CN101812538A - 一种检测肠道病毒71型的荧光定量rt-pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒及使用方法。所说的试剂盒包括：(1)EV71的RNA定量标准品；(2)检测引物；(3)TaqMan-LNA探针，(4)RT-PCR缓冲液，(5)AMV逆转录酶，(6)Taq酶，(7)RNase Free dH₂O。本试剂盒对肠道病毒71型的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒无交叉反应；检测的灵敏度达10²拷贝，可直接从疑似手足口病患者的脑脊液、疱疹液、咽拭子和肛拭子等标本中定量检测肠道病毒71型核酸；利用本发明试剂盒检测操作简单快速，从病毒核酸提取至完成检测仅需2到3小时。

Description

一种检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型(EV71)试剂盒及其应用，适用于EV71病毒定量检测。

背景技术

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，近年来各地均有散在发生。该病常见于学龄前儿童，婴幼儿多见，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，一般预后良好，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。手足口病的传染源为病人和隐性感染者，主要是通过密切接触感染者的粪便、口腔分泌物、皮肤疱疹液中的病毒，经粪-口途径或呼吸道(主要是口腔粘膜和鼻腔粘膜)传播。现已知的引起手足口病的病原体是属于小RNA病毒科的多种肠道病毒，主要有：柯萨奇病毒A组的4、5、7、9、10、16型；柯萨奇病毒B组的2、5型；肠道病毒71型以及埃可病毒。根据国内外资料，与其他肠道病毒引起的手足口病相比，由EV71感染引起的疾病发生重症感染的比例较大，病死率也较高。因此，对可引起重症手足口病的EV71的检测对于疾病的控制和治疗非常重要。

肠道病毒实验室检测方法主要有三种：病毒分离、抗体测定和核酸扩增方法。前两种方法繁琐费时，不适宜早期诊断。现有的核酸扩增方法有RT-PCR法和荧光定量RT-PCR法，RT-PCR法操作繁琐费时，检测灵敏度略低。近几年发展起来的荧光定量PCR技术较常规RT-PCR技术不仅实验操作简单快捷，并且提高了检测的敏感性、特异性，当然它对引物和探针的设计也提出了更高的要求。现有荧光定量RT-PCR法采用TaqMan探针，可准确快速的对待测样品进行定性的检测，目前国内也已有对EV71的TaqMan探针荧光定量RT-PCR的定性检测试剂盒。本发明创新性的设计使用了TaqMan-LNA探针，LNA是一种新型的核酸衍生物，它是在戊糖环的2′-O，4′-C之间通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形。这个环形桥锁定了吠喃糖C3-内趋型的N结构，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA强化的杂交特征和对熔点温度的影响，可以灵活设计长度较短的含有LNA的实时定量PCR探针，以提高荧光定量PCR的特异性。LNA修饰的寡核酸探针不仅可加强探针对目标序列杂交的特异性，同时能够显著提高杂交效率和热稳定性。同时本发明利用体外转录RNA标准品和待测样品共同检测，对样品所含的EV71病毒拷贝数进行定量检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒，该试剂盒能快速准确的对待测样品的肠道病毒71型进行定量检测。该试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量PCR仪，而且能够灵敏特异的对EV71进行定量检测。

本发明的另一个目的是提供一种荧光定量RT-PCR试剂盒在EV71定量检测中的应用。

本申请发明人从美国的NCBI基因库上下载了世界各地的所有EV71毒株的vp1基因序列近千条，对其进行了同源性比对，寻找到EV71vp1基因的保守区域，并通过NCBI数据库进行了Blast同源性比对验证，在其保守区域设计上下游引物和TaqMan-LNA探针，对该区域进行特异性扩增用于检测EV71。

本发明采用TaqMan-LNA探针建立了荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒，同时通过制备RNA标准品与样品同时检测得到待测样品的初始病毒拷贝数，对病毒进行定量检测。

本发明所说的检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒，包括：

(1)EV71的RNA定量标准品。

(2)检测引物：上游引物(EV71-Pf)：5′-AGGATTTACATGAGAATGAAGCA-3′和下游引物(EV71-Pr)：5′-GCATAATTTGGGTTGGCTTT-3′。

