CN103388033A

CN103388033A - 一种肠道病毒71型(ev71)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

Info

Publication number: CN103388033A
Application number: CN2012101403138A
Authority: CN
Inventors: 于明辉; 马道亮; 居金良
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Rendu Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2012-05-07
Filing date: 2012-05-07
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2032-05-07
Also published as: CN103388033B

Abstract

本发明公开了一种肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。包括：捕获探针、EV71扩增引物T7引物和nT7引物、EV71检测探针、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶等试剂。本发明试剂盒能够检测咽拭子或者粪便中的EV71 RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达10copies/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(常规60分钟完成检测)的特点，将在肠道病毒71型早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种肠道病毒71型(EV71)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

手足口病是一种全球性传染病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，在少数患者中可引发心肌炎、肺水肿、脑膜脑炎等致命性并发症。在我国，1981年在上海首次发现手足口病；此后，全国各地都有发病报道。有些地区的流行率高达1000/10万。

目前已确认的引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，埃可病毒11型以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV 71)最为常见。

目前EV71的主要检测方法有：病毒分离培养法、血清学检查和RT-PCR法。病毒分离培养和血清学方法，繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。RT-PCR法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

为解决现有的肠道病毒71型(EV71)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的肠道病毒71型(EV71)实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。

本发明所提供的肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条可与如序列表中序列1所示的肠道病毒71型(EV71)的靶标核酸(EV71 RNA)序列特异结合的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生EV71靶标核酸(EV71RNA)的DNA拷贝的EV71扩增引物T7和nT7，和一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述EV71靶标核酸(EV71 RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的EV71检测探针。

所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的肠道病毒71型(EV71)的靶标核酸(EV71 RNA)序列特异结合，在有EV71内标(EV71 IC RNA)时，其最好还可与该EV71内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述EV71扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述EV71检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和EV71检测探针存在于一EV71检测液中。

再进一步所述试剂盒还包含有EV71内标和内标检测探针；所述EV71内标为竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并与EV71靶标核苷酸(EV71 RNA)使用同一对引物(T7和nT7)，EV71内标由序列表中序列7所示的EV71 IC RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于EV71检测液中。

更进一步，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、EV71反应液、EV71检测液、SAT酶液、EV71阳性对照、EV71阴性对照和EV71内标，其中：

裂解液：含硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液：含NaCl和SDS；

EV71反应液：含dNTP和NTP；

EV71检测液：含T7引物、nT7引物、EV71检测探针和内标检测探针；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；

EV71阳性对照；含肠道病毒71型(EV71)VP1基因的体外转录RNA稀释物；

EV71阴性对照：不含有肠道病毒71型(EV71)靶标核酸(EV71 RNA)序列或不含有肠道病毒71型的溶液，如生理盐水；

EV71内标：含EV71内标RNA(EV71 IC RNA，序列如序列表中序列7所示)稀释物。

具体的，所述试剂盒中一个反应单位中上述各种试剂组成如下：

(1)裂解液：HEPES 25-250mM，(NH₄)₂SO₄ 5-50mM；

(2)核酸提取液：HEPES 50-400mM，EDTA 40-200mM，LiCl 400-2000mM，捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)，磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；

(3)洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；

(4)EV71反应液：Tris 10-50mM，MgCl2 10-40mM，dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)，PVP40 1-10％，KCl 5-40mM；

(5)EV71检测液：将EV71扩增引物和EV71检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为5pmol/反应，nT7引物浓度优选为2.5pmol/反应，EV71检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM trehalose、40-200mMTris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；

(7)EV71阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL肠道病毒71型(EV71)VP1基因的体外转录RNA稀释物；

(8)EV71阴性对照：不含有肠道病毒71型(EV71)靶标核酸(EV71 RNA)序列或不含有肠道病毒71型的溶液；

(9)EV71内标：含10⁵拷贝/mL EV71 IC RNA(序列如序列表中序列7所示)稀释物。

另一种更具体形式，所述试剂盒由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述EV71反应液、EV71检测液、SAT酶液、EV71阳性对照、EV71阴性对照及EV71内标。

