CN110699444A - 一种与强直性脊柱炎相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 - Google Patents

一种与强直性脊柱炎相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可用于强直性脊柱炎诊断的血液检测试剂盒，其包括用于扩增miR‑214的引物。此外，本发明还涉及用于扩增miR‑214的引物在制备可用于强直性脊柱炎的诊断的血液检测试剂盒中的用途。

Description

一种与强直性脊柱炎相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和分子诊断领域，尤其涉及可用于强直性脊柱炎的诊断的血液检测试剂盒。此外，本发明还涉及用于扩增miR-214的引物在制备可用于强直性脊柱炎的诊断的血液检测试剂盒中的用途。
背景技术
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种表现为背痛和进行性脊柱强直的中轴骨的慢性炎症性疾病，可累及髋关节、肩关节、周围关节、起止点及指/趾，也可见关节外表现，比如葡萄膜炎。AS给患者和社会都带来相当大负担，严重的脊柱、关节问题使患者劳动力丧失，带来焦虑抑郁等心理学负面影响，对卫生保健资源利用亦产生很大影响。
在不同国家的不同研究中，AS患病率估计值范围为0.7-49例/10,000人。欧洲、亚洲、北美洲、拉丁美洲及非洲的AS平均患病率分别为23.8例/10,000人、16.7例/10,000人、31.9例/10,000人、10.2例/10,000人及7.4例/10,000人。由于疾病负担所致的生活质量下降，以及和AS相关的各种类型的经济损失都由功能丧失和疾病活动所引起，因此早期诊断和早期治疗对防止或减少功能下降以及改善患者预后十分必要。
目前诊断仍沿用1984年修订的纽约标准：符合放射学标准和一项以上临床标准，可诊断为强直性脊柱炎。
1、临床标准：①腰痛、僵3个月以上，活动改善，休息无改善；②腰椎额状面和矢状面活动受限；③胸廓活动度低于相应年龄、性别的正常人。
2、放射学标准(骶髂关节X线)双侧骶髂关节炎≥2级或单侧骶髂关节炎3～4级：①0级：正常；②I级：可疑变化；③Ⅱ级：轻度异常，可见局限性侵蚀、硬化，但无关节间隙的改变；④Ⅲ级：明显异常，为中度或进展性骶髂关节炎，伴有以下1项或1项以上改变(侵蚀、硬化、关节间隙增宽或狭窄，或部分强直)；⑤Ⅳ级：严重异常，完全性关节强直。
该诊断标准确诊患者相对处于疾病比较晚期阶段，之后，临床上将骶髂关节MRI、HLA-B27阳性以及其他典型临床特征(炎性腰背痛、足跟痛(附着点炎)、指(趾)炎、葡萄膜炎、阳性家族史、炎症性肠病、交替性臀区疼痛、银屑病、非对称性关节炎、对NSAID有反应、急性期反应物(ESR或CRP)升高)纳入其诊断考虑范围内，但上述表现大多为患者临床症状，不具有客观性，且急性期反应物不具有特异性，加之目前又缺乏某种特异性单一药物可治愈该疾病，因此亟需发现更加灵敏、特异、易于检测、明确而有效的生物标志物，对强直性脊柱炎作出准确及时的诊断，甚至作为治疗靶点研发新型药物增加其治疗手段。
研究表明，强直性脊柱炎患者血清IL-17水平较正常人明显升高，IL-17的高表达参与AS的炎症反应，并导致AS患者自身免疫功能的紊乱，进而诱导AS的发生发展。
目前的研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNA，这些小分子RNA性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。现有的成熟技术，包括定性、定量miRNA分子检测技术表明利用血清miRNA作为分子标志物的方法比传统的特异蛋白分子检测方法更加有效，为分子标志物开拓了新境界。
目前已经发现了许多与骨发育调控相关的microRNA分子，分别参与间充质干细胞的骨向分化、成骨细胞功能与活性、骨细胞与破骨细胞功能的调节，但是目前还未见血清/血浆中microRNA作为强直性脊柱炎标志物的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何灵敏、特异、易于检测、明确而有效地对强直性脊柱炎作出准确及时的诊断。
发明人在研究中发现，血液中的miR-214(5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’)是强直性脊柱炎发病的特异性生物标志物，从而完成了本发明。
即，本发明包括：
1.一种用于诊断强直性脊柱炎的血液检测试剂盒，其包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
其中，所述miR-214的序列为5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’。
2.根据项1所述的血液检测试剂盒，其中所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214的cDNA的扩增引物。