(3)TaqMan-LNA探针(EV71TaqMan-LNA)：5′-TCA+GGGCGT+GGATACCTCGC-3′(荧光探针5′端标记一荧光报告基团，3′端标记一荧光淬灭基团，+表示LNA修饰+右侧碱基)。

(4)RT-PCR缓冲液，(5)AMV逆转录酶，(6)Taq酶，(7)RNase Free dH₂O。

上述所说的EV71的RNA定量标准品是通过以下制备得到；用病毒RNA提取试剂盒提取一EV71病毒RNA，以EV71病毒RNA为模板，用上游引物5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACACAAACAGGA-3′和下游引物5′-TTTTTTTTTTTTTTTGGCTTAATGGAGTTGCCAGCATA-3′进行RT-PCR扩增，PCR产物纯化后用T7体外转录试剂盒转录RNA，用DNase酶消化剩余的DNA，然后将转录RNA产物纯化，得到EV71的RNA标准品。用核酸蛋白分析仪测定体外转录产物的含量后，根据公式计算RNA标准品的拷贝数，，记录RNA标准品的定量拷贝数，将其保存在含有EDTA，poly(A)RNA和叠氮钠的溶液中。

本发明还公开了该试剂盒在快速检测肠道病毒71型中的应用。

本发明还提供了使用本发明的试剂盒对肠道病毒71型进行检测的方法：将(1)RNA定量标准品做一系列的十倍稀释，以待测样品RNA和一系列十倍稀释的RNA标准品为模板，以(7)RNase Free dH₂O为阴性对照，将试剂盒(2)-(7)所述的EV71上游引物、下游引物、TaqMan-LNA探针和其他试剂同时加入反应体系中，于荧光定量PCR仪进行RT-PCR反应，根据倍比稀释的RNA标准品的Ct值和其拷贝数得到EV71的检测标准曲线，从而可以得出拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式。根据待测样品荧光检测的Ct值即可以得到样品的定量结果。既可把待测样品的Ct值代入表达式就可以算出它的初始病毒拷贝数，也可以从仪器直接读取初始拷贝数。

利用本发明的TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒及检测方法时，可以准确快速的得到样品的EV71病毒RNA初始拷贝数，应用于基层CDC对手足口病的监测，指导疾病控制人员的相关卫生防疫工作，帮助临床医生更好的掌握对EV71感染手足口病的治疗、预后和转归。

本发明的有益效果主要体现在：本试剂盒对肠道病毒71型的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒无交叉反应；检测的灵敏度达10²拷贝，可直接从疑似手足口病患者的脑脊、疱疹液、咽拭子和肛拭子等标本中检测肠道病毒71型核酸；利用本发明试剂盒检测操作简单快速，从病毒核酸提取至完成检测仅需2到3小时。

附图说明

图1是EV71RNA标准品荧光定量RT-PCR的动力学曲线。图中荧光曲线1-6对应的样品分别是1.567×10⁹拷贝/uL、1.567×10⁸拷贝/uL、1.567×10⁷拷贝/uL、1.567×10⁶拷贝/uL、1.567×10⁵拷贝/uL的RNA标准品和阴性对照。

图2是EV71RNA标准品荧光定量RT-PCR的标准曲线。

图3是临床阳性样品和阴性对照EV71荧光定量RT-PCR的动力学曲线。图中荧光曲线1-2对应的分别是一个阳性样品和一个阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒组成包括：

(1)RNA定量标准品。用病毒RNA提取试剂盒如Roche High Pure Viral RNAExtraction Kit、Qiagen Viral RNA/DNA Extraction Kit等，按试剂说明书操作，提取一EV71病毒RNA，以EV71病毒RNA为模板，用上游引物5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACACAAACAGGA-3′和下游引5′-TTTTTTTTTTTTTTTGGCTTAATGGAGTTGCCAGCATA-3′进行RT-PCR扩增，PCR产物纯化后用T7体外转录试剂盒转录RNA，用DNase酶消化剩余的DNA，然后将转录RNA产物纯化，得到EV71的RNA标准品。用核酸蛋白分析仪测定体外转录产物的含量为2.1ng/uL，转录产物大小为237bp，根据公式计算RNA标准品的拷贝数为1.567×10¹⁰拷贝/uL，记录RNA标准品的定量拷贝数，将其保存在含有EDTA、poly(A)RNA和叠氮钠的溶液中。

