CN115216562A - 基于crispr系统进行71型肠道病毒的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，包括如下步骤：步骤一，以待测样品中EV71病毒核酸样本为模板，利用反转录等温扩增技术扩增目标片段，得到扩增产物；步骤二，向扩增产物中加入Cas12a/crRNA复合物，在crRNA介导下进行特异性切割反应；步骤三，在步骤二反应后的反应体系中加入含有DNA探针的缓冲液进行孵育，得到待测反应液；将待测反应液滴加至胶体金试纸条样品垫上，观察检测线和质控线的显色情况，判断是否含有待测病原。本发明还公开了一种71型肠道病毒的检测试剂盒。该检测方法和试剂盒可实现对71型肠道病毒的快速检测，具有特异性好、灵敏度高和检测成本低等特点。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，特别涉及一种基于CRISPR系统进行71 型肠道病毒的检测方法及试剂盒。
背景技术
手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease，HFMD)是由肠道病毒引发的 常见儿童传染病，常发于五岁以下儿童，以发热、口腔溃疡、手、脚及臀部 的水疱性皮疹为主要表现，一年四季均可发病，尤以夏秋季节最为多见，是 世界范围内流行范围较广的学龄前儿童常见急性传染病，具有传播速度快， 传染率高等特点，易导致聚集性疫情出现。HFMD的传染源包括患者、病毒 携带者及隐性感染者，其中隐性感染者在疾病散发期间还是重要的传染源。 由于患者唾液、粪便及疱疹液中均含有大量病毒，可通过呼吸道、消化道及 密切接触等方式迅速传播。
HFMD由肠道病毒引起；引发HFMD的肠道病毒有20多种，主要为柯 萨奇病毒(Coxasckie virus：A组4、5、7、9、10、16型，B组2、5、13型)， 埃可病毒(ECHO viruses)和肠道病毒68-71型(EV68-71)。其中，以EV71 及柯萨奇病毒A16型(CA16)最为常见。EV71感染与CA16感染在HFMD 流行期间交替出现，或共同存在，成为HFMD的主要病原学因素。在诊断HFMD病例的病原学因素中，EV71占44％，CA16占25％。其中，重症病例 中EV71阳性占74％，死亡病例中EV71阳性占93％。因此，EV71是导致HFMD 重症和死亡的主要病原。
EV71感染常导致严重的神经系统症状。病毒从咽部或肠道侵入后，在局 部黏膜或淋巴组织中繁殖；病毒可引起局部症状，继而又侵入淋巴结，并由 此进入血液循环，导致病毒血症。病毒经血循环侵入网状内皮组织、深层淋 巴结、肝、脾、骨髓等处大量繁殖并由此进入血液循环，再次引起病毒血症。 此后，病毒随血流进入全身各器官，如中枢神经系统、皮肤黏膜、心脏等处， 进一步繁殖并引起病变。感染EV71后，出现血管变态反应和组织炎症病变。 当病毒累及中枢神经系统时，组织炎症较神经毒性作用更加强烈，中枢神经 系统小血管内皮最易受到损害。细胞融合、血管炎性病变、血栓形成可导致 缺血和梗死。在脊髓索、脑干、间脑、大脑和小脑的局部组织中，除嗜神经 性作用外，还存在广泛的血管周围和实质性细胞炎症。
EV71感染临床表现特点多样化：从无症状的隐性感染，普通HFMD和 咽峡炎等轻症病例，到神经源性肺水肿和呼吸衰竭等重症患儿，甚至死亡。 诊断肠道病毒EV71型感染目前主要依赖病毒核酸检测和病毒分离培养，部分 基层医院和疾病预防控制中心缺乏相应条件，部分重症病例临床上并无典型 的HFMD表现。所以，在疫情暴发初期重症病例常常难以明确诊断，常被诊 断为肺炎。只有结合病例的流行病学调查、临床表现，特别是实验室检测结 果，才有可能进行明确诊断。目前，检测HFMD的方法主要采用病毒分离培 养、胶体金试纸条、病毒中和试验、RT-PCR和ELISA法等。其中，EV71分 离培养周期长、价格昂贵、灵敏度低、对设备要求高。胶体金试纸条法虽然 简单快捷，但灵敏度稍低。RT-PCR灵敏度和特异性均较高，且采样方便、检 测时间较短，可作为EV71早期感染的诊断。但此方法对实验环境和操作人员 要求高，不利于基层医院开展。ELISA是目前主要的检测方法，经济、方便。 特别适用于基层对HFMD中EV71型和CA16型防控第一线需求。但感染初 期产生抗体IgM存在个体差异。
CRISPR/Cas12a系统是一种新型的CRISPR/Cas系统，具有RNA引导的 DNA酶切割活性，在特异性切割双链DNA(dsDNA：EV71-VP1)的同时能够 激活Cas12a的非特异性单链DNA(ssDNA)剪切活性。利用这一特点可针对 目标DNA人为设计crRNA(CRISPR-derived RNA)与目标DNA中PAM (protospacer-adjacent motif)区附近DNA互补，实现对不同靶标DNA的直接检测。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR系统进 行71型肠道病毒的检测方法及试剂盒，该检测方法和试剂盒具有明显的靶标 普适性，可实现对71型肠道病毒的快速检测，具有特异性好、灵敏度高和检 测成本低等特点。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实 现：