3.根据项2所述的血液检测试剂盒，其中，所述miR-214的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据项2或3所述的血液检测试剂盒，其中，所述miR-214的cDNA的扩增引物包括：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据项1所述的血液检测试剂盒，所述试剂盒还包括用于从血液中提取miRNA的试剂。
6.根据项1所述的血液检测试剂盒，所述试剂盒还包括反转录和PCR反应所需的酶和/或试剂。
7.根据项6所述的血液检测试剂盒，所述试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPS、MgC12、去核酸酶水、荧光染料、探针和/或Taq酶。
8.根据项1所述的血液检测试剂盒，其中所述血液为血清。
9.用于扩增miR-214的引物在制备用于诊断强直性脊柱炎的血液检测试剂盒中的用途，其中，所述血液检测试剂盒包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
其中，所述miR-214的序列为5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’。
10.根据项9所述的用途，其中所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214的cDNA的扩增引物。
11.根据项10所述的用途，其中，所述miR-214的反转录引物的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
12.根据项10或11所述的用途，其中，所述miR-214的cDNA的扩增引物是：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
13.根据项9所述的用途，所述试剂盒还包括用于从血液中提取miRNA的试剂。
14.根据项9所述的用途，所述试剂盒还包括反转录和PCR反应所需的酶和/或试剂。
15.根据项14所述的用途，所述试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPS、MgC12、去核酸酶水、荧光染料、探针和/或Taq酶。
16.根据项9所述的用途，其中所述血液为血清。
在本说明书中，血液包括血浆、血清和全血，优选为血浆、血清，更优选为血清。
本发明获得了强直性脊柱炎发病特异性的血液miRNA表达的特异性标志物。通过对血液生物标志物和诊断试剂盒的研制与应用，仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其他组织，通过最精简的引物库来检测血清miRNA水平能扩展强直性脊柱炎的检测指标，提高检测的灵敏度，可使得强制性脊柱炎的诊断和治疗更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果的评价奠定基础。
附图说明
图1显示了强直性脊柱炎病人血清中miR-214的水平与血清中IL-17浓度的相关性分析。
图2显示了强直性脊柱炎病人关节液中miR-214的水平与关节液中IL-17浓度的相关性分析。
图3显示了强直性脊柱炎病人组与正常对照组血清中的miR-214水平。
图4显示了强直性脊柱炎病人血清中miR-214水平与该疾病的ROC曲线分析。
具体实施方式
在一个方面中，本发明提供一种用于诊断强直性脊柱炎的血液检测试剂盒，其包括用于扩增miR-214的引物，
其中，所述miR-214的序列为5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’。
在一些实施方案中，所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214的cDNA的扩增引物。
在一些实施方案中，所述血液检测试剂盒还包括用于从血液中提取miRNA的试剂。
在一些实施方案中，所述miR-214的反转录引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。所述miR-214的cDNA的扩增引物优选是如SEQ ID NO:2所示的上游引物和/或如SEQID NO:3所示的下游引物。
其中：
SEQ ID NO:1：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTGCC-3’
SEQ ID NO:2：
5’-GACAGCAGGCACAGACA-3’
SEQ ID NO:3：
5’-GTGCAGGGTCCGAGG-3’。
本说明书中，“诊断”可以是确诊，也可以是为确诊提供参考信息。
miR-214的核苷酸序列为5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’，针对已知核苷酸序列的miRNA设计其扩增引物(包括反转录引物和cDNA扩增引物)是本领域技术人员熟知的，例如可以按照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克(Sambrook.J.)等著，黄培堂等译，第3版，2005)的教导来进行设计，或者利用计算机软件(例如Premier公司开发的Premier 6.0)来进行设计。
