CN116949218A - 用于检测ⅲ型鲤疱疹病毒的raa-crispr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测Ⅲ型鲤疱疹病毒的RAA‑CRISPR试剂盒。所述试剂盒包含Ⅲ型鲤疱疹病毒RAA的扩增引物以及crRNA序列；本发明还提出了基于RAA‑CRISPR‑Cas12a系统构建一种新型Ⅲ型鲤疱疹病毒的检测方法，具有高灵敏、高特异、便捷检测，灵敏度可达到102copies/reaction，可以实现对Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV‑3)的简便、快速、准确检测，避免依赖PCR等复杂仪器。
Description
技术领域
本发明属于生物医药检测领域，具体涉及用于检测Ⅲ型鲤疱疹病毒的RAA-CRISPR试剂盒。
背景技术
鲤疱疹病毒3型(Cyprinid Herpesvirus 3，CyHV-3)，隶属于疱疹病毒目(Herpesvirales)异型疱疹病毒科(Alloherpesviridae)鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)。该病毒为双链DNA病毒，成熟病毒粒子直径167-200nm，其基因全长约为295kbp，共编码156个开放阅读框。二十面体对称结构，主要结构有囊膜，皮层，衣壳，核心。CyHV-3能够引发锦鲤疱疹病毒病(Koi Herpesvirus Disease，KHVD)，主要感染锦鲤、普通鲤鱼与其变种，毒力强，具有高度传染性，感染鱼2～3即出现明显症状，严重危害鲤鱼和锦鲤养殖业。病鱼主要病理变化为鳃丝出血，并伴有大量的粘液或部分组织坏死；感染晚期头顶部和鱼眼睛凹陷，体表充血或出血，解剖后可见内部脏器颜色变暗，腹部肿大、出血、积液和腹部粘连等症状。流行病学调查结果表明锦鲤具有较高感染风险，普通鲤也存在一定感染风险。由于目前还缺乏有效治疗CyHV-3的药物，及时对带病鱼体进行检测和病毒净化是最有效的病毒防控手段之一。
原检测方法主要包括细胞分离培养技术，利用敏感细胞系对CyHV-3进行分离，该类型技术由于实验操作流程耗时较长，细胞一次传代通常需要一周，影响疾病诊断的时效性，且对技术人员要求高，需要成本较高的配套仪器和研究平台，通常适用于科研级别的研究类型实验；目前诊断CyHV-3病原的最普遍采用的是基于核酸扩增的检测方案，包括PCR扩增技术如：普通PCR技术、双重PCR检测技术、实时荧光定量PCR检测技术、LAMP检测技术和RPA检测技术等，这些技术均可以较快速的开展病原检测，其中LAMP和RPA等技术因为不需要变温扩增仪器(如PCR仪器、定量PCR仪器)，同时可以利用颜色反应或恒温扩增仪器(如普通水浴锅、专用恒温扩增仪器等)更适用于农业一线和条件相对简单的基层养殖场开展相应工作。表1整理了目前已经报道的CyHV-3的相关核酸检测技术报道。
表1
RAA法主要使用3种酶：重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶。重组酶与引物结合形成复合体，在单链DNA结合蛋白的辅助下，模板DNA解链并使引物与模板配对，然后在DNA聚合酶的作用下，生成新的DNA链。经过几十个循环后，DNA新链的数量以指数级增长。RAA法用酶的作用使双链DNA解链。因此反应条件较温和，不需要高温使模板DNA变性。RAA反应的时间也较短，在15～30min就可以得到能检测到的扩增片段。重组酶介导扩增(RAA技术)相较于重组酶聚合酶扩增(RPA技术)的技术改进在于：(1)RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物聚合体；RAP使用的重组酶是T4UVSX，来自于病毒。实验证明，来自于细菌和真菌的重组酶能与DNA紧密结合，使核酸体外扩增反应顺利进行。(2)RAA使用的聚合酶只具有DNA聚合酶活性，反应产物呈指数级增长；RPA的聚合酶具有链置换活性和聚合酶活性，反应产物不呈指数增长。
Cas12a可用于编辑目标DNA。该蛋白最初被称为Cpf1，由张锋团队在其2015年的cell论文中首次提出。Cas12a(Cpf1)是基因编辑酶家族的重要一员，它能够在Cas9不能作用的位置切割DNA；与crRNA以及靶标DNA形成三元复合物，该复合物就会表现出很强的“乱切”活性，可将体系中非靶标单链DNA切成几个碱基长度的“碎片”。利用这一特性，Doudna教授团队开发出一种被称为“DETECTR”(DNA Endonuclease Targeted CRISPR TransReporter)的诊断系统，该系统由CRISPR-Cas12a(Cpf1)和向导RNA、荧光报告分子及RPA(recombinase polymerase amplification)等温扩增试剂组成，单管反应即可对临床样本中的少量DNA进行快速、简便地即时检测。当加热到一定温度时，RPA扩增目标DNA，使Cas12a(Cpf1)更容易找到并切割它，然后激活Cas12a(Cpf1)的核酸酶活性使其切割体系中的其它单链DNA(也就是荧光报告分子)，从而发出荧光。