一种非疾病的诊断目的的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方 法，包括如下步骤：
步骤一，以待测样品中EV71病毒核酸样本为模板，利用反转录等温扩增 技术并采用特异性引物扩增目标片段，得到扩增产物；
步骤二，向步骤一所得的扩增产物中加入Cas12a/crRNA复合物，在crR NA介导下进行特异性切割反应；
步骤三，在步骤二反应后的反应体系中加入含有DNA探针的缓冲液进行 孵育，得到待测反应液；将待测反应液滴加至胶体金试纸条样品垫上，等待5 -10min，观察检测线和质控线的显色情况，判断是否含有待测病原；
进一步的，EV71病毒核酸样本为：待测EV71病毒核酸的DNA全长或 片段、待测EV71病毒核酸的PCR产物或恒温扩增产物。
进一步的，所述特异性引物的核苷酸序列如Seq ID NO.2和Seq ID NO. 3所示。
进一步的，cas12a基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
进一步的，crRNA的序列为与待测EV71核酸特异性结合的序列；且cr RNA是针对EV71-VP1的3段保守序列设计得到。
更进一步的，crRNA包含如Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO. 6所示的核苷酸序列。
进一步的，所述DNA探针为FAM基团和Biotin基团双标记的单链DNA 探针；且所述DNA探针的核苷酸序列如Seq ID NO.7所示。
进一步的，步骤一中的扩增反应是在23℃-45℃条件下进行等温扩增10- 15min；步骤二的反应是在37℃条件下反应10-20min；步骤三的孵育过程是 在37℃条件下孵育10-15min。
本发明提供了一种单链DNA探针，其两端分别利用FAM基团和Biotin 基团进行双标记，且其核苷酸序列如Seq ID NO.7所示。
本发明进一步提供了一种71型肠道病毒的检测试剂盒，其包括crRNA、 Cas12a蛋白、10×缓冲液、RNA酶抑制剂、单链DNA探针、试纸条缓冲液 和胶体金试纸条；所述单链DNA探针的两端分别利用FAM基团和Biotin基 团进行双标记，且其核苷酸序列如Seq ID NO.7所示。
该试剂盒中的crRNA包含如Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO. 6所示的核苷酸序列。
本发明的有益效果是：
本发明结合重组酶聚合酶扩增技术将EV71-VP1核酸保守序列进行扩增， 然后利用CRISPR系统进行切割反应，最后通过胶体金试纸条判读反应结果； 更具体的，本发明是将CRISPR/Cas12a系统与胶体金快速诊断试纸条技术结 合，将靶RNA通过恒温重组酶扩增，使得单拷贝级别的痕量RNA至1012倍 的DNA；预扩增后的靶DNA(VP1片段)在crRNA的引导下激活Cas12， 后者继而大批量无差别切割预先带有荧光基团的单链DNA探针，释放荧光信号。带荧光信号的胶体金颗粒可以被胶体金试纸条可视化判读结果。本发明 的方法具有以下优点：可快速识别靶标(一个小时内完成对靶标DNA的识别 鉴定)、高灵敏度(检出下限为5拷贝DNA分子/毫升)、耐生物污染(允许2％ 的为灭活血浆、1％痰液的污染；脱靶荧光信号<0.22％)、价格低廉(对终端 用户友好，扩展性佳)，具有广阔的应用前景。
本发明中的crRNA是依据Cas12a识别PAM序列的特性，并针对EV71- VP1的3段保守序列进行设计得到，可以扩大EV71的阳性检出率，提高本发 明检测方法的灵敏度、特异度和检测效率。
本发明的单链DNA探针具有针对CRISPR-cas12a检测系统的底物探针的 广谱性。
本发明的试剂盒具有明显的靶标普适性，可实现对71型肠道病毒的快速 检测，且检测过程较为便捷、高效，针对样本核酸一步即可完成检测，检测 仅需45-60分钟，便于基层的快速检测；本发明的检测方法仅需提供37-45℃ 的条件即可完成全部反应，且可通过胶体金试纸条可视化判读结果，具备特 异性好、灵敏度高和检测成本低等特点，适合条件较为简单的卫生机构或居 家检测。
附图说明
图1为Cas12a蛋白经过色谱纯化后的SDS-PAGE结果；经本发明纯化所 得Cas12a蛋白上样1μl；结果显示，经过纯化的Cas12a蛋白纯度达到了90％ 以上；
图2为本发明检测方法的检测原理图；A，RT-RPA大量扩增EV71病毒 样本、cas12a蛋白对RT-RPA核酸产物进行特异性切割；B，试纸条阴性和阳 性结果判读。
图3为本发明利用特异性引物扩增EV71病毒核酸的效果图，即RT-RPA 扩增与普通PCR效果对比图；
图4为本发明中cas12a特异性切割EV71-VP1结果；其中，3条crRNA 分别引导Cas12a蛋白将VP1特异性切割成多个片段。其中，1是对照；2是 特异性切割结果；
