CN111471776A - 虾肝肠胞虫检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了虾肝肠胞虫(EHP)检测试剂盒及其检测方法，提供了一种对EHP检测的荧光定量技术，该试剂盒中以对虾EHP的基因极管蛋白2(PTP2)基因为靶标进行检测，可以有效避免假阳性结果，对几种常见的对虾病原未出现扩增结果，即使用本发明的试剂盒检测对虾EHP具有良好的特异性，且本发明的试剂盒具有高灵敏度，能检测到的最低阳性拷贝浓度为10¹copies/μL，比普通PCR扩增灵敏至少100倍，同时具有良好的重复性，可用于生产上对EHP的快速检测。

Description

虾肝肠胞虫检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及虾肝肠胞虫检测试剂盒，和利用该试剂盒检测虾肝肠胞虫的方法。

背景技术

对虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)属于微孢子虫科、肠胞虫属，2004年首次在泰国斑节对虾中被发现，其主要寄生于对虾的肝胰腺组织，成熟孢子大小在0.7微米至1.7微米之间，具有特殊的侵染器官——极管。在2009年有研究人员通过对SSUrRNA基因序列进行比对并构建系统发育树，分析发现这种微孢子虫与毕氏肠微孢子虫的亲缘关系最近，将其命名为肝肠微孢子虫。被EHP感染后，对虾的生长发育会受到严重阻滞，极大降低成虾品质。此外，感染了EHP的病虾同时感染其它病原的几率相对增加，这些都会给对虾养殖业带来极大的经济损失。

我国从2013年首次从养殖对虾中检测到EHP以来，对虾养殖一直受到这种微孢子虫的困扰，并且近年来对虾EHP感染率呈现显著上升趋势。由于EHP感染早期，对虾不会出现明显的病症，因此需要快速、灵敏的检测对EHP感染进行早期的检测并有效防控。荧光定量PCR技术具有高效、高灵敏度、高特异性的优点完全能满足对EHP早期感染的检测要求。目前对EHP的检测多以SSU rRNA基因作为检测靶标，据文献报道(Pattana Jaroenlak,et al,2016)SSU rRNA基因序列具有较高的种属保守性，不能很好地区分近缘性的物种，容易出现假阳性结果。我们通过NCBI比对发现：有至少6种微孢子虫的SSU rRNA基因与EHP-SSU rRNA基因(GenBank No.KF362130.1)序列同源性高达85％以上，最高同源性可达93％。为减少特异性差造成的检测误差，急需构建一种特异性高、灵敏性好的EHP检测试剂盒。

极管是微孢子虫独特的侵染器官和重要的分类指标，由极管蛋白组成。虽然蛋白功能相同，但微孢子虫极管蛋白间序列相似性极低，经BlastP比对发现：与EHP极管蛋白2(GenBank No.OQS55341.1)同源性最高蛋白来自于Enterospora canceri，但同源性仅有52％，二者核苷酸序列同源性更低。因此，我们选用EHP极管蛋白2(EHP-PTP2)基因作为检测靶标，能更特异、更准确地对EHP进行检测。同时，根据中国专利(公开号为CN106048022A)公开的一种以SSU rRNA基因为检测靶标的虾肝肠胞虫检测试剂盒，合成了其中一对定量检测引物，对两种试剂盒检测EHP结果的一致性进行了比较。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种虾肝肠胞虫检测试剂盒；本发明的目的之二在于提供利用所述试剂盒检测虾肝肠胞虫的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种虾肝肠胞虫检测试剂盒，所述试剂盒含有以PTP2基因为检测靶基因的引物对，所述PTP2基因的序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述试剂盒还含有

qPCR SYBR Green Master Mix和ddH₂O。

优选的，所述试剂盒的反应体系为

qPCR SYBR Green Master Mix 5.0μL，上游引物0.2μM，下游引物0.2μM，模板DNA 1.0μL，ddH₂O补足至10μL。

2、利用所述试剂盒检测虾肝肠胞虫的方法，提取对虾肝胰腺组织基因组，以SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行实时荧光定量PCR，然后根据以标准品建立的标准曲线计算得到拷贝数。