(2)检测引物：

上游引物(EV71-Pf)：5′-AGGATTTACATGAGAATGAAGCA-3′和下游引物(EV71-Pr)：5′-GCATAATTTGGGTTGGCTTT-3′，引物使用浓度为10uM。

(3)TaqMan-LNA探针(EV71TaqMan-LNA)：5′-TCA+GGGCGT+GGATACCTCGC-3′(荧光探针5′端标记一荧光报告基团FAM，3′端标记一荧光淬灭集团BHQ，+表示LNA修饰+右侧碱基)，探针使用浓度为10uM。

(4)RT-PCR缓冲液，(5)AMV逆转录酶，(6)Taq酶，(7)RNase Free dH₂O。

所用试剂均购自TAKARA公司。所用引物和探针均由上海生物工程公司合成。

实施例2：TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测应用实例：

(1)病毒核酸的提取提取待测样品的病毒RNA，所述样品RNA的提取可按常规方法进行，如Roche High Pure Viral RNA Extraction Kit、Qiagen ViralRNA/DNA Extraction Kit、TaKaRa Viral RNA Extraction Kit或其他常用提取病毒RNA试剂盒，操作按试剂说明书进行，病毒细胞培养物和疱疹液按上述方法直接提取，直肠拭子和咽拭子样本将拭子挤尽后提取。

(2)RNA标准品标准曲线绘制把含有1.567×10¹⁰拷贝/uL的转录RNA标准品用水10倍系列稀释成若干个稀释度。

(3)荧光定量RT-PCR检测方法的建立荧光定量RT-PCR的反应体系参照TaKaRa One Step RNA PCR Kit说明书配制，采用25μL反应体系，以待测样品RNA和分子个数为1.567×10⁹-1.567×10⁵拷贝/uL的一系列RNA标准品为模板，以RNase Free dH₂O为阴性对照，将EV71上游引物、下游引物和TaqMan-LNA探针同时加入反应体系中，于荧光定量PCR仪进行反应。所述RT-PCR反应液每25ul组成如下：

试剂                            使用量

2×One Step RT-PCR BufferIII    12.5μl

TaKaRa Ex TaqTM HS(5U/ul)       0.5μl

PrimeScriptTM RT Enzyme Mix II  0.5μl

PCR Forward Primer(10uM)        0.5μl

PCR Reverse Primer(10uM)        0.5μl

Probe溶液(10uM)                 1μl

RNA                             2ul

RNase Free dH₂O补至             25μl

荧光定量RT-PCR优化后的反应条件如下：第一阶段为RNA样品反转录反应：42℃5min反转录，95℃10s终止反转录；第二阶段为PCR反应：95℃5s，55℃30s，在55℃进行单点荧光检测，共40个循环。

(4)结果判定分子个数分别为1.567×10⁹一1.567×10⁵拷贝/uL的一系列标准品进行荧光定量RT-PCR的动力学曲线见图1，从左向右的反应模板依次为3.134×10⁹-3.134×10⁵拷贝/反应。以起始模板的对数为X轴，Ct值为Y轴做回归曲线，即得到EV71检测的标准曲线，，见图2。斜率为-0.2613，截距为11.42，相关系数为0.999，，从而可以得出拷贝数与值之间的线性关系表达式Y＝-0.2613x+11.42。

样品的Ct值可以从仪器读取，动力学曲线见图3。把待测样品的Ct值29.50代入表达式Y＝-0.2613x+11.42，就可以算出它的初始病毒拷贝数5.148×10³拷贝/反应，也可以从仪器直接读取初始拷贝数。利用该TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测方法，即可以得到待测样品的EV71病毒RNA的拷贝数2.507×10³拷贝/uL。

