CN112094854B

CN112094854B - 一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN112094854B
Application number: CN202011176933.8A
Authority: CN
Inventors: 袁雪梅; 刘莉; 吕孙建; 张海琪
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2020-10-29
Filing date: 2020-10-29
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2040-10-29
Also published as: CN112094854A

Abstract

本发明公开了一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明通过收集病鳖组织样本，进行病原分析，证明引发该病的病原为一种病毒。采用RACE技术获得病毒的部分序列后，针对性的设计了特异性检测该病毒的引物组、探针及试剂盒，提供了灵敏、特异、快速检测中华鳖黄病毒的方法，填补了目前尚无中华鳖黄病毒检测方法的空白，适合中华鳖黄病毒病的确诊、筛查和预防。本发明将为苗种检疫提供技术支撑，为从源头上切断病毒传播提供工具，有利于中华鳖养殖产业的绿色可持续发展。

Description

一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒。

背景技术

中华鳖(Pelodiscus sinensis)俗称甲鱼、团鱼及王八等，隶属于龟鳖目(Testudines)，野生中华鳖在中国境内广泛分布。中华鳖营养价值高，又可入药，深受广大消费者喜爱，一直都是我国重要的水产养殖经济动物。近几年在浙江省一些中华鳖养殖场中出现爆发性死亡病例，主要发病特点为：一是食量下降，早期个别病鳖漂浮在水面，或趴在岸边，表现出游动无力、厌食的症状；二是有出血情况，患病未死亡或刚死不久的甲鱼，外观腹部肿胀，有的呈现底板发红，解剖发现腹腔内有大量腹水，肠道不平滑、有打结情况，部分患病未死亡的甲鱼，用手一抓鳖血从口鼻处流出；三是死亡率高，一旦池塘发现有病鳖，传染性极强，3-5天内就会蔓延，死亡率高达90％以上，甚至还会传染给周边池塘；四是潜伏期长，有的中华鳖养殖3-4年，未见发病，但当养殖环境改变，则开始出大批量死亡。关于该种疾病的致病原因以及检测方法至今未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，本发明在检测中华鳖黄病毒中具有灵敏、特异、快速等特点，填补了目前尚无中华鳖黄病毒检测方法的空白，适合中华鳖黄病毒病的确诊、筛查和预防。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种中华鳖黄病毒，所述的中华鳖黄病毒部分基因序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供一种检测所述的中华鳖黄病毒的特异性引物组，所述特异性引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的TSFV-F1和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的TSFV-R1。

本发明还提供一种与所述检测中华鳖黄病毒配合使用的探针，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供一种标准质粒，所述的质粒中如含有SEQ ID NO.7所示的中华鳖黄病毒标准品序列。

本发明还提供所述的标准质粒的制备方法，包括以下步骤：对SEQ ID NO.7所示的中华鳖黄病毒标准品序列进行PCR扩增，利用特异性引物P1/P2扩增1500bp的靶序列，采用基因克隆技术，将靶序列与T载体进行连接，构建含有1500bp特异性序列的阳性重组质粒；所述的特异性引物P1序列如SEQ ID NO.2所示，特异性引物P2序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种检测中华鳖黄病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括所述的特异性引物组、所述的探针和所述的标准质粒。

优选的，所述试剂盒中还包括4×TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix和DEPC水。

优选的，所述特异性引物组浓度为18μM，探针的浓度为5μM。

本发明还提供一种利用所述的试剂盒检测中华鳖黄病毒的检测方法，包括如下步骤：利用所述的引物组与探针进行荧光定量PCR扩增待测样品，设DEPC水为阴性对照，标准质粒为阳性对照，荧光信号设定为FAM荧光素，每个循环结束收集荧光信号；

结果判断：(1)Ct值≤35且出现典型扩增曲线，判定为TSFV RT-qPCR结果阳性；检测无扩增曲线，或Ct值≥40，判定为TSFV RT-qPCR结果阴性；(2)对于35<Ct值<40的样品，应进行重复检测；若复检后，Ct值≤35且出现典型扩增曲线，判定为TSFV RT-qPCR结果阳性，否则判定为TSFV RT-qPCR结果阴性。

