CN109355432A - 肠道病毒ev71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增引物、检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于病原分子检测领域，涉及肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增引物、检测方法及试剂盒。根据肠道病毒EV71型特异性基因VP1的序列设计特异引物,建立了EV71等温逆转录重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法，最低可检测到100 copies的病毒RNA，并且具有良好的特异性，检测速率高，仅需30分钟即可得到结果；实用性强，不需要昂贵的精密仪器。
Description
技术领域
本发明属于病原分子检测领域，涉及肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测方法及试剂盒。
背景技术
肠道病毒71型（Human enterovirus 71, EV71）是小RNA病毒科，肠道病毒属成员，是手足口病（hand-foot and mouth disease, HFMD）的主要病原体之一。1969年，EV71首次在美国加利福尼亚分离到并确定为一种新的肠道病毒。其后，EV71在全球范围内相继被发现和鉴定。EV71引起的手足口病一年四季均可发病，但夏秋季多发，好发于5岁以下儿童，多为自限性疾病，但少数能够导致严重的神经系统疾病，如无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质样麻痹，甚至能够引起致命的神经源性肺水肿。因此，早期诊断、及时治疗是有效减少EV71危害的有效方法。
重组酶聚合酶恒温扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），英国TwistDx Inc公司开发的被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA 上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA 结合蛋白的帮助下使模板DNA 解链，引物于模板DNA 开始配对，并在DNA 聚合酶的作用下复制延伸。该方法主要具备以下优点：(1) 仅需1 对引物即可完成扩增，不需要太复杂的引物设计过程；(2) 只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；(3) 反应时间仅需40 min；(4) 结果易于判断，不像LAMP 产物的弥散带，ＲPA 扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。
发明内容
本发明提供一种快速检测、特异性好、结果准确的肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增法检测方法和试剂盒
本发明技术方案如下：
用于肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增引物，其特征在于：根据该菌特异性基因VP1的序列的六个区域设计特异引物，所述引物如下：
上游引物EV71-F1，序列为： SEQ ID NO.1;
下游引物EV71-R1，序列为：SEQ ID NO.2;
进一步地，肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物及以下试剂：阴性对照品、阳性对照品、、冻干酶粉、反应液及醋酸镁溶液。
进一步地，根据权利要求2所述的肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为生理盐水
进一步地，所述的肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品为重组质粒pUC57，含有目的基因VP1，基因序列为SEQ ID NO.11所示。
进一步地，所述的肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品的浓度为105 copies/ml
进一步地，所述的肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测方法，包括以下步骤：
(1) 肠道病毒EV71型RNA提取：采用通用型病毒RNA 提取试剂盒提取EV71 病毒RNA 用于检测或保存于-70℃以待检测；
(2) 等温逆转录重组酶聚合酶扩增反应体系为：将2 .4μL正向引物、2 .4μL反向引物、2μL RNA样品、11 .2μL无DNase 和RNase 水和29 .5μL反应液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0 .2mL的反应管中，然后将2 .5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，充分混匀后37℃扩增30min；
(3) 等温逆转录重组酶聚合酶扩增反应产物分析：扩增产物纯化后如果得到230bpDNA片段则证明所测样品中含有肠道病毒EV71型。
附图说明
图1 为用于等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测体系最佳引物的筛选，5对不同引物用于RPA扩增之后的凝胶电泳图（M：DL2000 DNA Marker；CK-：阴性对照样本；1-5分别为不同的引物对）；
图2 肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测灵敏度试验结果图（M：DL2000DNA Marker；CK+：阳性对照样本；100-105 copies：不同拷贝数的模板）；
图3肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测特异性试验结果图（CK+：阳性对照样本；1-6分别为：乙型肝炎病毒、柯萨奇病毒、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I和II。
具体实施例
【实施例 1】靶标选择、引物设计及筛选
（1）靶标选择及引物设计
通过NCBI数据库查找多对来源于国内的肠道病毒EV71型的基因序列，通过DNAMAN比对，选择VP1基因的保守序列作为靶标，具体为将目的基因片段合成后构建的质粒( 南京金斯瑞生物科技有限公司合成)作为阳性质粒，在后续引物探针筛选、扩增灵敏度以及特异性过程中作为模板使用。根据RPA引物及探针设计原则，设计5对引物，引物序列及扩增长度如表1所示：
表1 RPA引物对及扩增长度
（2）引物筛选
人工合成含有VP1基因的保守序列的阳性质粒，以此质粒为模板，将5组引物分别进行在37℃ 条件下进行RPA扩增，以琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的长度及扩增效率，筛选出在37℃ 条件下，扩增效率最高的引物对，用于后续RPA检测的评价和应用。