优选的，所述实时荧光定量PCR的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性10sec，60℃退火并延伸30sec，40个循环；熔解曲线阶段95℃，15sec，60℃60sec，95℃1sec。

优选的，所述试剂盒的反应体系为：

qPCR SYBR Green Master Mix 5.0μL，上游引物0.2μM，下游引物0.2μM，模板DNA 1.0μL，ddH₂O补足至10μL。

优选的，所述标准曲线中Cq值与模板起始量的对数之间的关系为：Y＝-3.2751x+31.269，R²＝0.993，其中Y为Cq值，x为模板起始量的对数值。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种虾肝肠胞虫检测试剂盒，该试剂盒利用荧光定量PCR技术对样品中的EHP进行高效、快速的检测，具有以下优点：

(1)本方法灵敏度高，能检测到的最低阳性拷贝浓度为1.0×10¹copies/μL，比普通PCR扩增灵敏至少100倍。

(2)本方法使用优化后的CTAB法提取对虾肝胰腺基因组，试剂容易获得，成本低，可以更加简便、快速地获取高质量的基因组。

(3)本方法中使用的定量引物以EHP的PTP2基因为靶标，该基因具有高特异性，能有效避免假阳性结果的产生。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为不同体系进行定量PCR的熔解曲线(模板为不同浓度的标准质粒，包含阴性对照、1.0×10¹、1.0×10³、1.0×10⁵、1.0×10⁷copies/μL)。

图2为不同浓度的标准质粒与Cq值对应的标准曲线(横坐标为拷贝浓度的对数，模板为不同浓度的标准质粒，包含阴性对照、1.0×10¹、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷copies/μL)。

图3为对本发明中的荧光定量PCR的特异性分析的扩增曲线图(图中1～5分别代表阴性对照、WSSV阳性核酸模板、SHIV阳性核酸模板、VP_AHPND阳性核酸模板与EHP阳性核酸模板)。

图4为对本发明中的荧光定量PCR的灵敏度分析的扩增曲线图(1～6分别代表阴性对照以及浓度为1.0×10¹、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵copies/μL的标准质粒模板)。

图5为普通PCR灵敏度分析的核酸凝胶电泳图，包含(1～6分别代表阴性对照以及浓度为1.0×10¹、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵copies/μL的标准质粒模板)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、样品的处理

对虾样品为市场上购买的凡纳滨对虾或来自于虾场提供的对虾样品，然后对虾肝胰腺组织提取基因组，具体步骤如下：

取虾肝胰腺进行充分研磨，将研磨后30mg的样品，加入500μL的CTAB裂解液(CTAB4g，NaCl 16.34g，1M的Tris-HCl(pH 8.0)20mL，0.5M的EDTA 8mL，灭菌双蒸水定容至200mL)，以及蛋白酶K溶液(20mg/mL)20μL，缓慢颠倒混匀，56℃保温1h。

加入400μL的酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1的混合液充分混匀后12000rmp离心10min，吸取上层液体于新的离心管中，并重复此步骤一次。

加入2倍体积的提前预冷(-20℃)的无水乙醇，充分混匀后于4℃、12000rmp离心10min，弃上清。

加入500μL的75％的乙醇，轻轻上下颠倒后于4℃、12000rmp离心2min，弃上清，并重复此步骤一次。

将EP管倒立于滤纸上静置5min，加入50μL ddH₂O溶解样品核酸作为待测样品模版，保存于-20℃。

实施例2、荧光定量PCR方法的建立

(1)荧光定量PCR引物的合成

根据EHP-PTP2基因(GenBank No.MT249228)序列，利用Primer Premier 5.0设计1对特异性引物EHP-PTP2-F：5'-gcagcactcaaggaatggc-3'(SEQ ID NO.1)及EHP-PTP2-R：