本发明还提供一种所述的引物组或所述的探针或所述的标准质粒或所述的任一试剂盒在检测中华鳖黄病毒中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过收集病鳖组织样本，进行病原分析，证明引发该病的病原为一种病毒。采用高通量测序获得病毒的部分序列，序列经RT-PCR验证及Blast比对，显示其与黄病毒属成员登革热病毒(Dengue virus，DV)同源性达70％以上，因此将该病毒命名为中华鳖黄病毒(Trionyx sinensis flavivirus virus，TSFV)。目前国内外均未见有关中华鳖黄病毒的报道，其基因组序列未公开，也没有检测该病的方法。因此，本试剂盒的研制与开发，具有创新性和唯一性。由于该病死亡率高、潜伏期长，一旦发病给养殖户带来巨大的经济损失，严重制约了中华鳖养殖产业的可持续发展。且随着苗种的省际、国际流通日益频繁，加剧了病毒的传播。因此加强苗种检疫，从源头上切断病毒的传播途径，对病毒的防控具有重大意义，本发明将为苗种检疫提供技术支撑，有利于中华鳖养殖产业的绿色可持续发展。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为中华鳖黄病毒部分序列的BLAST比对结果；

图2为荧光定量PCR方法标准曲线；

图3为灵敏性荧光定量PCR检测结果；

图4为重复性试验结果；

图5为特异性试验结果；

图6为临床样品检测结果；

图7为病毒在不同组织的分布图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1、样品收集及病毒纯化

将病鳖的肝、脾、肺、肾、肠组织取出，冰上匀浆。匀浆液12000g离心20min，取上清，0.22μm细菌过滤器过滤，滤液40000g离心3h，TNE缓冲液重悬沉淀，作为含病毒的粗提液。使用不连续蔗糖密度梯度离心法对上述病毒液进行纯化。

2、病毒核酸提取及高通量测序

取200μL的纯化后的病毒液，用QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN德国)试剂盒提取病毒核酸，寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司，分别进行RNA及DNA建库，再分别进行高通量测序，其中RNA建库高通量测序，拼接出部分病毒序列(SEQ ID NO.1)。针对测得的序列，设计相应的引物，进行RT-PCR验证，证实这些核酸片段存在于被TSFV感染后的中华鳖组织中。BLAST结果(图1)表明，该病毒与黄病毒属成员登革热病毒(Denguevirus，DV)同源性达70％以上，因此将该病毒命名为中华鳖黄病毒(Trionyx sinensisflavivirus virus，TSFV)。

3、引物和探针设计

根据上述测得的病毒序列，应用primer primier5软件分别设计2对特异性引物和1条探针，引物和探针序列(SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.6)见表1，其中引物P1/P2用于制备标准品，片段大小为1500bp；引物TSFV-F1/TSFV-R1和Taqman探针TSFV-Probe用于病毒核酸检测，扩增目的条带大小83bp。

表1试剂盒所用引物及探针序列

阳性标准品序列(SEQ ID NO.7)：

5’-3’：

其中，“”为扩增阳性标准品引物；

为RT-qPCR引物序列；

为RT-qPCR TaqMan探针序列。

4、标准曲线的建立

4.1、阳性标准品的制备

对上述病毒核酸进行RT-PCR，反转录所用试剂来自Promega公司。在1.5ml离心管中分别加入上述核酸1μg、1μL Randome Primers，70℃加热5min,迅速置冰上；然后加入以下试剂：5μL M-MLV RT 5X Reaction Buffer，0.25μL Recombinant

Ribonuclease Inhibitor，1.25μL dNTP mix，0.6μL M-MLV Reverse Transcriptase，用DEPC水补足25μL，37℃孵育1h；70℃作用10min，灭活M-MLV。

对反转录得到的cDNA进行PCR扩增，所用的taq酶为Takara公司产品，利用特异性引物P1/P2扩增1500bp的靶序列，采用基因克隆技术，将靶序列与T载体(Takara公司)进行连接，构建含有1500bp特异性序列的阳性重组质粒。

4.2标准曲线的建立

将重组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度依次为1×10⁷～1×10²copies/μL作为标准品模板。取不同稀释梯度的重组质粒2μL分别加入PCR管中，并加入引物TSFV-F1/R1和探针TSFV-probe的混合液1μL，其中引物的浓度为18μM，探针的浓度为5μM，4×TaqMan FastVirus 1-Step Master Mix(Life technologies公司产品，货号4444432)5μL，最后RNAfreeddH2O补足体系至20μL。每个稀释度设3个重复。将加好样品的PCR管置于Mx3005p荧光定量PCR仪上反应(Stratagene公司)，反应参数：50℃5min；95℃20s；95℃3s，60℃30s，共40个循环；荧光信号收集设定为FAM，每个循环结束后收集荧光信号。根据标准质粒的拷贝数及Ct值的相关性，绘制标准曲线如图2所示，其中横坐标(x)代表lg(质粒的拷贝数)，纵坐标(y)代表Ct值，x与Ct的关系为：Ct＝-3.235x+37.14。该方法在重组质粒浓度为1×10⁷～1×10²copies/μL检测的R2值达到0.999。