所述EV71阳性对照中的体外转录的EV71 RNA以下述方法制备：

(1)用化学合成法合成EV71 VP1基因片段(EV71阳性片断，其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；

(2)将EV71 VP1基因片段插入到

载体中，构建EV71阳性对照质粒；

(3)EV71阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

-T-EV71菌株，贮存于-70℃；

(4)从

-T-EV71菌株中提取

-T-EV71质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

所述EV71内标中的体外转录的EV71 IC RNA以下述方法制备：

(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同EV71靶标序列区域(EV71内标片断，其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；

(2)将片段克隆到

载体中，构建EV71内标质粒；

(3)EV71内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

-T-EV71 IC菌株，贮存于-70℃；

(4)从-T-EV71 IC菌株中提取

-T-EV71 IC质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA

所述肠道病毒71型(EV71)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一：

(1)可与序列表中序列1所示的肠道病毒71型(EV71)的靶标核酸(EN71 RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

(2)用于在M-MLV反转录酶作用下产生EV71靶标核酸(EV71 RNA)的DNA拷贝的EV71扩增引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；

(3)用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述EV71靶标核酸(EV71 RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的EV71检测探针，所述EV71检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；

(4)内标和内标检测探针，内标为EV71核苷酸序列(EV71 RNA)的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(T7和nT7引物)，内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示，内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

所述试剂盒的使用方法，用于肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作：

1)用裂解液裂解待测样品中的肠道病毒71型(EV71)，得到含有肠道病毒71型(EV71)核酸的裂解液；

2)向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液和EV71 IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到肠道病毒71型(EV71)的核酸(RNA)和EV71 IC RNA；

3)将步骤2)提取的肠道病毒71型(EV71)的核酸(RNA)和EV71 IC RNA加入由EV71反应液和EV71检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42℃下继续温育60分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3∶1；

4)根据荧光信号产生的时间和强度参照EV71阳性对照、EV71阴性对照和EV71内标检测结果对待测样品进行定性检测。

本发明提供了一种肠道病毒71型(EV71)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有的EV71检测相比，具有以下优点：

(1)高特异性、高纯度、低污染：针对EV71靶核酸设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获EV71的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个反应过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。

(2)快速检测：将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要60分钟

(3)污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。

(4)设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。

综上所述，本发明试剂盒能够检测拭子或者粪便中的EV71 RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达10copies/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(60分钟完成扩增检测)的特点，将在肠道病毒71型早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为临床咽拭子样本SAT检测的靶标荧光检测结果

图2为临床咽拭子样本SAT检测的内标荧光检测结果

图3为临床粪便样本SAT检测的靶标荧光检测结果

图4为临床粪便样本SAT检测的内标荧光检测结果

图5为采用肠道病毒71型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对照检测临床样本粪便的结果

具体实施方式

本发明肠道病毒71型(EV71)检测技术，将特异性靶标捕获技术与实时荧光核酸恒温扩增(SAT)技术结合而形成。通过设计专用的捕获探针，高效、特异性捕获EV71的RNA；核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7 RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。

本发明中的专用引物和探针包括：

(1)捕获探针：一条可与序列表中序列1所示的肠道病毒71型(EV71)的靶标核酸(EV71 RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，在有EV71内标(EV71 IC RNA)时，其还可与该EV71内标序列特异结合；.所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

(2)EV71扩增引物：一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生EV71靶标核酸(EV71RNA)的DNA拷贝的EV71扩增引物，所述EV71扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；

(3)EV71检测探针：一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述EV71靶标核酸(EV71 RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的EV71检测探针，所述EV71检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

为便于进行结果分析，还包括：(4)一条内标检测探针和EV71内标，内标检测探针为在使用EV71内标时与该内标配合使用的内标检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；EV71内标为EV71核苷酸序列(EV71 RNA)的竞争性内标，同时与所述捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(T7和nT7引物)。EV71内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名为EV71 IC RNA(IC含义为内标)。