图5为本发明检测方法对不同浓度的EV71病毒核酸的检测结果，1～7检 测灵敏度分别为10μg/μl、1μg/μl、0.1μg/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl和0.0 1ng/μl。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下 所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应理解，下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种试剂，均为常见市销 产品。
步骤1，Cas12a蛋白的表达和纯化
经过密码子优化的Cas12a全长基因(SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列) 经双酶切，插入pET28载体中，得到重组克隆质粒pET28-N-His-cas12a。将 上述质粒转化BL21感受态细胞，挑取单克隆、大量培养并诱导蛋白表达。将 发酵液离心收集菌体后，均质机破碎菌体；离心取上清后，分别使用Ni2+-NT A和分子筛(Superdex200)纯化cas12a蛋白，利用SDS-PAGE检测纯化后的Cas12a蛋白，其检测结果如图1所示。
步骤2.crRNA的设计与体外转录
CRISPR-Cas12a检测方法的核心在于crRNA的设计，crRNA质量直接决 定该检测方法的灵敏度、特异度和检测效率。根据Cas12a识别PAM序列的 特性，找出针对NCBI中EV71-VP1的3段保守序列，获得在PAM序列后的 20-40bp的靶点序列。根据体外转录及crRNA的设计，合成以下转录模板。3 条双链DNA模板核苷酸序列如表1所示：
表1 crRNA体外转录模板序列表
将1μg上述双链核苷酸序列作为转录模板，加入体外转录体系中，体外 转录获得crRNA，体外转录体系如表2所示。
表2体外转录体系
按上表将上述组分加入离心管中，混匀并离心，转录反应程序：37℃3 小时，即可获得crRNA。crRNA包括如Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq I D NO.6所示的核苷酸序列。
步骤3.Cas12a+crRNA复合物的制备
将纯化的cas12a蛋白与上述体外转录的3条crRNA按照比例(1:1.1:1.1: 1.1)混合，于37℃孵育10min，获得Cas12a+crRNA复合物。
步骤4.RT-RPA大量扩增EV71-VP1
根据EV71-VP1序列，设计EV71病毒核酸dsDNA扩增引物对(F/R)， 如下表3所示。
表3 EV71扩增引物序列
将上下游引物、EV71病毒样本及其他组分加入扩增反应体系中进行RT- RPA。RT-RPA大量扩增体系具体如下表4所示。
表4 RT-RPA扩增体系
| 成分 | 体积(μl) |
| 2×reaction buffer | 10 |
| dNTPs | 2 |
| 10×E-basic mix | 2 |
| EV71-RPA-F(上游引物) | 1 |
| EV71-RPA-R(下游引物) | 1 |
| MgOAC | 1 |
| 20×core mix | 1 |
| EV71病毒样本 | 0.5 |
| Nuclease-Free Water | UP to 20μl |
按上表将上述组分加入离心管中，混匀并离心，反应程序：37℃条件下 孵育10-20min，即可获得大量DNA扩增产物。
步骤5.CRISPR-Cas12a检测
CRISPR-Cas12a检测体系配置如下表5所示。
表5 CRISPR-Cas12a检测体系
| 成分 | 体积(μl) |
| Cas12a/crRNA | 2 |
| 10×reaction buffer | 4 |
| RPA扩增后DNA产物 | 20 |
| Nuclease-Free Water | UP to 40μl |
按上表将上述组分加入离心管中，混匀并离心。反应程序：37℃放置10- 20min，可获得第一反应液。
在上述第一反应液体系中加入含有DNA探针的胶体金试纸条缓冲液，3 7℃条件下孵育5-10min后，得到第二反应液，即为待测反应液；其中，该D NA探针的核苷酸序列如下表6所示。
表6 DNA探针序列
| 名称 | 序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| DNA探针 | FAM/TTTTTTTTTTT/Biotin | 7 |
将待测反应液滴加至胶体金试纸条样品垫上，等待5-10min，观察检 测线(Test线，T线)和质控线(Control，C线)的显色情况，判断是否 含有待测病毒/核酸。
步骤6.CRISPR-Dx结果判读
EV71病毒核酸检测结果的判读标准如下：
(a)阴性(即正常人)：试纸条下方只有一条控制线条带显色。
(b)阳性(即患者)：试纸条下方和上方两条控制线和检测线条带均 显色。
针对不同浓度的EV71病毒核酸样本进行检测，检测结果如图5所示。