5、灵敏度检测

将1×10⁸copies/μL重组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度依次为1×10⁸～1×10⁰copies/μL作为标准品模板，用于进行灵敏度测试。在PCR管中加入引物TSFV-F1/R1和探针TSFV-probe的混合液1μL，其中引物的浓度为18μM，探针的浓度为5μM，4×TaqMan FastVirus 1-Step Master Mix(Life technologies公司产品，货号4444432)5μL，标准品模板2μL，最后用RNAfree ddH2O补足体系至20μL，每个稀释度设3个重复。反应参数：50℃5min；95℃20s；95℃3s，60℃30s，共40个循环。荧光信号通道设定为FAM，每个循环结束后收集荧光信号。

结果判断：(1)Ct值≤35且出现典型扩增曲线，判定为TSFV RT-qPCR结果阳性；检测无扩增曲线，或Ct值≥40，判定为TSFV RT-qPCR结果阴性。(2)对于35<Ct值<40的样品，应进行重复检测。若复检后，Ct值≤35且出现典型扩增曲线，判定为TSFV RT-qPCR结果阳性，否则判定为TSFV RT-qPCR结果阴性。

灵敏度检测结果显示(图3)，应用建立的RT-qPCR检测1×10⁸～1×10¹copies/μL的重组质粒，均扩增得到特异性扩增曲线，且Ct值≤35，10⁰copies/μL的重组质粒经两次扩增得到的Ct值均＞35，说明建立RT-qPCR检测TSFV的下限为10个拷贝数的病毒分子核酸。

6、重复性检测

对同一样品进行实时荧光定量PCR检测，反应体系及参数同实验5，实验结果如图4所示，同一次试验内37个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本重合，Ct值读数范围为24.04～24.84，结果表明，本研究所建立的TSFV实时荧光定量PCR检测方法重复性好，可进行稳定、可靠的检测。

7、特异性检测

采用商品试剂盒(Qiagen公司产品，货号74104)分别提取中华鳖黄病毒(TSFV)、中华鳖出血症病毒(TSHSV)以及健康中华鳖组织的基因组核酸，以其为模板，进行RT-qPCR检测。所用体系为：在PCR管中加入引物TSFV-F1/R1和探针TSFV-probe的混合液1μL，其中引物的浓度为18μM，探针的浓度为5μM，4×TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix(Lifetechnologies公司产品，货号4444432)5μL，模板5μL，最后RNAfree ddH2O补足体系至20μL。反应参数：50℃5min；95℃20s；95℃3s，60℃30s，共40个循环，采用Mx3005p荧光定量PCR仪扩增，荧光信号设定为FAM荧光素，每个循环结束收集荧光信号。每个稀释度设3个重复，同时设DEPC水为阴性对照。

结果显示(图5)，中华鳖黄病毒核酸扩增得到典型扩增曲线，Ct值为24.62，其余均没有扩增曲线，且Ct值＞35，说明建立RT-qPCR方法特异性好。

8、临床样品检测

利用建立的实时荧光定量RT-PCR方法对浙江萧山、余杭、富阳、嘉兴及湖州收集的疑似患病中华鳖样品进行TSFV病原检测。按照方法7进行，同时设立DEPC水为阴性对照、标准质粒为阳性对照。

结果显示(图6)，萧山、余杭、富阳、嘉兴、湖州临床样本以及阳性对照均扩增得到典型扩增曲线，Ct值在21～26.4之间，阴性对照没有典型扩增曲线，且Ct值＞35。证明从萧山、余杭、富阳、嘉兴、湖州采集中华鳖临床样本为TSFV阳性样本。

9、患病中华鳖不同组织中病毒含量的检测

分别取感染11d后的中华鳖肝脏、脾脏、肾脏、肺、肠道、心脏及血液，提取总RNA。按照方法7进行RT-qPCR检测，得到的Ct值经标准曲线换算后可得到不同组织中病毒的含量。结果显示(图7)，感染中华鳖肾脏组织中病毒含量最高。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 浙江省淡水水产研究所；浙江省农业科学院