基于以上设计，本发明进一步提供一种肠道病毒71型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。

该试剂盒，至少包含所述捕获探针(序列2)，一对所述T7引物(序列3)和nT7引物(序列4)，以及一条所述EV71检测探针(序列5)。

进一步，所述试剂盒还可包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和EV71检测探针存在于EV71检测液中。

再进一步，所述试剂盒还可包含EV71内标(序列7)和内标检测探针(序列6)，所述的内标检测探针存在于EV71检测液中。

更具体来讲，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、EV71反应液、EV71检测液、SAT酶液、EV71阳性对照、EV71阴性对照和EV71内标，各组分说明如下：

(1)裂解液：用于裂解和保存待测样品中的肠道病毒71型(EV71)，为含有去垢剂和HEPES缓冲液的溶液，去垢剂主要为硫酸铵((NH₄)₂SO₄，优选为5-50mM)；

(2)核酸提取液：用于提取和纯化EV71病毒RNA，为含捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)和磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)的水溶液；

(3)洗涤液：用于磁珠清洗，为含1％(V/V)SDS的水溶液。

(4)EV71反应液：SAT扩增所需组分，含dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)和NTP 1-20mM(优选为1-10mM)的水溶液；

(5)EV71检测液：含SAT扩增所需引物和探针的水溶液，各引物或探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为5pmol/反应，nT7引物浓度优选为2.5pmol/反应，EV71检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

(6)SAT酶液：SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；

(8)EV71阴性对照：不含有肠道病毒71型(EV71)靶标核酸(EV71 RNA)序列或不含有肠道病毒71型的溶液，如生理盐水；

(9)EV71内标：含10⁵拷贝/mL EV71内标RNA(序列7)稀释物，是EV71核苷酸序列(EV71 RNA)的竞争性内标，为体外转录RNA(EV71 IC RNA)稀释物。

以上所述试剂盒中各组成的进一步说明如下：

裂解液的主要有效成分是去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。捕获探针一端与靶标互补，一端与磁性颗粒互补连接，在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过洗涤液清洗磁性颗粒而获得纯净的病毒靶标核酸(RNA)。病毒RNA的提取通过特异性吸附原理来实现。

EV71检测液中EV71检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中设置了EV71阳性对照、EV71阴性对照和EV71内标。其中，EV71阳性对照和EV71内标为体外转录的RNA，不具有生物学活性。

通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。此外，通过阳性对照品可制备临界弱阳对照(以生理盐水和裂解液按1∶1混合成为稀释液，稀释阳性对照1000倍作为临界弱阳对照)，可以提示处于临界值状态时的检验操作情况，通过临界弱阳对照定期检测SAT实验室，可进行室内质量控制，以防止检测过程出现漏检(假阴性)的情况。EV71内标作为EV71 RNA的竞争性内标，其最主要的作用就是控制假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。

利用以上试剂盒对肠道病毒71型(EV71)进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤：

2)向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液和和EV71 IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到肠道病毒71型(EV71)的核酸(RNA)和EV71 IC RNA；

在上述检测操作中，所述步骤1)中的待测样品为咽拭子或粪便。

所述步骤4)中的EV71阳性对照为含10⁵-10⁸拷贝/mL肠道病毒71型(EV71)VP1基因的体外转录RNA稀释物；EV71阴性对照为不含有肠道病毒71型(EV71)靶标核酸(EV71 RNA)序列或不含有肠道病毒71型的溶液；EV71内标为含10⁵拷贝/mL EV71内标RNA的稀释物。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RD Biosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。

实施例1、用于实时荧光核酸恒温扩增检测肠道病毒71型(EV71)的专用引物和探针的设计

本发明选择EV71病毒VP1基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)，根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测肠道病毒71型(EV71)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：

(1)一条可与肠道病毒71型(EV71)的靶标核酸(EV71 RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture O1igo)，所述捕获探针的核苷酸序列为：5’AACCUGUUAUAUCUAUGUCCCAGUUGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’(序列表中序列2)；

