CN110079634A

CN110079634A - 一种快速检测肠道病毒ev71型的含内参双重等温核酸扩增方法

Info

Publication number: CN110079634A
Application number: CN201910218521.7A
Authority: CN
Inventors: 马学军; 申辛欣; 王智宏; 应清界; 王佶; 张益�; 李鑫娜; 白雪丁
Original assignee: Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd; National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd; National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2019-08-02

Abstract

本发明提供了一种快速检测肠道病毒EV71型的含内参双重等温核酸扩增方法。本发明通过对肠道病毒EV71型的基因组进行比对，设计用于检测肠道病毒EV71型C4a亚型的特异性引物对和探针以及内参探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示；在此基础上建立了含内参的双重等温核酸扩增体系，并构建了检测肠道病毒EV71型C4a亚型的试剂盒。本发明的方法在等温条件下进行，5‑30min内可实现同时对肠道病毒EV71型和内参DNA的扩增，灵敏度高、特异性好、内参的加入排除了假阴性和无效结果，更适于大量样品的检测，便于临床应用。

Description

一种快速检测肠道病毒EV71型的含内参双重等温核酸扩增方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于检测肠道病毒 EV71型C4a亚型的靶序列、特异性引物和靶探针，本发明还涉及利用特异性引物、靶探针和内参探针进行双重等温核酸扩增检测肠道病毒EV71型C4a亚型的方法和试剂盒。

背景技术

手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)是一种儿童常见传染病，大多数手足口病患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。

肠道病毒是引起手足口病的病原体。至少20多种A组肠道病毒血清型可引起手足口病，以肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒 A16型(CV-A16)、柯萨奇病毒A6型(CV-A6)、柯萨奇病毒A10 型(CV-A10)最为常见，其中，重症和死亡病例多数由EV-A71感染所致。基于VP1基因序列差异可以将EV71分为A、B、C 3个基因型，其中B与C又可分为5个基因亚型B1-B5与C1-C5。其中，中国主要流行的EV71型病毒为C4a亚型。

肠道病毒EV71型的检测方法目前有病毒分离培养法、血清学方法以及免疫组化法，但这些方法操作繁琐、试验周期长、灵敏度低、特异性差。针对病毒核酸检测的分子生物学方法具有高灵敏度和特异度的优点。目前常用的分子生物学技术是以聚合酶链反应(PCR) 为基础的变温扩增技术，包括PCR、实时荧光定量PCR、巢式PCR 和温度恒定的等温扩增技术，包括LAMP、NASBA、RPA等。目前已有一些较为成熟的EV71检测方法。以PCR为基础的一系列变温检测技术虽然具有灵敏度高、特异性强的特点，但因其需要精密的仪器(荧光定量PCR仪)及专业的技术人员，限制了其在基层检测中的应用。而等温扩增技术因其对温度和仪器的要求低、扩增效率高，更加适用于基层检测。

基于现有技术中EV71病毒检测方法存在的问题，亟需开发一种可在常温下快速检测EV71病毒的方法。

重组酶介导扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)，是一种利用重组酶、单链结合蛋白(SSB)、DNA聚合酶在等温条件下进行的核酸扩增技术。它具有恒温且温度低(35-45℃)、快速(5-30 分钟内)、扩增效率高的特点。而且当模板为RNA时，只需加入逆转录酶即可进行扩增。具体过程为：重组酶首先与引物形成聚合体扫描双链DNA，在与引物同源的序列处使双链DNA解旋。在单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，使引物和模板之间发生链替换，新的DNA片段可以在体外快速地扩增出来。并在单链结合蛋白以及缩合剂聚乙二醇存在的条件下，不断重复这一过程而最终实现核酸的高效扩增，5-30分钟之内就可以将目的基因扩增放大几百万倍，达到检测仪器的检测下限水平。在以往的RAA研究中，RAA检测技术的一个缺点是其不包含内参。对不含内参的反应，可能会由于体系配制不当、反应温度不合适、样品中存在抑制剂等因素造成假阴性结果。本发明利用RAA技术进行EV71病毒的检测，通过引入竞争性内参(共用一对引物扩增靶序列及内参序列，采用不同荧光标记的探针分别指示靶序列和内参序列的扩增)，避免假阴性结果的出现，实现了对反应体系及反应过程的监测，进一步确保了检测结果的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测结果准确、无假阴性的灵敏、特异、快速的检测肠道病毒EV71型C4a亚型的方法。