因此，本发明基于RAA-CRISPR/Cas12a构建了一种用于检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3)的试剂盒，可以避免依赖PCR等复杂仪器的特性。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种核酸分子组合物。
本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明第三方面的目的，在于提供上述核酸分子组合物和/或试剂盒的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3)的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种核酸分子组合物，包括检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3)的crRNA和/或扩增Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3)的引物对。
优选地，所述引物对序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述crRNA序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第二方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的核酸分子组合物。
优选地，所述试剂盒还包含cas12a蛋白。
优选地，所述试剂盒还包含Cleavage Buffer、Reporter、阳性标准品、R-mix、CoreMix、MgOAc中的一种或多种。
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述核酸分子组合物和/或本发明第二方面所述试剂盒在检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3)和/或制备检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3)的产品中的应用。
本发明的第四方面，提供一种检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3)的方法，包括使用本发明第一方面所述核酸分子组合物和/或本发明第二方面所述试剂盒对待测样本进行检测。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，采用本发明第一方面所述的引物对进行扩增，得到扩增产物；
(3)取步骤(2)所得扩增产物，添加本发明第二方面所述的cas12a蛋白和crRNA，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，根据检测信号确定检测结果。
该方法不用于疾病的诊断。
优选地，步骤(2)所述扩增条件为35～42℃反应20～40分钟。
优选地，步骤(2)所述扩增体系包括：R-mix、Core Mix、引物对、模板DNA、MgOAc。
优选的，步骤骤(2)所述扩增体系包括：约10μL R-mix(约2X)，约5μL Core Mix(约4X)，上、下游引物各约0.5μL(引物浓度均为约20μM)，约2μL DNA，约2μLMgOAc。
优选地，步骤(3)所述CRISPR反应检测条件为35～42℃反应20～40分钟。
优选地，步骤(3)所述CRISPR反应检测体系包括Cleavage Buffer、reporter、Cas12a蛋白、crRNA、扩增产物。
优选地，步骤(3)所述CRISPR反应检测体系约2μLCleavage Buffer(约10X)，约0.6μL Reporter(约4μM)，约1μL Cas12a protein(约1μM)，约1μL crRNA(Cas12a)(约1μM)，约10.4μL Nuclease-free H2O，约5μL步骤(2)的扩增产物。