(2)一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生EV71靶标核酸(EV71 RNA)的DNA拷贝的EV71扩增引物，所述EV71扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列为5’aatttaatacgactcactatagggagaTCTCCAACTARACCCGCYCTGCT3’(Y、R代表简并碱基，Y代表C/T，R代表A/G，序列表中序列3)，nT7引物序列为5’GCACTCCAAGCTGCTGAAATTG 3’(序列表中序列4)；

(3)一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述EV71靶标核酸(EV71 RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的EV71检测探针，所述EV71检测探针的核苷酸序列为5’ccUCAAAUGCUAGUGAgg3’(序列表中序列5)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的EV71内标(序列7)，设计了内标检测探针，EV71内标与EV71靶标核苷酸(EV71 RNA)拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述EV71内标可通过EV71靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与EV71检测探针序列、荧光标记不同的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’ccgacGUGAUACGAGAGAGucgg3’(序列表中序列6)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

实施例2、制备肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，Target CaptureOligo)、T7引物、nT7引物、EV71检测探针、内标检测探针、内标、M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等组分。

所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和EV71检测探针、内标检测探针存在于EV71检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具体来讲，所述试剂盒分为2-30℃储存的A盒(标本处理单元)和-15--35℃储存的B盒(核酸扩增检测单元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗涤液，B盒包括EV71反应液、EV71检测液、SAT酶液、EV71阳性对照、EV71阴性对照和EV71内标，主要成分如下：

A盒(标本处理单元)组成为：

裂解液；含硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

核酸提取液：含捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)和磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；

洗涤液：主要含1％(V/V)SDS。

B盒(核酸扩增检测单元)组成为：

EV71反应液：含dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)；

EV71检测液：含引物和探针，各引物和探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为5pmol/反应，nT7引物浓度优选为2.5pmol/反应，EV71检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)，T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；

EV71阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL肠道病毒71型(EV71)VP1基因的体外转录RNA稀释物；

EV71内标：含10⁵拷贝/mL EV71内标RNA稀释物(序列表中序列7)。

试剂盒中所包含的所有试剂均可按提示以常规方法制备取得或商业购买得到。

具体来讲，每一反应单位中，所述试剂盒各种试剂的具体组配如下：

(1)裂解液：HEPES 25-250mM，(NH₄)₂SO₄5-50mM；

(3)洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；

(4)EV71反应液：Tris 10-50mM，MgCl₂10-40mM，dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)，PVP40 1-10％，KCl 5-40mM；

(9)EV71内标：含10⁵拷贝/mL EV71内标RNA(序列如序列表中序列7所示)稀释物。

EV71阳性对照中的体外转录的EV71 RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成EV71 VP1基因片段(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；

(2)将EV71 VP1基因片段插入到

载体中，构建EV71阳性对照质粒；

(3)EV71阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

-T-EV71菌株，贮存于-70℃；

(4)从

-T-EV71菌株中提取-T-EV71质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

EV71内标中的体外转录的EV71 IC RNA，可以通过多种方法制备所得。其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同EV71靶标序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；

(2)将片段克隆到

载体中，构建EV71内标质粒；

(3)EV71内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

-T-EV71 IC菌株，贮存于-70℃；

(4)从-T-EV71 IC菌株中提取

-T-EV71 IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA

实施例3、临床样本咽拭子的实时荧光核酸恒温扩增检测

用本发明试剂盒(组成见实施例2)检测临床样本咽拭子中的肠道病毒71型(EV71)，具体方法包括以下步骤：

1、样本采集、运输及保存

由临床医师根据实际情况进行标本采集，检测标本为咽拭子，采集方法为：专用采样棉签擦拭咽后壁及两侧咽扁桃体部分，将拭子侵入3-5mL生理盐水中，密封送检。样本采集后48小时内4℃保存送至肠道病毒监测网络实验室(或者-70℃保存待测，一周内送达)。

2、核酸提取

2.1在样品处理管(1.5mL离心管)中加入200μl裂解液(HEPES 50mM，(NH₄)₂SO₄35mM)和200μl拭子洗液(用生理盐水洗涤下的样本溶液，不足以生理盐水补足)，用裂解液裂解待测样品中的肠道病毒71型(EV71)，得到含有肠道病毒71型(EV71)核酸的裂解液。