扩增反应体系为：将2 .4μL正向引物、2 .4μL反向引物、2μL RNA样品、11 .2μL无DNase 和RNase 水和29 .5μL反应液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0 .2mL的反应管中，然后将2 .5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，充分混匀后37℃扩增30min。
【实施例 2】肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒组成及检测方法；
（1）肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，包括上面所述的最佳引物及以下试剂：阴性对照品、阳性对照品、冻干酶粉、反应液及醋酸镁溶液；
（2）肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测方法
(1) 肠道病毒EV71型RNA提取：采用通用型病毒RNA 提取试剂盒提取EV71 病毒RNA 用于检测或保存于-70℃以待检测；
(2) 等温逆转录重组酶聚合酶扩增反应体系为：将2 .4μL正向引物、2 .4μL反向引物、2μL RNA样品、11 .2μL无DNase 和RNase 水和29 .5μL反应液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0 .2mL的反应管中，然后将2 .5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，充分混匀后37℃扩增30min；
(3) 等温逆转录重组酶聚合酶扩增反应产物分析：扩增产物纯化后后如果得到230bpDNA片段则证明所测样品中含有肠道病毒EV71型。
【实施例 3】肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增灵敏度检测
（1）阳性质粒标准品制备
阳性对照的构建方法是采用PCR 方法对合成序列质粒为模板进行扩增，得到所需的基因序列，序列片段经双酶切后与相应双酶切pUC57质粒载体进行连接，用氯化钙法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，并测序验证后获得阳性对照样品。使用NanoDrop Lite分光光度计计算质粒浓度，并计算拷贝数，拷贝数计算公式为：(6.02×1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml。以10倍的梯度稀释阳性对照质粒，稀释为100～105 copies/ml 6个稀释梯度作为灵敏度测试模板；
（2）灵敏度检测
分别以100～105 copies/ml 6个浓度梯度阳性质粒为模板，使用筛选的最佳引物对在37℃条件下进行RPA扩增，扩增产物纯化后后通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增的效率；
【实施例 3】肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增特异性检测
以EV71，乙型肝炎病毒、柯萨奇病毒、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I和II，按照本试剂盒提供的方法，提取核酸，进行等温逆转录重组酶聚合酶扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
序列表
<110> 重庆高圣生物医药有限责任公司
<120> 肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增引物、检测方法及试剂盒
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
cacgttctca gtgcggactg tggggacctc caagtcca 38
<210> 11
<211> 430
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
actaacccaa atggttatgc caactgggac atagatataa caggttacgc gcaaatgcgt 60
agaaaggtag agctattcac ctacatgcgc tttgatgcag agttcacttt tgttgcgtgc 120
acacccaccg gggaagttgt cccacaattg ctccaatata tgtttgtgcc acctggagcc 180
cctaagccag attctaggga atcccttgca tggcaaaccg ccactaaccc ctcagttttt 240
gtcaagctgt cagaccctcc agcgcaggtt tcagtgccat tcatgtcacc tgcgagtgct 300
tatcaatggt tttatgacgg atatcccaca ttcggagaac acaaacagga gaaagatctt 360
gaatacgggg catgtcctaa taacatgatg ggcacgttct cagtgcggac tgtggggacc 420
tccaagtcca 430
Claims (6)
1.用于肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增引物，其特征在于：根据该菌特异性基因VP1的序列的六个区域设计特异引物，所述引物如下：
上游引物EV71-F1，序列为： SEQ ID NO.1;
下游引物EV71-R1，序列为：SEQ ID NO.2。
2.肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物及以下试剂：阴性对照品、阳性对照品、、冻干酶粉、反应液及醋酸镁溶液。
3.根据权利要求2所述的肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为生理盐水。
4.根据权利要求2所述的肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品为重组质粒pUC57，含有目的基因VP1，基因序列为SEQ IDNO.11所示。
5.根据权利要求2所述的肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品的浓度为105 copies/ml。
6.肠道病毒EV71型等温逆转录重组酶聚合酶扩增检测方法，包括以下步骤：
(1) 肠道病毒EV71型RNA提取：采用通用型病毒RNA 提取试剂盒提取EV71 病毒RNA 用于检测或保存于-70℃以待检测；
(2) 等温逆转录重组酶聚合酶扩增反应体系为：将2 .4μL正向引物、2 .4μL反向引物、2μL RNA样品、11 .2μL无DNase 和RNase 水和29 .5μL反应液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0 .2mL的反应管中，然后将2 .5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，充分混匀后37℃扩增30min；
(3) 等温逆转录重组酶聚合酶扩增反应产物分析：扩增产物纯化后如果得到230bpDNA片段则证明所测样品中含有肠道病毒EV71型。
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