CN101880707A - microRNA-21在鉴别胰腺癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学分子生物学技术领域，是一种将血中的microRNA作为标志物，鉴别胰腺癌的方法。本发明通过大样本调查检测，制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱，再将未知血浆标本中的microRNA-21表达丰度值ΔCt，对照上述MicroRNA-21的表达量标准图谱，如果落入胰腺癌组microRNA的范围内，则将其归为胰腺癌，如果落入慢性胰腺炎或正常人组的的范围内，则基本排除胰腺癌。本发明方法具有检测方便、准确率高等特点。

Description

microRNA-21在鉴别胰腺癌中的应用

技术领域

本发明涉及医学分子生物学技术领域，是一种将血中的microRNA作为标志物，鉴别胰腺癌的方法。

背景技术

microRNA最早发现于1993年，是一种小的、非编码蛋白质的单链RNA，由18～25个核苷酸组成。microRNA通过与mRNA3’非翻译区(3’UTR)结合，使得靶mRNA降解或抑制其翻译，实现其生物学功能。经过20多年艰苦卓绝的努力，科学家对microRNA研究取得了突破性进展，发现其在动物、植物和病毒中普遍存在，且在许多生命活动中起着非常重要的作用。根据最新的microRNA数据库统计(miRBase Registry 13.0)，人体已经发现了706种microRNA。microRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性。

近来研究表明，某些microRNA在细胞的分化发育中起着重要的作用，提示其与肿瘤的发生密切相关。通过特定的分子生物学技术(包括：Northern印记杂交、实时定量PCR，上调或下调特定microRNA的表达等)，人们发现microRNA表达量的变化与很多肿瘤密切相关，如：肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、白血病等。功能学研究显示：microRNA可能与癌基因或抑癌基因起着同样的作用。超过50％的microRNA基因位于肿瘤相关的基因组区域或者不稳定区域，这种现象提示，microRNA在部分肿瘤的发生过程中起着重要的作用。

胰腺癌为消化道常见肿瘤，居全身恶性肿瘤第7位，其侵袭性强，恶性度高，手术切除率低，预后极差，死亡率接近100％。且其起病隐匿，缺乏典型临床症状，早期诊断难度极大，成为目前国内外肿瘤专家的研究热点。有报道：同正常组织及慢性胰腺炎组织相比，microRNA在胰腺癌组织中的表达谱有显著变化(Bloomston M，Frankel WL，Petrocca F，Volinia S，Alder H，Hagan JP，Liu CG，Bhatt D，Taccioli C，Croce CM.2007May 2；297(17)：1901-8.LeeEJ，Gusev Y，Jiang J，Nuovo GJ，Lerner MR，Frankel WL，Morgan DL，PostierRG，Brackett DJ，Schmittgen TD.Int J Cancer.2007Mar1；120(5)：1046-54.)但目前临床上胰腺组织标本的获取较为困难，如超声内镜引导下穿刺、CT引导下穿刺等方法获取胰腺组织标本成功率低，费用高，痛苦大，并发症多，患者耐受性差。近来有多篇文章报道，病变组织中mi croRNA的异常变化可以在血清中有所反映。(Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，Fritz BR，Wyman SK，Pogosova-Agadjanyan EL，Peterson A，Noteboom J，O′Briant KC，Allen A，Lin DW，Urban N，Drescher CW，Knudsen BS，Stirewalt DL，Gentleman R，Vessella RL，Nelson PS，Martin DB，Tewari M.Proc Natl Acad Sci USA.2008 Jul 29；105(30)：10513-8.Wang K，Zhang S，Marzolf B，Troisch P，Brightman A，Hu Z，Hood LE，Galas DJ.Proc Natl Acad Sci USA.2009Mar 17；106(11)：4402-7.)。利用检测血清中的microRNA表达水平，是一种没有创伤、价格低廉的方法，患者容易接受，但至今未见有关利用检测血清中的microRNA-21表达水平来鉴别胰腺癌的报道。

发明内容

胰腺癌往往是在慢性胰腺炎基础上发生的，本发明提供一种通过检测血清中microRNA-21的表达水平鉴别胰腺癌、慢性胰腺炎或正常胰腺的方法。

本发明方法如下：

1.通过大样本检测，制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱：

1)制备总RNA：

取胰腺癌患者、慢性胰腺炎患者和正常人血液样本各若干例，将各例血液样本分别进行离心，取血浆，将人工合成的microRNA(Cel-miR-39)分别加入各血浆作为参照物，用美国Molecular Research Center公司的TRI REAGENT BD(cat.no.TB 126)按常规抽提总RNA，并检测各例胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人样本中的总RNA浓度。

2)microRNA-21表达丰度的测定：

使用Applied Biosys tems公司的microRNA检测试剂盒(TaqMan MicroRNAAssay，P/N：4373090)，以及荧光实时定量PCR技术，分别检测胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中mi croRNA-21的表达丰度值(Ct值)，用Ct 21表示。并用同样的方法测得加入的参照物Cel-miR-39的Ct值Ct 39。