为实现上述目的，发明人根据EV71病毒VP1基因序列，寻找高度保守序列，经对比和筛选获得适用于检测肠道病毒EV71型C4a 亚型的靶序列；并经大量的筛选和优化，针对该靶序列设计了适用于等温核酸扩增技术的特异性引物对和靶探针；同时，为避免假阴性检测结果的出现，发明人进一步设计了含有非人类基因组序列和靶序列的竞争性内参DNA和针对该内参DNA的内参探针。

经过对比和筛选，本发明首先提供一条用于检测肠道病毒EV71 型C4a亚型的靶序列，其具有SEQ ID NO.6所示的序列或其特异性片段。

上述靶序列在GenBank登录号KY074643.1公开的序列第 3026-3224nt位。

根据上述靶序列精心设计了特异性引物对和靶探针，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-3所示。

上述引物和靶探针适用于检测肠道病毒EV71型C4a亚型。

优选地，本发明所述的靶探针的类型为exo探针。

所述exo探针为在探针中间位置临近的两个T碱基上分别标记荧光基团和淬灭基团。

进一步优选地，所述exo探针为分别于四氢呋喃(THF)两侧标记荧光基团(dT-荧光基团)和淬灭基团(dT-淬灭基团)，且两基团之间相距约2-5bp。

进一步地，本发明设计的内参DNA为非人类基因组序列的重组 DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

针对上述内参DNA，本发明设计的内参探针的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示。

优选地，所述内参探针的类型为exo探针。

所述exo探针为在探针中间位置临近的两个T碱基上分别标记与所述靶探针的荧光颜色不同的荧光基团和淬灭基团。

进一步优选地，所述exo探针为分别于四氢呋喃(THF)两侧标记与靶探针荧光颜色不同的荧光基团(dT-荧光基团)和淬灭基团 (dT-淬灭基团)，且两基团之间相距约2-5bp。

本发明提供了所述的靶序列在采用等温核酸扩增技术检测肠道病毒EV71型中的应用。

具体地，本发明提供了适用于等温核酸扩增技术检测肠道病毒EV71型C4a亚型的引物探针组合，该组合含有一对特异性引物对和一条靶探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述靶探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，本发明的引物探针组合还含有一条内参DNA和一条内参探针，所述内参DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了所述引物探针组合在制备快速检测肠道病毒 EV71型的试剂盒中的应用。

进一步，本发明提供了含有所述引物探针组合的快速检测肠道病毒EV71型的试剂盒。

本发明实施例中，本发明提供的快速检测肠道病毒EV71型的试剂盒含有等温核酸扩增体系，该体系具体配置如下：

该体系中，靶探针和内参探针分别标记荧光色不同的荧光基团，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、 TAMRA、VIC。

优选地，所述靶探针的荧光基团为FAM，所述内参探针的荧光基团为HEX。

为便于保存和使用，上述等温核酸扩增体系可以经冷冻干燥制备为粉末状。

上述粉末状的等温核酸扩增体系在使用时可采用终浓度为6％ (w/v)、分子量为35000的聚乙二醇水溶液溶解后作为扩增体系。

所述试剂盒在工作时，在等温核酸扩增体系中加入样品RNA和内参DNA，混合均匀后进行等温核酸扩增检测，扩增检测温度为 35-45℃，优选42℃，扩增检测时间为15-30min，优选30min。

本发明还提供一种适用于等温核酸扩增方法检测目标生物的内参DNA，该内参DNA由非人类基因组DNA片段和检测目标生物的靶序列重组而成，所述目标生物的靶序列为所设计的特异性引物对扩增目标生物靶片段的序列，用非人类基因组序列替换靶序列中的靶探针结合区得到。