实施例3TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测方法的特异性、灵敏度、重复性

(1)TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测方法的特异性

利用该TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测方法对肠道病毒EV71有较好的特异性，对12株已测序确认vp1序列的EV71病毒RNA均出现相应的特异性荧光扩增曲线，呈阳性反应。对CA16、EV72、HCV、COXB5、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒等病毒RNA未出现相应的特异性荧光扩增曲线，呈阴性反应。结果表明，所设计的引物和探针只对目的病毒EV71特异，与其它检测对象无交叉反应。

(2)TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测方法的灵敏度

将已确定拷贝数的EV71RNA标准品进行十倍系列稀释后进行荧光RT-PCR。检测结果显示，该方法检测EV71的灵敏度为10²拷贝/反应。

(3)TaqMan-LNA探针荧光定量RT-PCR检测肠道病毒71型试剂盒检测方法的重复性

将EV71RNA标准品进行十倍系列稀释，在同一次实验中，，选取三个稀释度RNA标准品，对每一个浓度的标准品做6次重复荧光RT-PCR检测，结果各稀释度样品的6个平行反应获得的Ct值变异系数均在1.13％以下。对上述各梯度稀释的样品进行组间重复实验(每天检测一次，检测6d)，结果各稀释度样品的6次检测所获得的Ct值变异系数均在2.02％以下(见表1)。以上数据表明本研究所建立的荧光定量RT-PCR检测方法重复性好，可对EV71进行稳定、可靠的检测。

表1荧光定量RT-PCR检测EV71的重复性实验

SEQUENCE LISTING

<110>镇江市疾病预防控制中心

茅凌翔

<120>一种检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒

<130>

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

taatacgact cactataggg agaacacaaa cagga                            35

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tttttttttt tttttggctt aatggagttg ccagcata                         38

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aggatttaca tgagaatgaa gca                                         23

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcataatttg ggttggcttt                                             20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tcagggcgtg gatacctcgc                                             20

Claims (4)

1.一种检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒，该试剂盒包括：

(1)EV71的RNA定量标准品；

(2)检测引物：上游引物EV71-Pf：5′-AGGATTTACATGAGAATGAAGCA-3′和下游引物EV71-Pr：5′-GCATAATTTGGGTTGGCTTT-3′；

(3)TaqMan-LNA探针：5′-TCA+GGGCGT+GGATACCTCGC-3′，其中，荧光探针5′端标记一荧光报告基团，3′端标记一荧光淬灭基团，+表示LNA修饰+右侧碱基；

(4)RT-PCR缓冲液，(5)AMV逆转录酶，(6)Taq酶，(7)RNase Free dH₂O。

2.根据权利要求1所述的检测肠道病毒71型的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，其中的EV71的RNA定量标准品是通过以下方法得到：用病毒RNA提取试剂盒提取一EV71病毒RNA，以EV71病毒RNA为模板，用上游引物5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAACACAAACAGGA-3′和下游引物5′-TTTTTTTTTTTTTTTGGCTTAATGGAGTTGCCAGCATA-3′进行RT-PCR扩增，PCR产物纯化后用T7体外转录试剂盒转录RNA，用DNase酶消化剩余的DNA，然后将转录RNA产物纯化并定量，得到EV71的RNA标准品。

3.权利要求1所述的试剂盒在快速检测肠道病毒71型中的应用。

4.一种使用权利要求1所述试剂盒对肠道病毒71型进行检测的方法，其特征在于，是将EV71的RNA定量标准品做一系列的十倍稀释，以待测样品RNA和一系列十倍稀释的RNA标准品为模板，以RNase Free dH₂O为阴性对照，将试剂盒中所述(2)-(7)的EV71上游引物、下游引物、TaqMan-LNA探针和其他试剂同时加入反应体系中，于荧光定量PCR仪进行RT-PCR反应，根据一系列的RNA标准品的Ct值和其拷贝数得到EV71的检测标准曲线，从而可以得出拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式，根据待测样品荧光检测的Ct值即可以得到样品的定量结果。

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