术语“约”在一些实施例中涵盖具体量±20％的变化，在一些实施例中涵盖具体量±10％的变化，在一些实施例中涵盖具体量±5％的变化，在一些实施例中涵盖具体量±1％的变化，在一些实施例中涵盖具体量±0.5％的变化，而在一些实施例中涵盖具体量±0.1％的变化，因为这些变化适于进行所公开的方法。
本发明的有益效果是：
本发明设计并筛选了Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3)RAA的扩增引物以及crRNA序列，提出了基于RAA-CRISPR-Cas12a系统构建一种新型Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3)的检测方法，而且具有高灵敏、高特异、便捷检测，灵敏度达到102copies/reaction，可以实现对Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3)的简便、快速、准确检测，可以避免依赖PCR等复杂仪器。
附图说明
图1为CyHV-3-RAA引物筛选。
图2为crRNA筛选。
图3为CyHV-3RPA-Cas12a灵敏度试验结果。
图4为CyHV-3RAA-Cas12a特异性试验结果。
图5为RAA-Cas12a和PCR方法对对虾样本中的CyHV-3检测结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明联合RAA扩增技术和CRISPR/Cas12a系统，建立了一套用于检测CyHV-3病毒的系统。
实施例1
1、材料与方法
1.1试剂仪器
RAA核酸扩增试剂(基础型)(S001ZC)，杭州众测生物科技有限公司；CRISPR/Cas12a DNA 检测试剂盒(D-F-CAS12-2S)，深圳易致生物科技有限公司；pMDTM19-T VectorCloning Kit，r Taq聚合酶，TaKaRa(大连宝生物)公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒(GelExtraction Kit)，omega BIO-TEK。核酸分析仪(Nanodrop ONE),Thermo；Deaou-308C恒温荧光PCR仪，广州迪澳生物科技有限公司。
1.2引物及crRNA设计
针对CyHV-3的Sph基因进行引物及crRNA设计，引物和crRNAs的工业合成是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的。具体信息见表2。
表2 CyHV-3RAA引物和crRNAs相关信息
1.3引物筛选
以CyHV-3阳性DNA为模板，进行RAA-AGE检测反应。将25μL A Buffer，13.5μLNuclease-free H2O，RAA上、下游引物各2μL(引物浓度均为10μM)混合均匀后加入装有反应干粉的检测单元管中，然后加入5μL待测DNA样本，最后向检测单元管盖上加入2.5μL的BBuffer，盖上管盖，上下颠倒轻甩充分混匀5-6次，低速离心10秒；将检测单元管放入39℃恒温扩增仪中孵育30min。反应结束后，加入50μL酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提液进行纯化，充分混匀后12000rpm/min离心5min，取上清进行电泳检测。
结果见图1，根据琼脂糖凝胶电泳中条带的灰度筛选到了1对效果较好的引物F2/R2，扩增产物可以在280bp产生明亮条带。
1.4标准品模板的制备
以CyHV-3阳性样品的DNA为模板，对靶基因序列进行常规PCR扩增获取目的产物，用pMD19-T载体在DH5α中克隆，克隆片段送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。目的产物的克隆经扩大培养后，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。用核酸分析仪测定重组质粒DNA浓度为89ng/μL，拷贝数为1.24×1011copies/μL DNA，将该重组质粒作为本实验标准品原液，–20℃保存。
1.5RAA-CRISPR/Cas12a检测CyHV-3
RAA-CRISPR/Cas12a第一步扩增反应体系如下：
10μL R-mix(2X)，5μL Core Mix(4X)，RAA上、下游引物各0.5μL(引物浓度均为20μM)，2μL DNA，最后加入2μL MgOAc混匀。轻弹数次混匀，稍微离心。37℃孵育30分钟反应结束。
RAA-CRISPR/Cas12a第二步检测反应体系如下:
2μLCleavage Buffer(10X)，0.6μL Reporter(4μM)，1μL Cas12a protein(1μM)，1μLcrRNA(Cas12a)(1μM)，10.4μL Nuclease-free H2O，最后加入5μLRAA-CRISPR/Cas12a第一步扩增产物。