优选地，当所述目标生物为肠道病毒EV71型C4a亚型时，所述内参DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在进行肠道病毒EV71型C4a亚型检测时，本发明提供的如SEQ ID NO.5所示的内参DNA为重组DNA，由植物病毒片段和靶标片段(EV71型C4a亚型的靶片段)组成。重组DNA保留了与本发明 EV71型C4a亚型的特异性引物对(SEQ ID NO.1-2)配对结合的靶序列，并以靶标片段上的其他序列作为主干，而只有与EV71探针 (SEQ ID NO.3)结合的区域被所述植物病毒片段所替换。在这种情况下，除了探针结合区有差异外，重组DNA序列与EV71靶标的引物和模板序列完全相同，随后该重组DNA片段构建成质粒作为竞争性内参DNA。

结果判读：将反应管中置于恒温荧光检测仪或荧光PCR仪中，实时读取荧光信号，根据EV71靶标和内参DNA检测结果进行判断：

EV71靶标和内参DNA检测结果均出现扩增荧光信号，检测结果为阳性；

EV71靶标检测结果未出现扩增荧光信号，内参DNA检测结果出现扩增荧光信号，检测结果为阴性；

EV71靶标检测结果出现扩增荧光信号，内参DNA检测结果未出现扩增荧光信号，检测结果为阳性；

EV71靶标和内参DNA检测结果均未出现扩增荧光信号，检测结果可能为假阴性，建议重复实验或重新提取RNA进行检测。

本领域技术人员可以理解，基于非疾病诊断目的，本发明还提供了一种快速检测肠道病毒EV71型的含内参双重等温核酸扩增方法，以本发明上述EV71型C4a亚型特异性引物和探针对待测样品模板RNA进行等温核酸扩增检测；以本发明上述内参探针对上述内参DNA进行等温核酸扩增检测。本发明所提供双重的检测肠道病毒 EV71型的方法，通过筛选获得各亚型之间保守性高且具有高度 EV71型特异性的检测靶序列，并针对该靶序列设计了扩增效率高、特异性高的引物和靶探针序列，同时为排除假阴性和无效结果，引入竞争性内参DNA和用于扩增内参DNA的内参探针，由此提供了一种具有高度特异性、灵敏度和重复性的肠道病毒EV71的高效检测试剂盒和检测方法。此外，本发明提供的检测试剂盒和方法具有实际成本低廉、仪器设备简单、检测时间短、无需高温变温的条件、并且对检测材料质量和对操作人员的技术要求低等优势，适用于大批量样品的检测，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为实施例1筛选最佳引物探针组合实验结果图，图中1指代SEQ ID NO.1，2，3组合的扩增荧光信号；2指代SEQ ID NO.1， 9，3组合的扩增荧光信号；3指代SEQ ID NO.7，2，3组合的扩增荧光信号；4指代SEQ ID NO.7，9，3组合的扩增荧光信号；5指代 SEQ ID NO.8，2，3组合的扩增荧光信号；6指代SEQ ID NO.8，9， 3组合的扩增荧光信号；阴性：阴性对照。

图2A-图2B为实施例2的方法对EV71和内参DNA的实时荧光检测扩增曲线图，图2A为EV71阳性扩增荧光信号图，图2B为图2A相对应的内参DNA扩增荧光信号图。

图3A-图3B为实施例3的方法对EV71和内参DNA的实时荧光检测扩增曲线图，图3A为EV71阳性扩增荧光信号图，图3B为图3A相对应的内参DNA的扩增荧光信号图。

图4A-图4B为实施例4的方法对EV71和内参DNA的实时荧光检测扩增曲线图，图4A为EV71阳性扩增荧光信号图，图4B为图4A相对应的内参DNA的扩增荧光信号图。

图5A-图5B为本发明实施例5中试剂盒检测EV71的灵敏度实验结果图，图5A代表不同浓度的EV71重组质粒标准品实时荧光定量RAA扩增荧光信号图，图5B为图5A中不同浓度的EV71重组质粒标准品相对应的内参DNA扩增荧光信号图。

图6A-图6B为本发明实施例5中试剂盒检测EV71的特异性实验结果图，其中，图6A为EV71以及其它肠道病毒的扩增荧光信号图，图6B为图6A中不同病毒相对应的内参DNA的扩增荧光信号图。