特别是，在使用SEQ ID NO:1所示的miR-214的反转录引物、SEQ ID NO:2所示扩增miR-214的cDNA的上游引物、以及SEQ ID NO:3所示扩增miR-214的cDNA的下游引物时，本发明的血液检测试剂盒的检出率(灵敏度)可达78.13％，完全满足医疗器械法规中作为诊断试剂盒的要求。本说明书中，检出率是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。本技术领域确认强直性脊柱炎的“金标准”是1984年修订的纽约标准，即符合放射学标准和一项以上临床标准，可诊断为强直性脊柱炎，其中：
1、临床标准：①腰痛、僵3个月以上，活动改善，休息无改善；②腰椎额状面和矢状面活动受限；③胸廓活动度低于相应年龄、性别的正常人。
2、放射学标准(骶髂关节X线)双侧骶髂关节炎≥2级或单侧骶髂关节炎3～4级：①0级：正常；②I级：可疑变化；③Ⅱ级：轻度异常，可见局限性侵蚀、硬化，但无关节间隙的改变；④Ⅲ级：明显异常，为中度或进展性骶髂关节炎，伴有以下1项或1项以上改变(侵蚀、硬化、关节间隙增宽或狭窄，或部分强直)；⑤Ⅳ级：严重异常，完全性关节强直。
本发明还提供上述用于扩增miR-214的引物在制备血液检测试剂盒中的用途。其中，所述血液检测试剂盒可以是例如本发明的血液检测试剂盒。
用于从血液中提取miRNA的试剂及方法是本领域技术人员已知的，例如可以参照Qiagen血清microRNA检测试剂盒产品说明书。用于从血液中提取miRNA的试剂可以包括，例如氯仿、RNAase抑制剂、DEPC水和/或乙醇等。
本发明的血液检测试剂盒适用于利用实时定量PCR对血液中的miR-214进行检测的方法，因此，其还可以包含实时定量PCR反应所使用的酶和/或试剂，例如：逆转录酶、缓冲液、dNTPS、MgC12、去核酸酶水、荧光染料或探针、Taq酶等。这些酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，可根据具体采用的检测方法适当选择。此外，本发明的血液检测试剂盒还可以包含标准品和对照(如定量标化的线虫miR-39样本等)及正常参考值(1-3*105拷贝/ul)。采用本发明的血液检测试剂盒，只需要血液而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测miR-214，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。
实施例
实施例1.强直性脊柱炎病人血清中miR-214水平与血清中IL-17水平的相关性分析
临床强直性脊柱炎病人的收集标准
样品收集：总共34例，年龄在25-35岁之间的男性。
强直性脊柱炎病人：年龄在25-35岁之间的依据以上所述的纽约标准确诊的男性强直性脊柱炎患者，无肿瘤、糖尿病、甲状腺功能亢奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃肠道疾病、严重感染性疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物使用史(双膦酸盐类、降钙素类、骨化三醇类、雌激素类等)。共计31人。
血清中miRNA提取方法：
血清样本的制备
利用EDTA抗凝管采集受试者血液，室温或4摄氏度保存。此后1小时内进行1900g(3000rpm)4℃离心10分钟；取上层黄色液体为血清；16000g离心10分钟；取上清，-80℃保存待用。
血清总miRNA的提取
使用美国QIAGEN公司miRNeasy Serum/Plasma kit(217184)提取血清总miRNA。
具体方法如下：将-80℃保存的血清融化，各取200μl；加入1ml的QIAzol LysisReagent(随试剂盒提供)，充分混匀；室温(15-25度)下放置5min。
加入3.5μl miRNeays Serum/Plasma Spike-in Control(1.6×108copies/μl)，充分混匀；加入200μl氯仿，充分混匀15秒；室温(15-25℃)下放置2-3min；
4℃ 12000g离心15min；上清转至新的离心管中，加入900μl的100％乙醇，混匀；吸取700μl转至RNeasy MinElute spin(随试剂盒提供)，室温下8000g离心15秒；剩余的样品重吸取700μl转至RNeasy MinElute spin(随试剂盒提供)，室温下8000g离心15秒，弃上清；在RNeasy MinElute Spin中加入700ul试剂RWT(随试剂盒提供)，8000g离心15秒，弃上清；在RNeasy MinElute Spin中加入500ul试剂RPE(随试剂盒提供)，8000g离心15秒，弃上清；在RNeasy MinElute Spin中加入500μl 80％的乙醇，8000g离心2min，弃上清；RNeasyMinElute Spin放入新的离心管中，13000g离心5min，以去掉酒精；RNeasy MinElute Spin放入新的离心管中，加入14μl的去RNA酶的水，离心机最大转速离心2min，收集得到血清中获得的RNA。