<120> 一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 7

<211> 4168

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tccgagaatt actaagaaag ggagatctcc ccgtctggct tgctcacaat gtggcagcag 60

caggaatatc atacacagac agaaagtggt gttttgatgg acctgtggaa aataccatcc 120

tcagagacag tgaagaggtg ataattagac ggagaaatgg agagcgagct gtactaaaac 180

cacgatggca tgatgcaaga gtgagtgctg atggaacatc cttaaggaag ttcatagaat 240

ttgctgaggg gagaagaagc gcgagtgata ttctaaccat gatagggaaa acacctgaat 300

atatgaacga aaagtggaaa acatcagttg acacattatt taccctagtg aaaggagaac 360

caggaaccag agcgtacaga gaagcattga attcattgcc cgaagcaata gaaataggag 420

tgacaatagc acttgcagca gtgataacat tgggagtgtt tgtggtgcta atgaaaagta 480

aaggcatgag taagatgacc gctgggtttt taacaatgat ggctgcctcg accttgctgt 540

tgtgggctga ggtgggagca ccgcaggtag cagcccttat ggtcatcatg ttcatcctca 600

tggttgtttt aatcccagac tcagaaaagc aaagatctat aacagacaac gagattgcca 660

aaattgtcat agcagtgatg tcactggcag ctctggttgt agccaatgaa catggcatgc 720

tggatcagac aaaacgcgat tttgggctta tgcgatcaga aagtgagaag gtccagacct 780

ggaacgtccc agaatttcat cccacagtag gctggagttt gtatgtagca tccactgtct 840

tcataagccc gtgggtgaaa catgtattga aaggacagta tgggagttta tctgtggcag 900

ctatgaatca acaggcatcc ttgttgctga acatgaactt aggctggcca agcctgaagt 960

tggactgggg agtcccccta ctgcttgtgg gcgtagcaca acatgtgaac gcaggagcag 1020

ttgcaggagc tctagtgatg ctggtagtgc actactacat agtggtggcc acttttcaag 1080

cagagttttc atcagcagct actaaaagaa cagcagcagg agtaatgaag aatccgacaa 1140

ttgatggagt gtcagcagtg gaccttgacg tcgaagagat ggacccaatg ttagagaaaa 1200

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gtgccctcct tgattgaatt gggagtgata gggacggcag ttttggccac agtagtagaa 1320

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acagttagaa ggggtggtgc tgcaggaaga acccttggag taatgtggaa agagacgctc 1500

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agagtggaag cgcaaaatgc attcaaaaag ggtgatgaaa gtggaacata tccagtctca 1620

aggggcactt caaagctaaa gtggctgatg gacagaagtt tattctctcc aactggctct 1680

gttgtagacc ttggctgtgg caggggtggc tggagctacc ttgtggcggg tgagagaaaa 1740

gtccataagg tcaacgcatt tacaaaagga ggatttggcc acgagaatcc aagacttgtt 1800

aagagttatg gatggaactt gatctctttc aaaataaagg atgtcatgtt tatgcccacg 1860

caaccatgtg acacactaat gtgtgacata ggggaatcga gtccaagttt cgaggtggaa 1920

tcaacaagaa cattaaaagt tttacatcta gcagaaaaat ggatgatgga gaggaaacca 1980

gagagtttct gtatcaaggt tttgtgccca tacaccccag aagttctagt gaaaatggaa 2040

aatttgcaaa ggaaattcgg agggagctta gtaagagtcc ccttttcgag aaattcaact 2100

catgagatgt actgggtctc aggtgctcga ggaaatgtga tgggagctgt cacaggaaca 2160

tcacgaaccc taatgaatag gttgaaactg aagcagggac caactctagt gccggatgta 2220

atattaggaa ccggaactag gagaccacag caaaaagcag atgaaccaaa catggctgtc 2280

attggtagac gaattgcgaa actgaaagca cagttcaaag agacatggtt tgaagatgaa 2340

gaccatcctt actccacttg gacctaccat ggaagctatg aaacaaagac aacaggtagt 2400

gcttcatcat tggtcaatgg agtggtgaaa gagctgtccc atccttggga cctagtagat 2460

gaggtaacca gaacagtcat gacagacacg actccatttg gacaacaaag ggttttcaag 2520

gaaaaagttg acacacgagc agtctctcca cgtgcaggaa ctagagccat tatgggcgca 2580

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gttcaactga ttagattcat ggaggctgaa ggagtcatct caggagagga agtcgagaag 3360

