细胞中，PI3K/AKT/mTOR信号通路的关键蛋白的总量并未发生明显改变，但关键蛋白的磷酸化水平显著升高（图8A、图9A和B）；而在敲降lncRNA-BF368575的SNU-423和MHCC97H细胞中，PI3K/AKT/mTOR信号通路的关键蛋白的总量也未发生明显改变，但关键蛋白的磷酸化水平显著降低（图8B、图9C和D）。
上述实验结果表明，lncRNA-BF368575可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肝癌细胞的增殖。
研究表明LY294002能逆转lncRNA-BF368575的促癌作用：
在稳定过表达lncRNA-BF368575的HepG2和BEL-7402细胞中，加入一定浓度的LY294002，能逆转过表达lncRNA-BF368575导致的细胞增殖能力增强(图10A)。采用软琼脂成球实验，对LY294002拮抗lncRNA-BF368575的作用进行进一步验证。
结果显示LY294002可以逆转lncRNA-BF368575对肝癌细胞HepG2和BEL-7402的促生长作用（图10B）。蛋白印迹检测结果显示LY294002能够逆转过表达lncRNA-BF368575导致的PI3K/AKT/mTOR信号通路关键蛋白的磷酸化，尤其是p-PI3K（Tyr607）、p-AKT（Thr308）和p-S6（Ser235/236）这三个蛋白的磷酸化（图10C）。
上述实验结果表明，LY294002能逆转lncRNA-BF368575在肝癌细胞中的促癌作用。
研究表明lncRNA-BF368575通过直接与PI3K/AKT/mTOR信号通路磷酸化蛋白结合，发挥促癌作用：
上述实验结果表明，lncRNA-BF368575可以影响PI3K/AKT/mTOR信号通路的关键蛋白的磷酸化水平，为了进一步探究两者之间的具体作用机制，发明人进行了RNA结合蛋白免疫共沉淀实验（RIP）。采用p-mTOR（Ser2448）、p-AKT（Thr308）和p-4E-BP1（Thr37/46）对RNA进行沉淀，逆转录扩增后对DNA进行凝胶电泳检测。电泳结果发现，p-mTOR（Ser2448）、p-AKT（Thr308）和p-4E-BP1（Thr37/46）均能从细胞裂解产物中结合lncRNA-BF368575，其中p-AKT（Thr308）和p-4E-BP1（Thr37/46）结合的lncRNA-BF368575最多（图11）。探究lncRNA-BF368575与p-mTOR（Ser2448）、p-AKT（Thr308）和p-4E-BP1（Thr37/46）相互结合的方式，明确lncRNA-BF368575对下游蛋白的影响，能进一步阐明lncRNA-BF368575发挥促癌作用的分子机制，为肝癌的防治提供新的方向。
总结：
综上所述，发明人的研究发现了一个新的lncRNA-BF368575，它在肝癌组织和大部分肝癌细胞系中高表达，高表达lncRNA-BF368575与肝癌患者较短的DFS密切相关，lncRNA-BF368575表达越低预后越好。功能实验显示lncRNA-BF368575在体内外均能促进肝癌细胞的增殖。机制上lncRNA-BF368575可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥促癌作用。鉴于lncRNA-BF368575的表达水平与肝癌患者的预后明显相关，因此lncRNA-BF368575可用于预测肝癌预后。鉴于lncRNA-BF368575可通过直接与PI3K/AKT/mTOR信号通路磷酸化蛋白结合促进肝癌生长，且其促癌作用可以被LY294002逆转，因此lncRNA-BF368575可作为治疗肝癌的一个新的治疗靶点。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
参考文献：
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Claims (4)

1.检测lncRNA BF368575表达量的定量试剂在制备肝细胞癌预后检测试剂中的应用，所述定量试剂检测的样本为患者肝癌组织。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述定量试剂选自高通量lncRNA芯片、组织芯片或PCR试剂。
3.一种肝细胞癌预后分析系统，包括：
lncRNA表达量检测装置，用于检测样本中lncRNA BF368575的表达量；所述样本为患者肝癌组织；
预后分析装置，基于lncRNA BF368575的表达量，确定肝细胞癌预后；
结果输出装置，用于输出预后分析装置分析得到的结果。
4.根据权利要求3所述的肝细胞癌预后分析系统，其特征在于：所述lncRNA表达量检测装置选自高通量lncRNA芯片、组织芯片或PCR试剂。
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