以上前述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上 的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。 任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况 下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的 变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技 术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、 等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 斯慧生物科技（吉林）有限公司
<120> 基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法及试剂盒
<130> 2022
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3687
<212> DNA
<213> Cas12a
<400> 1
atgagcaagc tggagaagtt tacaaactgc tactccctgt ctaagaccct gaggttcaag 60
gccatccctg tgggcaagac ccaggagaac atcgacaata agcggctgct ggtggaggac 120
gagaagagag ccgaggatta taagggcgtg aagaagctgc tggatcgcta ctatctgtct 180
tttatcaacg acgtgctgca cagcatcaag ctgaagaatc tgaacaatta catcagcctg 240
ttccggaaga aaaccagaac cgagaaggag aataaggagc tggagaacct ggagatcaat 300
ctgcggaagg agatcgccaa ggccttcaag ggcaacgagg gctacaagtc cctgtttaag 360
aaggatatca tcgagacaat cctgccagag ttcctggacg ataaggacga gatcgccctg 420
gtgaacagct tcaatggctt taccacagcc ttcaccggct tctttgataa cagagagaat 480
atgttttccg aggaggccaa gagcacatcc atcgccttca ggtgtatcaa cgagaatctg 540
acccgctaca tctctaatat ggacatcttc gagaaggtgg acgccatctt tgataagcac 600
gaggtgcagg agatcaagga gaagatcctg aacagcgact atgatgtgga ggatttcttt 660
gagggcgagt tctttaactt tgtgctgaca caggagggca tcgacgtgta taacgccatc 720
atcggcggct tcgtgaccga gagcggcgag aagatcaagg gcctgaacga gtacatcaac 780
ctgtataatc agaaaaccaa gcagaagctg cctaagttta agccactgta taagcaggtg 840
ctgagcgatc gggagtctct gagcttctac ggcgagggct atacatccga tgaggaggtg 900
ctggaggtgt ttagaaacac cctgaacaag aacagcgaga tcttcagctc catcaagaag 960
ctggagaagc tgttcaagaa ttttgacgag tactctagcg ccggcatctt tgtgaagaac 1020
ggccccgcca tcagcacaat ctccaaggat atcttcggcg agtggaacgt gatccgggac 1080
aagtggaatg ccgagtatga cgatatccac ctgaagaaga aggccgtggt gaccgagaag 1140
tacgaggacg atcggagaaa gtccttcaag aagatcggct ccttttctct ggagcagctg 1200
caggagtacg ccgacgccga tctgtctgtg gtggagaagc tgaaggagat catcatccag 1260
aaggtggatg agatctacaa ggtgtatggc tcctctgaga agctgttcga cgccgatttt 1320
gtgctggaga agagcctgaa gaagaacgac gccgtggtgg ccatcatgaa ggacctgctg 1380
gattctgtga agagcttcga gaattacatc aaggccttct ttggcgaggg caaggagaca 1440
aacagggacg agtccttcta tggcgatttt gtgctggcct acgacatcct gctgaaggtg 1500
gaccacatct acgatgccat ccgcaattat gtgacccaga agccctactc taaggataag 1560