轻弹数次混匀，稍微离心(避免涡旋剧烈震荡)，重复3次，将反应管放置于恒温反应器中，37℃条件下反应30min。
1.6crRNA筛选
以质粒为模板，采用1.5中RAA-Cas12a检测方法，分别对4组crRNA进行筛选，通过扩增曲线的荧光值及起峰时间，选择最优的crRNA引物组。根据RAA-CRISPR/Cas12a荧光曲线产生的时间和荧光强度(图2)，筛选到了1条效果较好的crRNA2-1，可以在2min左右产生扩增曲线，比其他crRNA更早，而且30min内产生的荧光强度最高。因此，后续实验均选用crRNA2-1进行，其序列为5′-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUUAAGACACAUGUUACAAUG-3′(SEQ IDNO.11)。
1.7RAA-Cas12a分析灵敏度试验
将阳性质粒稀释为106-100copies/reaction 7个浓度梯度。采用1.5中RAA-Cas12a检测方法，以稀释后的各浓度阳性质粒及无RNA酶水为模板，通过扩增曲线确定该方法的检测灵敏度。
结果如图3所示，106-101copies/reaction 6个质粒浓度为模板的检测反应荧光值之间均能检出，而且荧光强度均显著高于101copy/reaction为模板的反应。因此，本发明的RAA-Cas12a方法的检测限为102copies/reaction(2×10-4fg/μl)。
1.8RAA-Cas12a分析特异性试验
选取临床样本CyHV-3阳性DNA、CyHV-2阳性DNA、GCRV-Ⅱ阳性cDNA、GCRV-Ⅰ阳性cDNA、Aeromonas veronii阳性DNA为扩增模板，以无核酸酶水为阴性对照，采用1.5中RAA-Cas12a检测方法，分析本研究方法的检测特异性。
结果如图4所示，仅CyHV-3样品出现扩增曲线，空白对照(无核酸酶水)、CyHV-2，GCRV-Ⅰ，Aeromonas veronii样品均未出现扩增，表明本发明的RAA-Cas12a检测体系能特异性扩增检测出CyHV-3中的靶序列，而不与其他病原体的核酸发生交叉反应，说明本发明中的检测方法特异性好，未出现假阳性。
1.9RAA-Cas12a方法对实际样本的检测
实际样本由珠江水产研究所提供，提取样本基因组DNA，然后采用1.5中的RPA-Cas12a体系及SNT_1674-2014中PCR法进行检测，同时进行实际样本的检测，比较2种方法的检测一致性。
结果如图5所示，检测10个样本，结果显示有5个阳性样品。同时，使用行标PCR检测两批样本，结果显示，RAA-Cas12a检测全部为阳性的5个样本，国标PCR检测全部也为阳性，样品RAA-Cas12a和行标PCR检测结果阳性符合率为100％，阴性符合率也为100％。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种核酸分子组合物，包括检测Ⅲ型鲤疱疹病毒的crRNA和/或扩增Ⅲ型鲤疱疹病毒的引物对。
2.根据权利要求1所述的核酸分子组合物，其特征在于，所述引物对序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的核酸分子组合物，其特征在于，所述crRNA序列如SEQ IDNO.11所示。
4.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1～3任一项所述的核酸分子组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含cas12a蛋白。
6.权利要求1～3任一项所述核酸分子组合物在检测Ⅲ型鲤疱疹病毒和/或制备检测Ⅲ型鲤疱疹病毒的产品中的应用。
7.权利要求4～5任一项所述试剂盒在检测Ⅲ型鲤疱疹病毒和/或制备检测Ⅲ型鲤疱疹病毒的产品中的应用。
8.一种检测Ⅲ型鲤疱疹病毒的方法，包括使用权利要求5所述试剂盒对待测样本进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，采用引物对进行扩增，得到扩增产物；
(3)取步骤(2)所得扩增产物，添加cas12a蛋白和crRNA，进行CRISPR反应检测，读取检测信号，根据检测信号确定检测结果。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增条件和步骤(3)所述反应条件均为35～42℃、20～40分钟。
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