5'-tttcgttaggcttaccctgtga-3'(SEQ ID NO.2)，扩增目的片段理论大小为238bp，引物由上海生工合成。

(2)模板标准品的制备

引物的普通PCR扩增：以CTAB法提取的EHP阳性样品的基因组为模板，用上述设计的引物EHP-PTP2-F/EHP-PTP2-R进行常规PCR扩增获取目的产物。扩增体系为：PrimeSTAR预混DNA聚合酶(TaKaRa)25μL，上下游引物各0.2μM，模板1μL，加ddH₂O补至50μL。按照以下程序进行扩增：98℃预变性5min；98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸10s，40次循环，最后72℃后延伸10min；4℃保温。

构建pMD19-T载体的重组质粒：将上述普通PCR扩增产物连接至pMD19-T载体，16℃保温6h然后转入E.coli DH5α菌落中，挑取阳性菌落提取质粒并送上海生工测序验证。用超微量分光光度计(DeNovix)测定重组质粒DNA浓度，换算成拷贝浓度，将该重组质粒作为本实验标准品原液，-80℃保存。

(3)虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR方法的建立以及条件的优化

将构建好的质粒标准品进行梯度稀释，对虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR(qPCR-EHP)反应体系参照

qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)说明在冰上配制，10μL的反应体系以不同的终浓度的引物EHP-PTP2-F/EHP-PTP2-R为优化条件，以1.0×10¹、1.0×10³、1.0×10⁵、1.0×10⁷copies/μL作为定量反应的模板。扩增反应在实时荧光定量PCR仪(Roche

96)中进行，扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性10sec，60℃退火并延伸30sec，40个循环；熔解曲线阶段95℃，15sec，60℃60sec，95℃1sec；扩增体系如表1所示。

表1、扩增体系：(单位：μL)

通过对不同体系中荧光定量PCR反应的熔解曲线图(图1)进行分析，降低引物浓度使用体系3与体系4进行定量PCR扩增可有效排除非特异性扩增，同时为了保证体系的稳定性最终选择以体系3进行扩增反应：

qPCR SYBR Green Master Mix 5.0μL，EHP-PTP2-F 0.2μM，EHP-PTP2-R0.2μM，模板DNA 1.0μL，ddH₂O补足至10μL。

(4)标准曲线绘制

根据上述最优体系及反应程序，以1.0×10¹、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷copies/μL共7个不同拷贝浓度的标准质粒溶液为模板，以不含EHP的对虾肝胰腺基因组为阴性对照，建立不同浓度的标准质粒溶液与Cq值对应的标准曲线，如附图2所示。使用上述优化后的体系进行荧光定量PCR检测，包括标准样品及阴性对照，得到Cq值(Y)与模板起始量的对数(x)之间的关系为：Y＝-3.2751x+31.269，R²＝0.993，扩增效率为102％，为保证检测数据的可靠性，根据样品的扩增曲线，只有当Cq≤32时，检测结果才有意义。

(5)特异性分析

分别以感染了EHP、导致急性肝胰腺坏死综合症(Hepatopancreatic necrosisdisease,AHPND)的弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP_AHPND)、白斑综合征病毒(White spotsyndrome virus,WSSV)、对虾虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV)的对虾肝胰腺核酸为模板，进行荧光定量PCR扩增，对该定量检测引物的特异性进行分析。如附图3所示，仅在EHP阳性模板中出现扩增曲线，表明该检测方法的特异性高，满足对虾EHP的检测特异性需求。

(6)灵敏性试验

对已知EHP阳性基因组进行浓度检测，并按照拷贝浓度进行梯度稀释，以阴性对照及1.0×10¹、1.0×10²、1.0×10³、1.0×10⁴、1.0×10⁵copies/μL共5个不同数量级的标准质粒样品为模板分别进行荧光定量PCR和普通PCR扩增，均使用EHP-PTP2-F/EHP-PTP2-R这对引物进行扩增，扩增体系参照体系3(表1)。普通PCR使用PrimeSTAR预混DNA聚合酶(TaKaRa)，扩增程序为98℃预变性5min；98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸10s，40次循环，72℃后延伸10min；4℃保温。对比两种扩增方法引物的敏感性。如图4和图5所示，荧光定量PCR在模板拷贝浓度为10¹copies/μL时仍出现典型的S型扩增曲线，核酸凝胶显示在普通PCR扩增模板浓度为1.0×10³copies/μL时难以肉眼可见，表明该定量PCR方法可检测到的最低拷贝浓度为10¹copies/μL，比普通PCR灵敏度高出至少100倍。