ttcaagctgt attttcagaa ccctcagttc atgggcggct gggacaagga taaggagaca 1620
gactatcggg ccaccatcct gagatacggc tccaagtact atctggccat catggataag 1680
aagtacgcca agtgcctgca gaagatcgac aaggacgatg tgaacggcaa ttacgagaag 1740
atcaactata agctgctgcc cggccctaat aagatgctgc caaaggtgtt cttttctaag 1800
aagtggatgg cctactataa ccccagcgag gacatccaga agatctacaa gaatggcaca 1860
ttcaagaagg gcgatatgtt taacctgaat gactgtcaca agctgatcga cttctttaag 1920
gatagcatct cccggtatcc aaagtggtcc aatgcctacg atttcaactt ttctgagaca 1980
gagaagtata aggacatcgc cggcttttac agagaggtgg aggagcaggg ctataaggtg 2040
agcttcgagt ctgccagcaa gaaggaggtg gataagctgg tggaggaggg caagctgtat 2100
atgttccaga tctataacaa ggacttttcc gataagtctc acggcacacc caatctgcac 2160
accatgtact tcaagctgct gtttgacgag aacaatcacg gacagatcag gctgagcgga 2220
ggagcagagc tgttcatgag gcgcgcctcc ctgaagaagg aggagctggt ggtgcaccca 2280
gccaactccc ctatcgccaa caagaatcca gataatccca agaaaaccac aaccctgtcc 2340
tacgacgtgt ataaggataa gaggttttct gaggaccagt acgagctgca catcccaatc 2400
gccatcaata agtgccccaa gaacatcttc aagatcaata cagaggtgcg cgtgctgctg 2460
aagcacgacg ataaccccta tgtgatcggc atcgataggg gcgagcgcaa tctgctgtat 2520
atcgtggtgg tggacggcaa gggcaacatc gtggagcagt attccctgaa cgagatcatc 2580
aacaacttca acggcatcag gatcaagaca gattaccact ctctgctgga caagaaggag 2640
aaggagaggt tcgaggcccg ccagaactgg acctccatcg agaatatcaa ggagctgaag 2700
gccggctata tctctcaggt ggtgcacaag atctgcgagc tggtggagaa gtacgatgcc 2760
gtgatcgccc tggaggacct gaactctggc tttaagaata gccgcgtgaa ggtggagaag 2820
caggtgtatc agaagttcga gaagatgctg atcgataagc tgaactacat ggtggacaag 2880
aagtctaatc cttgtgcaac aggcggcgcc ctgaagggct atcagatcac caataagttc 2940
gagagcttta agtccatgtc tacccagaac ggcttcatct tttacatccc tgcctggctg 3000
acatccaaga tcgatccatc taccggcttt gtgaacctgc tgaaaaccaa gtataccagc 3060
atcgccgatt ccaagaagtt catcagctcc tttgacagga tcatgtacgt gcccgaggag 3120
gatctgttcg agtttgccct ggactataag aacttctctc gcacagacgc cgattacatc 3180
aagaagtgga agctgtactc ctacggcaac cggatcagaa tcttccggaa tcctaagaag 3240
aacaacgtgt tcgactggga ggaggtgtgc ctgaccagcg cctataagga gctgttcaac 3300
aagtacggca tcaattatca gcagggcgat atcagagccc tgctgtgcga gcagtccgac 3360
aaggccttct actctagctt tatggccctg atgagcctga tgctgcagat gcggaacagc 3420