血清中miR-214的颈环法反转录反应
使用大连生工TAKARA公司Prime
Figure BDA0002260848660000071
RT试剂盒(货号：RR037A)进行反转录。反转录反应如下：
混匀，37℃反应15分钟。然后85℃，15秒，4℃保存。将得到的20μL反转录反应后的cDNA稀释25倍至500μl，-20℃保存以备下一步实时定量PCR检测。其中，miR-214的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示
实时定量PCR检测血清中miR-214的表达
使用大连生工TAKARA公司TB
Figure BDA0002260848660000082
Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒(货号RR820A)进行实时定量PCR检测。具体步骤如下：
构建PCR反应体系如下：
总计20μl。其中miR-214的cDNA的扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，miR-214的cDNA的扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
将反应体系混匀，反应程序如下：
以PCR反应后溶解曲线为标准，验证PCR反应的特异性。血清中miR-214的表达以cel-39的表达为对照，以2Ct(cel-miR-39–目的miRNA)的数值为每个血清中miR-214的表达情况。
血清中IL-17浓度检测
使用美国R&D Systems公司的Human IL-17Quantikine ELISA Kit(D1700)检测血清IL-17浓度。具体方法如下：
按照试剂盒方案配制好试剂，同时将标准品等比稀释到不同浓度，并准备好阴性对照和样本。取96孔的酶联免疫吸附试验板，每个孔中加入100μl分析稀释液，每个孔中再加入100μl标准品、阴性对照和样本，常温孵育3h，去掉孔中液体，加入400μl Wash Buffer反复拍打冲洗3次；每个孔中加入200μl缀合物缓冲液，常温孵育1h，去掉孔中液体，加入400μl洗涤缓冲液反复拍打冲洗3次；配好A液和B液的混合液，每个孔中加入200μl AB混合液，常温避光孵育30min，最后加入50μl终止液，轻摇混匀后30min内上机读值，在酶联免疫分析仪上先用450nm读值，再用540nm校准。以不同浓度的标准品读值来做出标准曲线，根据标准曲线计算出各个血清样品的IL-17浓度。
血清中miR-214水平与血清中IL-17水平的相关性分析
使用GraphPad prism5对受试者血清中miR214的表达情况同受试者中的血清IL-17浓度进行线性相关性分析，其中血清中miRNA的表达以Log2表示，以GraphPad prism5做统计分析，·|r|≥0.8高度相关；·0.5≤|r|<0.8中度相关；·0.3≤|r|<0.5低度相关。
实验结果表明，血清中miR-214的水平与血清中IL-17浓度呈现明显的正相关(R＝0.6569；p＜0.0001)，如图1所示。
实施例2.关节液中miR-214水平与血清中IL-17水平的相关性
关节液样本的制备
利用EDTA抗凝管采集受试者关节液，室温或4℃保存。此后一小时内1900g(3000rpm)4度离心10分钟；取上清为关节液；16000g离心10分钟；取上清，-80℃保存待用。
关节液中miRNA的提取
使用美国QIAGEN公司miRNeasy Serum/Plasma kit(217184)提取关节液总miRNA。具体方法如下：
将-80℃保存的关节液融化，各取200μl；加入1ml的QIAzol Lysis Reagent(随试剂盒提供)，充分混匀；室温(15-25度)下放置5min。加入3.5μl miRNeays Serum/PlasmaSpike-in Control(1.6×108copies/ul)，充分混匀；加入200ul氯仿，充分混匀15秒；室温(15-25度)下放置2-3min；4℃ 12000g离心15min；上清转至新的离心管中，加入900μl的100％乙醇，混匀；吸取700μl转至RNeasy MinElute spin(随试剂盒提供)，室温下8000g离心15秒；剩余的样品重吸取700μl转至RNeasy MinElute spin(随试剂盒提供)，室温下8000g离心15秒，弃上清；在RNeasy MinElute Spin中加入700μl试剂RWT(随试剂盒提供)，8000g离心15秒，弃上清；在RNeasy MinElute Spin中加入500μl试剂RPE(随试剂盒提供)，8000g离心15秒，弃上清；在RNeasy MinElute Spin中加入500μl 80％的乙醇，8000g离心2min，弃上清；RNeasy MinElute Spin放入新的离心管中，13000g离心5min，以去掉酒精；RNeasy MinElute Spin放入新的离心管中，加入14μl的去RNA酶的水，离心机最大转速离心2min，收集得到关节液中获得的RNA。