3)制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱：

将各例所得Ct 39值减去Ct 21值，即得标准化后的表达丰度值(ΔCt)。用胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人microRNA-21各组分别得到的表达丰度值ΔCt，制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱。

2.鉴别胰腺癌、慢性胰腺炎及正常胰腺的方法：

按以上方法检测未知血浆标本中的microRNA-21表达丰度值ΔCt，对照上述MicroRNA-21的表达量标准图谱，如果落入胰腺癌组microRNA-21的范围内，则将其归为胰腺癌，如果落入慢性胰腺炎或正常胰腺组的的范围内，则基本排除胰腺癌。

本发明方法具有检测方便、敏感性好、准确率高等特点。

附图说明

图1为胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱

图2为实施例1的诊断试验评价图，图中，胰腺癌血浆中MicroRNA-21表达水平列为一组，慢性胰腺炎及正常人MicroRNA-21表达水平列为一组。

具体实施方式

现结合附图和实施例，对本发明作详细描述。

实施例1制作胰腺癌、慢性胰腺炎及正常人血浆中MicroRNA-21的表达量标准图谱

1.血浆采集：

选取31例胰腺癌、14例慢性胰腺炎及10例正常人个体，每例取1ml全血，在2小时内分别于常温下依次进行1200g×10分钟，15000g ×10分钟离心，取血浆。

2.血浆中RNA抽提：

每例个体取50μl血浆，加入750μl TRI REAGENT BD(Molecular Research Center公司)和20μl 5N醋酸，混匀后加入5μl浓度为50pmol/L的Cel-miR-39，震荡混匀，室温下静置5分钟，加入200μl氯仿，震荡混匀，室温下静置5分钟，4℃，12000g离心15min，提取上清液，加入4μl DNA mate(TAKARA公司)，后加入与上清液等体积的异丙醇混匀，-20℃静置20min，4℃，12000g离心15min，去上清，向沉淀中加入1ml75％乙醇清洗沉淀，4℃，7500g离心洗涤沉淀5min。去上清，将沉淀室温晾干后加入40μlRNa se-free的水充分溶解，测定所得RNA的浓度。

3.RT-PCR反应：

使用Applied Biosystems公司的Taqman microRNA反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录反应。15μl反应体系中包括2μl提取的RNA，0.15μl的dNTPs(0.25mM)，1μl的反转录酶(3.33U/μl，P/N：4319983，AppliedBiosystems)，0.19μl的RNase抑制剂(0.25U/μl，P/N：N8080119；AppliedBiosystems)，1.5μl 10×RT buffer(P/N：4319981，Applied Biosystems)，7.16μl RNase-free水，3μl stem-loop RT primer(50nM)。使用AppliedBiosystems公司9700热循环仪进行16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟的反转录。对反转录产物进行适当稀释后，取5μl作为实时定量PCR的模板，使用Applied Biosystems公司的TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒进行实时定量PCR鉴定。PCR反应在Applied Biosystems 7900HT序列检测系统(P/N：4329002，Applied Biosystems)中进行。PCR反应体系为20μl，包括5μl RT产物，10ul10×

Universal PCR Master Mix(P/N：4324018，Applied Biosystems)，1μl

探针(0.2mM)，4μlRNase-free水。将所有的反应体系首先进行95℃10分钟的预热，然后进行每循环95℃15秒，60℃1分钟，共50循环的PCR反应。所有的反应重复三次，每次取固定的阈值，三次测定中最少的Ct值作为该样本Ct值。

4.实时定量PCR数据的标准化处理：

用上述方法先检测各例样本的MicroRNA-21的Ct值(Ct21)及参照物Cel-miR-39的Ct值(Ct 39)，将所得Ct 39值减去Ct 21值，即得标准化后的表达丰度值(ΔCt)。

5.MicroRNA-21表达丰度值(ΔCt)范围的确定：

通过实时定量PCR获得所有样本microRNA-21的ΔCt值，见表1，

表1.55例样本(胰腺癌、慢性胰腺炎、正常人)MicroRNA-21的ΔCt值

进行方差分析，可见组间差异显著(p＝0.009)，然后使用LSD法进行组间两两比较，可见胰腺癌与慢性胰腺炎，胰腺癌与正常人间差异显著(p值分别为0.034和0.006)，而慢性胰腺炎同正常人间没有差异(p＝0.400)，见图1

初步判定mi croRNA-21可以作为胰腺疾病良恶性的判定。然后进行ROC分析，AUC下面积为0.719，诊断准确度为中等，取诊断界值为ΔCt＝-1.518，其鉴别胰腺疾病良恶性的敏感性为71％，特异性为62.5％，见图2。

Claims (1)

1.MicroRNA-21在鉴别胰腺癌中的应用。

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