atcacaggcc gcaccgacgt ggattttctg atcagccctg tgaagaactc cgacggcatc 3480
ttctacgata gccggaacta tgaggcccag gagaatgcca tcctgccaaa gaacgccgac 3540
gccaatggcg cctataacat cgccagaaag gtgctgtggg ccatcggcca gttcaagaag 3600
gccgaggacg agaagctgga taaggtgaag atcgccatct ctaacaagga gtggctggag 3660
tacgcccaga ccagcgtgaa gcactaa 3687
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cagcagtcga caaacccaca cgtcccgatg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cggagtgggg tggaaattgg gtaaaatagg 30
<210> 4
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gaattaatac gactcactat agggtaattt ctactaagtg tagatcgtaa ggacgtccgg 60
gaact 65
<210> 5
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gaattaatac gactcactat agggtaattt ctactaagtg tagatgagct gcagcatccg 60
tatgt 65
<210> 6
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gaattaatac gactcactat agggtaattt ctactaagtg tagatggctt ttggtcgtcc 60
caatt 65
<210> 7
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
tttttttttt t 11
Claims (10)
1.一种非疾病的诊断目的的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，以待测样品中EV71病毒核酸样本为模板，利用反转录等温扩增技术并采用特异性引物扩增目标片段，得到扩增产物；
步骤二，向步骤一所得的扩增产物中加入Cas12a/crRNA复合物，在crRNA介导下进行特异性切割反应；
步骤三，在步骤二反应后的反应体系中加入含有DNA探针的缓冲液进行孵育，得到待测反应液；将待测反应液滴加至胶体金试纸条样品垫上，等待5-10min，观察检测线和质控线的显色情况，判断是否含有待测病原。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，EV71病毒核酸样本为：待测EV71病毒核酸的DNA全长或片段、待测EV71病毒核酸的PCR产物或恒温扩增产物。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如Seq ID NO.2和Seq ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，crRNA的序列为与待测EV71核酸特异性结合的序列；且crRNA是针对EV71-VP1的3段保守序列设计得到。
5.根据权利要求4所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，crRNA包含如Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，DNA探针为FAM基团和Biotin基团双标记的单链DNA探针；且所述DNA探针的核苷酸序列如Seq ID NO.7所示。
7.根据权利要求1所述的基于CRISPR系统进行71型肠道病毒的检测方法，其特征在于，步骤一中的扩增反应是在23℃-45℃条件下进行等温扩增10-15min；步骤二的反应是在37℃条件下反应10-20min；步骤三的孵育过程是在37℃条件下孵育10-15min。
8.一种单链DNA探针，其两端分别利用FAM基团和Biotin基团进行双标记，且其核苷酸序列如Seq ID NO.7所示。
9.一种71型肠道病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括crRNA、Cas12a蛋白、10×缓冲液、单链DNA探针、试纸条缓冲液和胶体金试纸条；所述单链DNA探针的两端分别利用FAM基团和Biotin基团进行双标记，且其核苷酸序列如Seq ID NO.7所示。
10.根据权利要求9所述的一种71型肠道病毒的检测试剂盒，其特征在于，crRNA包含如Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。
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