关节液中miR-214的颈环法反转录反应
使用大连生工TAKARA公司Prime RT reagent Kit(货号：RR037A)进行反转录。反转录反应如下：
Figure BDA0002260848660000112
混匀，37℃反应15分钟。然后85℃，15秒，4℃保存。将得到的20μL反转录反应后的cDNA稀释25倍至500μl，-20℃保存以备下一步实时定量PCR检测。其中miR-214的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实时定量PCR检测血清中miR-214的表达
使用大连生工TAKARA公司TB
Figure BDA0002260848660000113
Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)试剂盒(货号RR820A)进行实时定量PCR检测。具体步骤如下：
构建PCR反应体系如下：
总计20μl。其中miR-214的cDNA的扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，miR-214的cDNA的扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
将反应体系混匀，反应程序如下：
以PCR反应后溶解曲线为标准，验证PCR反应的特异性。关节液中miR-214的表达以cel-39的表达为对照，以2Ct(cel-miR-39–目的miRNA)的数值为每个关节液中miR-214的表达情况。
关节液中IL-17浓度检测
酶联免疫吸附试验测定关节液中IL-17浓度，具体检测步骤同实施例1。
实验结果表明，关节液中miR-214的水平与关节液中IL-17浓度呈现明显的正相关(R＝0.8433；p＜0.0002)，如图2所示。
实例3检出率验证
样品收集：总共57例，年龄在25-35岁之间的男性。
强直性脊柱炎病人：年龄在25-35岁之间的依据以上所述的纽约标准确诊的男性强直性脊柱炎患者，无肿瘤、糖尿病、甲状腺功能亢奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃肠道疾病、严重感染性疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物使用史(双膦酸盐类、降钙素类、骨化三醇类、雌激素类等)。共计32人。
对照遴选标准：年龄在25-35岁之间的健康男性，无肿瘤、糖尿病、甲状腺功能亢奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃肠道疾病、严重感染性疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物使用史(双膦酸盐类、降钙素类、骨化三醇类、雌激素类等)，共计25人。
临床检测指标为1984年修订的纽约标准，即符合放射学标准和一项以上临床标准，可诊断为强直性脊柱炎。
1、临床标准：①腰痛、僵3个月以上，活动改善，休息无改善；②腰椎额状面和矢状面活动受限；③胸廓活动度低于相应年龄、性别的正常人。
2、放射学标准(骶髂关节X线)双侧骶髂关节炎≥2级或单侧骶髂关节炎3～4级：①0级：正常；②I级：可疑变化；③Ⅱ级：轻度异常，可见局限性侵蚀、硬化，但无关节间隙的改变；④Ⅲ级：明显异常，为中度或进展性骶髂关节炎，伴有以下1项或1项以上改变(侵蚀、硬化、关节间隙增宽或狭窄，或部分强直)；⑤Ⅳ级：严重异常，完全性关节强直。
受试者血清中miR-214的提取与检测、结果分析同实施例1。
实验结果：
按照纽约标准确定，在57名受试者中的25人为健康受试者，计算所有健康受试者中血清miR-214的拷贝数的平均值为3*105拷贝/μl。强直性脊柱炎患者血清中miR-214的水平显著高于正常人血清中的miR-214水平，如图3所示。
按照上述实施例1进行miR214的水平检测，以miR-214拷贝数大于健康3*105拷贝/μl为阳性指标(即确定为强直性脊柱炎)，共有25人。同时对该批人用纽约标准进行了强直性脊柱炎检测，共有32人确诊为强直性脊柱炎，包含前述25人中的全部。经过对32名强直性脊柱炎患者和25名健康受试者血清miR-214浓度的分析，用GraphPad Prism 7.0软件计算出cut-off值，可知本发明的诊断方法的灵敏度，即检出率为78.13％(25/32)。特异性，是指健康受试者中的真阴性人数与总人数的比值，25名健康受试者中有一人miR-214拷贝数大于3*105拷贝/μl，即阳性率，为96％(24/25)，如图4所示。实施例4用于强直性脊柱炎诊断的miRNA试剂盒的制作