ataacaccta cagcactgag agaaatggaa gagtggttag atcacgaagg agaggatgtt 3420

ttagcccgga tggcaattag tggggatgac gtagtggtca aagcgaagga ccaaagattt 3480

gccactgcac ttttccacct aaatgaaatg tcaaagacaa ggaaggacat gcctgagtgg 3540

gaagcgtcca gtggatggga tcaatgggag agagttccat tctgttcaca ccactttcat 3600

gagttgaagt tgaaggatgg acgcatgata gtagtccctt gtagaaatca acatgagcta 3660

gtgggaagag cacgtgtgtc accaggaaga ggatggagtt tgattgaaac agcagccctc 3720

agcaaggctt atgggcaaat gtggcaactc atgtacttcc atagaagaga tcttcggctg 3780

atggcattcg cgatatcatc ttcagtacca atcaattggg tgcctacagg aagaacaacc 3840

tggtcattac atggaaaagg agagtggatg accaacgagg acatgttaga agtgtggaat 3900

agagtatgga tatatgacaa cccccatatg aagaataaac agccagttga agattggaga 3960

gacatcccgt tcattcgcaa gggtaatgac atagcttgtg gcagcctcat tggcttgaca 4020

gcgagagcca catgggcgaa gaacataaga gtagccgtga atcaggttag atcattaata 4080

ggagtaaatg aaagatatgt ggactacctt gtagcaatgg gaagataccg ccaaaatgaa 4140

gagcaagctc caggagcttg ggaaaaac 4168

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtggcagc agcaggaata tc 22

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatcatcctt ttcttataat cttcaaagtc 30

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcttatgcga tcagaaagtg agaag 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctacatacaa actccagcct actgt 25

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgtcccaga atttc 15

<210> 6

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtggcagc agcaggaata tcatacacag acagaaagtg gtgttttgat ggacctgtgg 60

aaaataccat cctcagagac agtgaagagg tgataattag acggagaaat ggagagcgag 120

ctgtactaaa accacgatgg catgatgcaa gagtgagtgc tgatggaaca tccttaagga 180

agttcataga atttgctgag gggagaagaa gcgcgagtga tattctaacc atgataggga 240

aaacacctga atatatgaac gaaaagtgga aaacatcagt tgacacatta tttaccctag 300

tgaaaggaga accaggaacc agagcgtaca gagaagcatt gaattcattg cccgaagcaa 360

tagaaatagg agtgacaata gcacttgcag cagtgataac attgggagtg tttgtggtgc 420

taatgaaaag taaaggcatg agtaagatga ccgctgggtt tttaacaatg atggctgcct 480

cgaccttgct gttgtgggct gaggtgggag caccgcaggt agcagccctt atggtcatca 540

tgttcatcct catggttgtt ttaatcccag actcagaaaa gcaaagatct ataacagaca 600

acgagattgc caaaattgtc atagcagtga tgtcactggc agctctggtt gtagccaatg 660

aacatggcat gctggatcag acaaaacgcg attttgggct tatgcgatca gaaagtgaga 720

aggtccagac ctggaacgtc ccagaatttc atcccacagt aggctggagt ttgtatgtag 780

catccactgt cttcataagc ccgtgggtga aacatgtatt gaaaggacag tatgggagtt 840

tatctgtggc agctatgaat caacaggcat ccttgttgct gaacatgaac ttaggctggc 900

caagcctgaa gttggactgg ggagtccccc tactgcttgt gggcgtagca caacatgtga 960

acgcaggagc agttgcagga gctctagtga tgctggtagt gcactactac atagtggtgg 1020

ccacttttca agcagagttt tcatcagcag ctactaaaag aacagcagca ggagtaatga 1080

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aaagagacgc tcaactcatt aggaaaacag gactttgaag attataagaa aaggatgatt 1500

Claims

1.一种标准质粒，其特征在于，所述的质粒中含有如SEQ ID NO.6所示的中华鳖黄病毒标准品序列。

2.如权利要求1所述的标准质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：对SEQ IDNO.6所示的中华鳖黄病毒标准品序列进行PCR扩增，利用特异性引物P1/P2扩增1500bp的靶序列，采用基因克隆技术，将靶序列与T载体进行连接，构建含有1500bp特异性序列的阳性重组质粒；所述的特异性引物P1序列如SEQ ID NO.1所示，特异性引物P2序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种检测中华鳖黄病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括特异性引物组、探针和权利要求1所述的标准质粒，所述特异性引物组核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的TSFV-F1和如SEQ ID NO.4所示的TSFV-R1，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.如权利要求3所述的检测中华鳖黄病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括4×TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix和DEPC水。

5.如权利要求3所述的检测中华鳖黄病毒的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物组浓度为18μM，探针的浓度为5μM。

6.一种引物组或探针或标准质粒在制备检测中华鳖黄病毒试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物组核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的TSFV-F1和如SEQ ID NO.4所示的TSFV-R1，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述标准质粒为权利要求1所述的标准质粒。