2.2在样品处理管(1.5mL离心管)中加入100μl核酸提取液(HEPES 200mM，EDTA100mM，LiCl 800mM，捕获探针15μM，磁珠150mg/L)和10μl内标溶液(含10⁵拷贝/mL EV71内标RNA)，混匀，60℃保温5分钟，室温放置10分钟。

2.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(HEPES 25mM，NaCl 150mM，1％SDS，EDTA 2.5mM；)振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。

2.4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。

3、SAT核酸扩增检测

3.1向样品处理管中加入40μl反应检测液(40μl EV71反应液+2.5μl EV71检测液)洗涤磁珠。EV71反应液具体包含Tris 15mM，MgCl₂15mM，dNTP 2.5mM，NTP3mM，PVP401％，KCl 10mM；EV71检测液中T7引物浓度为5pmol/反应，nT7引物浓度为2.5pmol/反应，EV71检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应。

3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μl加至洁净微量反应管，用7500型PCR仪(美国ABI公司产品)60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含有M-MLV反转录酶1500U/反应、T7 RNA聚合酶1000U/反应、10mM HEPES pH7.5、15mMN-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mM zinc acetate(乙酸锌)、20mMtrehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH 8.0、80mM KCl、0.25mM EDTA、0.5％(v/v)Triton X-100和30％(v/v)glycerol(丙三醇)。

3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪，ABI公司产品)，42℃反应60分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测60次；荧光素通道选择FAM通道(靶标信号检测，F1)和VIC通道(内标信号检测，F2)。

4、结果判定

根据SAT扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

①阳性结果判定：

F1通道：dt≤55的样本为阳性；55＜dt＜60的样本建议重新检测，检测结果F1通道：dt＜60的样本为阳性。

②阴性结果判定：F1通道dt无数值或为60，同时F2通道：dt≤55，则为阴性。

质量控制：每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照F1通道：dt≤55；阴性对照F1通道：dt无数值或为60，同时F2通道：dt≤55，否则此次检测结果视为无效。

5、结果

肠道病毒71型咽拭子临床样本编号为EV71咽拭子标本1-7，另设阴性对照(不含有肠道病毒71型(EV71)靶标核酸(EV71 RNA)序列或不含有肠道病毒71型的溶液)、阳性对照(含10⁷拷贝/mL肠道病毒71型(EV71)VP1基因的体外转录RNA稀释物)各一个。结果如图1(F1荧光通道)和图2(F2荧光通道)所示，根据F1通道和F2通道的dt值情况，判定样本1、2、4、6为阳性，样本3、5、7为阴性。本结果与金标准病毒培养结果完全相同，表明本发明试剂盒用于检测临床样本咽拭子中的肠道病毒71型(EV71)准确性高，但上机扩增检测时间仅需60分钟具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。

实施例4、临床样本粪便的实时荧光核酸恒温扩增检测

本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2，试剂的生产在GMP车间进行，粪便临床样本由临床医师根据实际情况进行标本采集，采集方法为：采集病人发病7日内的粪便标本。粪便标本采集量5～8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，密封送检。样本采集后48小时内4℃保存送至肠道病毒监测网络实验室，或者-70℃保存待测，一周内送达。肠道病毒71型粪便临床样本编号为EV71粪便标本1-7，另设阴性对照、阳性对照各一个。检测方法同实施例3。

另同步进行对照检测：

用中山大学达安基因股份有限公司生产的肠道病毒71型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(国食药监械(准)2009第3400551)并参照说明书对粪便标本中的EV71病毒进行检测，具体方法包括以下步骤：