miRNA试剂盒的制作和操作流程基于RT-PCR和real-time PCR等技术。试剂盒包括血清miR-214反转录和扩增引物(反转录引物为SEQ ID NO:1：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTGCC-3’；Q-PCR上游引物为SEQ ID NO:2：5’-GACAGCAGGCACAGACA-3’，Q-PCR下游引物为SEQ ID NO:3：5’-GTGCAGGGTCCGAGG-3’),还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂,如:逆转录酶,缓冲液,dNTPS,MgCl2,去核酸酶水,荧光染料或探针，Taq酶等,可根据具体采用的实验方法选用,这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的,另外还可以有标准品和对照(如定量标化的线虫miR-39样本等)及正常参考值。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品,通过最精简的荧光或探针法检测miRNA的变化，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性,因此将此试剂盒投入实践,可以帮助指导临床准确做出诊断。
序列表
<110> 中国人民解放军63919部队
北京市海淀区北清路26号院
<120> 一种与强直性脊柱炎相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用
<130> C19P0141
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 逆转录引物
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacactgcc 50
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 扩增正向引物
<400> 2
gacagcaggc acagaca 17
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 扩增反向引物
<400> 3
gtgcagggtc cgagg 15
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> miR-214
<400> 4
acagcaggca cagacaggca gu 22

Claims (16)

1.一种用于诊断强直性脊柱炎的血液检测试剂盒，其包括用于扩增miR-214的引物，
其中，所述miR-214的序列为5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’。
2.根据权利要求1所述的血液检测试剂盒，其中所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214的cDNA的扩增引物。
3.根据权利要求2所述的血液检测试剂盒，其中，所述miR-214的反转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求2或3所述的血液检测试剂盒，其中，所述miR-214的cDNA的扩增引物包括：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求1所述的血液检测试剂盒，所述试剂盒还包括用于从血液中提取miRNA的试剂。
6.根据权利要求1所述的血液检测试剂盒，所述试剂盒还包括反转录和PCR反应所需的酶和/或试剂。
7.根据权利要求6所述的血液检测试剂盒，所述试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTP、MgC12、去核酸酶水、荧光染料、探针和/或Taq酶。
8.根据权利要求1所述的血液检测试剂盒，其中所述血液为血清。
9.用于扩增miR-214的引物在制备用于诊断强直性脊柱炎的血液检测试剂盒中的用途，其中，所述血液检测试剂盒包括：
用于扩增miR-214的引物，
其中，所述miR-214的序列为5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214的cDNA的扩增引物。
11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述miR-214的反转录引物的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
12.根据权利要求10或11所述的用途，其中，所述miR-214的cDNA的扩增引物是：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
13.根据权利要求9所述的用途，所述试剂盒还包括用于从血液中提取miRNA的试剂。
14.根据权利要求9所述的用途，所述试剂盒还包括反转录和PCR反应所需的酶和/或试剂。
15.根据权利要求14所述的用途，所述试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPS、MgC12、去核酸酶水、荧光染料、探针和/或Taq酶。
16.根据权利要求9所述的用途，其中所述血液为血清。
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