图7A-图7B为本发明实施例5中试剂盒检测EV71的特异性实验结果图，图7A为EV71以及其它肠道病毒的扩增荧光信号图，图 7B为图7A中不同病毒相对应的内参DNA扩增荧光信号图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1适用于等温核酸扩增检测肠道病毒EV71型的特异性引物对、靶探针、内参探针的设计和确定

下载中国EV71病毒全基因组序列，进行序列比对，寻找同源性高的保守区域，确定一条适用于检测EV71型C4a亚型的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。在该保守区域设计多条特异性引物和靶探针。

RAA引物设计原则：一是引物长度，RAA引物比典型的PCR引物更长，一般要求为30-35bp；二是引物序列，5’端(3-5bp)避免出现重复G，最好为C或T；3’端(后3个碱基)最好有G和C；GC含量不要大于70％或小于30％；引物间避免形成二级结构、引物二聚体等。

RAA探针设计原则：RAA荧光探针(exo探针)主要包括四个特殊部分，3′末端的阻断物(通常为C3-spacer)，脱碱基核苷酸类似物 (四氢呋喃[THF]残基，有时称为“dSpacer”)及位于THF两侧的荧光基团(dT-荧光基团)和淬灭基团(dT-淬灭基团)，且两基团之间相距约2-5bp。探针一般为46-52个碱基，5’端到THF位点至少要30个碱基，THF位点到3’端至少要15个碱基。

本发明经过大量实验发现并非只要满足上述引物、探针设计原则所设计出的引物、探针进行扩增效果就必然好，在研究对比中，本发明发现有非常符合上述设计原则的引物探针组合并没有出现很好的扩增效果，反倒是不符合以上引物探针设计原则的引物探针组合反而扩增的效果很好。因此在满足上述一般设计原则的基础上，本发明进行了优化设计和大量引物探针组合的筛选对比，以下为本申请设计的大量候选引物探针组合的部分罗列及效果说明。

候选的引物核苷酸序列见SEQ ID NO.1-4，7-9(Y，W，R为简并碱基，Y＝C/T，W＝A/T，R＝A/G)。使用EV71阳性临床样本筛选灵敏度高、特异性好的最佳引物和探针组合，根据起峰时间和荧光强度进行筛选，筛选结果如图1所示。

正向引物序列：

5’-CCTGCGAGTGCTTACCAATGGTTTTATGACGG-3’，(SEQ ID NO.1)

5’-CGAGTGCTTACCAATGGTTTTATGACGGATA-3’，(SEQ ID NO.7)

5’-TTTATGACGGATATCCCACATTCGGAGAACACA-3’(SEQ ID NO.8)

反向引物序列：

5’-GTATCCACGCCCTGACGTGCTTCATTCTCAT-3’(SEQ ID NO.2)。

5’-TAAATCCTAAYCACTAAAGGGTACTTGGACTT-3’(SEQ ID NO.9)。

靶探针序列为：5’-AACATGATGGGCACGTTCTCA GTGCGGACTGTGGGGACCTCCAAGTC-3’(SEQ ID NO.3)

内参探针序列为：5’-GTAAGGTGCTAGACTAAAATTGTTGG GACTTTGAATCTCTGAAGTAAAAGG-3’(SEQ ID NO.4)

对以下引物探针组合进行检测和筛选：

第1组：SEQ ID NO.1，2，3组合；

第2组：SEQ ID NO.1，9，3组合；

第3组：SEQ ID NO.7，2，3组合；

第4组：SEQ ID NO.7，9，3组合；

第5组：SEQ ID NO.8，2，3组合；

第6组：SEQ ID NO.8，9，3组合；

在图1可以看出，在相同的条件下，SEQ ID NO.1，2，3的引物探针组合，阳性阈值时间及荧光信号值优于其他组合，阳性阈值时间早，荧光强度高，因此本发明将该组合选为最佳引物探针组合。最终确定本发明适用于等温核酸扩增方法的检测肠道病毒EV71的引物和探针如下：