1、样本处理

a)取100μl水样粪便样本和100μl阴性对照、阳性对照分别加入1.5ml无Rnase和Dnase的离心管中，加入200ulTrizol试剂及100μl氯仿，用振荡器强烈震荡20秒后静置3分钟，然后1200rpm离心2分钟；

b)小心取出无色上层液体，转移至新灭菌的1.5ml离心管，然后加入10μl RNA提取液A，再用振荡器充分混匀，8000rpm离心1分钟后，小心弃去所有液体；

c)加入溶液C 400μl充分震荡混匀，8000rpm离心1分钟，尽可能地将液体去除干净；

d)将装有沉淀的离心管摆在通风橱中风干15分钟。然后加入30μl DEPC水，吸打混匀管中沉淀，得到白色的悬浊液，直接用于检测。

2、扩增试剂准备

从试剂盒中取出反应液、逆转录酶、Taq酶，待其溶解后，振荡混匀离心。向荧光定量PCR八联反应管中加入15μl反应液和2μl逆转录酶、3μl的Taq酶，混匀压紧管盖，迅速将其转移至样本处理区。

3、加样

在所设定各荧光定量PCR八连反应管中分别加入步骤1中提取的RNA各5μl，压紧管盖，3000rpm离心30sec。将荧光定量PCR八连管放入荧光PCR检测仪内。

4、PCR扩增

设置ABI7300和ABI7500的程序：40℃ 25min 1cycle；94℃ 3min 1cycle；94℃ 15sec，55℃ 45sec*40cycles(*为荧光信号采集步骤)。

仪器检测通道选择：

发光荧光基团为FAM荧光素，淬灭荧光基团为TAMAR荧光素，参考荧光基团为NONE，具体检测通道设置参照各仪器使用说明。

阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线的最高点为准。

检测结果分析

1、同一次试验中需同时满足以下两点，则试验有效，否则本次试验无效，需重做。

阴性质控品：无典型S型扩增曲线或无Ct值显示

阳性质控品：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤30

2、如果检测样本无典型S型扩增曲线或无Ct值＞35.1，则判样本为EV71阴性。

3、如果检测样本呈典型S型扩增曲线且Ct值≤35.1，则判样本为EV71阳性。

使用本发明试剂盒的检测结果如图3(F1荧光通道)和图4(F2荧光通道)所示，

根据F1通道和F2通道的dt值情况，判定检测结果为样本1、5、6检测为阴性，样本2、3、4、7为阳性，与肠道病毒71型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(国食药监械(准)2009第3400551)检测结果一致(图5)。但是FQ-PCR其操作复杂，检测时间长，单PCR扩增就需100分钟(从PCR扩增程序中可计算出：30+15+40×1≈85分钟，加上升降温的时间，大约为100分钟)，PCR扩增环节易造成环境DNA污染，而本试剂盒扩增产物为RNA，在环境中易降解，低污染。此外，FQ-PCR在样本处理环节需冷冻高速离心设备，PCR扩增环节需高温循环过程，整个检测过程的检测成本相对昂贵。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的肠道病毒71型(EV71)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种肠道病毒71型(EV71)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条可与如序列表中序列1所示的肠道病毒71型(EV71)的靶标核酸(EV71 RNA)序列特异结合的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生EV71靶标核酸(EV71RNA)的DNA拷贝的EV71扩增引物T7和nT7，和一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述EV71靶标核酸(EN71 RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的EV71检测探针。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述EV71扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述EV71检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和EV71检测探针存在于一EV71检测液中。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有EV71内标和内标检测探针；所述EV71内标为竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并与EV71靶标核苷酸(EV71 RNA)使用同一对引物(T7和nT7)，EV71内标由序列表中序列7所示的EV71 IC RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于EV71检测液中。

5.根据权利要求1至4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、EV71反应液、EV71检测液、SAT酶液、EV71阳性对照、EV71阴性对照和EV71内标，其中：

裂解液：含硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液：含NaCl和SDS。

EV71反应液：含dNTP和NTP；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：

(1)裂解液：HEPES 25-250mM，(NH₄)₂SO₄5-50mM；

(3)洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；

(4)EV71反应液：Tris 10-50mM，MgCl₂ 10-40mM，dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)，PVP40 1-10％，KCl 5-40mM；

(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM trehalose、40-200mMTris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述EV71反应液、EV71检测液、SAT酶液、EV71阳性对照、EV71阴性对照及EV71内标。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：所述EV71阳性对照中的体外转录的EV71 RNA以下述方法制备：

(2)将EV71VP1基因片段插入到