正向引物序列：5’-CCTGCGAGTGCTTACCAATGGTTTTAT GACGG-3’，(SEQ ID NO.1)

反向引物序列：5’–GTATCCACGCCCTGACGTGCTTCAT TCTCAT-3’(SEQ ID NO.2)

靶探针序列为：5’-AACATGATGGGCACGTTCTCAGTGCG GACTGTGGGGACCTCCAAGTC-3’(SEQ ID NO.3)

内参探针序列为：5’-GTAAGGTGCTAGACTAAAATTGTTGGGACTTTGAATCTCTGAAGTAAAAGG-3’(SEQ ID NO.4)

实施例2检测肠道病毒EV71型的含内参双重等温核酸扩增方法 (1)

1、样品来源及EV71的RNA提取

病毒样品系湖南省疾病预防控制中心从不同患者收集的含有 EV71活病毒的粪便标本，制备便悬液，离心取上清进行RNA提取，RNA提取采用天隆提取试剂盒，核酸提取设备为天隆全自动核酸提取仪。

2、引物和探针设计

采用实施例1确定的适用于等温核酸扩增方法的检测EV71病毒的引物和探针(SEQID NO.1-4)，其中靶探针标记FAM荧光基团，内参探针标记HEX荧光基团。

3、配制扩增体系

在200μL离心管中按以下的配比进行等温核酸扩增体系配制 (体积为50μL)，体系中各组分浓度如表1所示：

表1等温核酸扩增体系

将以上配制好的扩增体系在冷冻干燥机中负压冷冻干燥成为粉未状扩增体系。上述扩增体系也可现配现用。

4、EV71病毒检测

向离心管中加入终浓度为6％(w/v)、分子量为35000的聚乙二醇作为反应缓冲液将体系重新溶解成为44μl，再加入制备好的 5μL EV71RNA和1μL内参DNA，使用奇天仪器恒温振荡混匀仪均匀混合4min，瞬时离心，放入到可检测FAM和HEX荧光的仪器中，在42℃反应30min。(注：为确保实验准确性，设置不加模板的体系作为阴性对照)。实验结果显示，在3min之后开始显示扩增的荧光信号，且每一个反应管，均检测到内参扩增信号，实现了对反应体系的监控，从而排除了假阴性和无效结果，扩增曲线如图2A- 图2B所示。重复以上扩增实验，能得到相同的扩增荧光信号和扩增曲线，证明实施例2提供的EV71病毒的检测方法具有较好的重复性。

实施例3检测肠道病毒EV71型的含内参双重等温核酸扩增方法 (2)

方法参见实施例2，不同之处在于50μL的等温核酸扩增体系中，靶探针的浓度为120nM，内参探针的浓度为60nM，正、反向引物的浓度分别为420nM，其他参数、步骤与实施例2相同。结果显示，在2min内开始显示扩增的荧光信号，且峰值高。如图3A-图3B所示。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

实施例4检测肠道病毒EV71型的含内参双重等温核酸扩增方法 (3)

方法参见实施例2，不同之处在于50μL的等温核酸扩增体系中，靶探针的浓度为120nM，内参探针的浓度为120nM，正、反向引物的浓度分别为420nM，其他参数、步骤与实施例2相同。结果显示，在1min内开始显示扩增的荧光信号。如图4A-图4B所示。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

实施例5本发明检测方法的灵敏度、特异度及检出限评价 1、灵敏度评价(或检测下限评价)

使用EV71型C4a亚型重组质粒标准品进行灵敏度的评估，将重组质粒标准品进行倍比稀释(10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰拷贝/反应)，每个稀释度浓度重复8次实验，统计分析结果显示该方法的95％检测限约55拷贝/反应。通过灵敏度实验确定内参DNA 的最佳浓度为50拷贝/反应，在该内参DNA浓度下，EV71检测灵敏度不受影响。灵敏度效果图见图5A-图5B。

2、特异度评价

利用其他常见肠道病毒标本参照实施例2-4的方法进行特异性评估，包括柯萨奇病毒CA16、CA10、CA6、CA5、CA9、CA24、 CB2、CB4；脊髓灰质炎病毒PV2、PV3、肠道病毒14型、埃可病毒30型等。检测结果显示，本发明提供的方法只能特异性检测肠道病毒EV71型C4a亚型，并不与其他病毒发生交叉反应。特异性图见图6A-图6B；图7A-图7B。

综上所述，本发明提供的靶序列、特异性引物、靶探针和内参以及等温核酸扩增方法能够实现快速准确的EV71病毒C4a亚型的检测，具有较高的灵敏度和特异性以及较好的重复性，加入内参能够有效排除假阴性和无效结果，且本发明提供试剂盒和检测方法具有实际成本低廉、仪器设备简单、无需高温变温的条件、对检测材料质量要求低等优势，适用于大量样品的快速检测和筛选，便于临床应用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所江苏奇天基因生物科技有限公司

<120> 一种快速检测肠道病毒EV71型的含内参双重等温核酸扩增方法

<130> KHP191110998.9

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctgcgagtg cttaccaatg gttttatgac gg 32

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtatccacgc cctgacgtgc ttcattctca t 31

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacatgatgg gcacgttctc agtgcggact gtggggacct ccaagtc 47

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaaggtgct agactaaaat tgttgggact ttgaatctct gaagtaaaag g 51

<210> 5

<211> 199

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgcgagtg cttaccaatg gttttatgac ggatatccca cattcggaga acacaaacag 60

gagaaaggta aggtgctaga ctaaaattgt tgggactttg aatctctgaa gtaaaagggg 120

actgtgggga cctccaagtc taagtaccct ttagtagtta ggatctacat gagaatgaag 180

cacgtcaggg cgtggatac 199

<210> 6

<211> 199

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctgcgagtg cttaccaatg gttttatgac ggatatccca cattcggaga acacaaacag 60

gagaaagatc ttgaatacgg ggcatgtcct aataacatga tgggcacgtt ctcagtgcgg 120

actgtgggga cctccaagtc taagtaccct ttagtagtta ggatctacat gagaatgaag 180

cacgtcaggg cgtggatac 199

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgagtgctta ccaatggttt tatgacggat a 31

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttatgacgg atatcccaca ttcggagaac aca 33

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taaatcctaa ycactaaagg gtacttggac tt 32

Claims

1.一种用于检测肠道病毒EV71型C4a亚型的靶序列，其具有SEQ ID NO.6所示的序列或其特异性片段。

2.权利要求1所述的靶序列在采用等温核酸扩增技术检测肠道病毒EV71型C4a亚型中的应用。

3.适用于等温核酸扩增技术检测肠道病毒EV71型C4a亚型的引物探针组合，其特征在于，含有一对特异性引物对和一条靶探针，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示，所述靶探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，还含有一条内参DNA和内参探针，所述内参DNA为非人类基因组序列的重组DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.权利要求3或4所述引物探针组合在制备快速检测肠道病毒EV71型C4a亚型的试剂盒中的应用。

6.含有权利要求3或4所述引物探针组合的快速检测肠道病毒EV71型C4a亚型的试剂盒。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，含有等温核酸扩增体系如下：

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，靶探针和内参探针分别标记荧光色不同的荧光基团，所述荧光基团包括FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA、VIC；所述试剂盒在工作时，在等温核酸扩增体系中加入样品RNA和内参DNA，混合均匀后进行等温核酸扩增检测，扩增检测温度为35-45℃，优选42℃，扩增检测时间为15-30min，优选30min。

9.一种适用于等温核酸扩增方法检测目标生物的内参DNA，其特征在于，该内参DNA由非人类基因组DNA片段和检测目标生物的靶序列重组而成，所述目标生物的靶序列为所设计的特异性引物对扩增目标生物靶片段的序列，用非人类基因组序列替换靶序列中的靶探针结合区得到；

10.一种快速检测肠道病毒EV71型C4a亚型的含内参双重等温核酸扩增方法，其特征在于，以权利要求4所述引物探针组合中的特异性引物对和靶探针对待测样品模板RNA进行等温核酸扩增检测，以权利要求4所述引物探针组合中的内参探针对内参DNA进行等温核酸扩增检测。