(7)重复性分析

以不同浓度的EHP重组质粒样品为模板，由3名不同实验人员分别进行荧光定量PCR检测，通过Cq值计算出各操作人员间的标准差和变异系数，结果如表所示：

表2、荧光定量PCR检测方法的重复性

结果表明，3位操作人员的组间变异系数均小于1％，表明所建立的EHP荧光定量PCR方法具有良好的重复性。

实施例3、对虾肝胰腺样品中EHP的检测

对虾样品为重庆市场上购买的基围虾或来自于虾场提供的样品，取对虾肝胰腺进行充分研磨，使用CTAB法取30mg肝胰腺组织提取基因组，将待测样品基因组、标准样品、阴性对照或空白对照同时进行荧光定量PCR，通过标准曲线可以计算出待测样品中EHP的拷贝浓度，从而达到对样品中EHP定量检测的目的。部分实验结果如表3所示：

表3、定量检测对虾样品中EHP的拷贝浓度

结果显示，使用本发明的检测方法可以快速准确地对田间样品进行检测，因此可以用于生产上对虾样品中EHP的定量检测。

实施例4、PTP2-qPCR与SSU-qPCR两种检测方法差异性比较

参考已有专利(申请号：201610429433.8)我们合成了一对检测EHP的荧光定量PCR引物，EHP-SSU-F：5'-gatgcttggtgtgggagaa-3'(SEQ ID NO.3)与EHP-SSU-R:5'-cgccccatcaatttccaacg-3'(SEQ ID NO.4)，该引物针对的是EHP的SSU rRNA序列(GenBankNo.FJ496359.1)。以感染了EHP的病虾肝胰腺基因组为模板，对构建的以SSU序列为靶标的荧光定量方法(SSU-qPCR)和本方法中以PTP2序列为靶标的荧光定量方法(PTP2-qPCR)进行比较，两种检测方法的具体数据结果如表4所示：

表4.PTP2-qPCR与SSU-qPCR两种定量方法检测差异比较

利用GraphPad Prism 6软件对两组检测结果分析P值为0.2907，表明使用本发明中的定量方法与以SSU为检测靶标的定量方法对EHP感染对虾样品进行检测时，结果并无明显差别，说明本发明中所建立的荧光定量PCR方法具有较高的可信度。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 虾肝肠胞虫检测试剂盒及其检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagcactca aggaatggc 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttcgttagg cttaccctgt ga 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatgcttggt gtgggagaa 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgccccatca atttccaacg 20

<210> 5

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagtcttt ataatgcact ggtgctatta actactataa aagcaggaac agtaaacatg 60

cctttgcctg gacaaggaca aaacaatgcg caacaagatc caattgcaag acacattcag 120

gacatgaagg tggaaacaga agaagcaaaa agaagggctg cagcagaatg ccagcagagc 180

ctcatagaga aaaacgtaca ggtagatggt gcacaacaaa aagtagatcc ttctgagttt 240

actgcgtgtg ttgaagcaaa aaagaagaaa ttattccagt tgtcaaagtc aatcaattca 300

ctcattaaaa atgaaatgtc aaagccaatt caaaagccat gcgtggtcaa attaaaccag 360

gcaaccaaaa actgctacac aaaggcagca ctcaaggaat ggctcaaggg ttcaaaatac 420

agtttggatg tgtttaagaa cgtagttgaa atatggaaca cagaaaaaga aaagttgata 480

gcaatgattg ttcatgaaac accaaagtac gagttaattt taccaccaaa agtatgcaag 540

tctttcttta aaagaccttc atataagatg gacgtaaaca gggcaggaga tatgatcaat 600

tcacagggta agcctaacga aaagaaggac attgcaaagg attgcaggcc atgcagcgac 660

tttgctaaca ccacagaagg tgcatttgca gagtgcaaga acacatgcga tccaatgtct 720

atgattgtca atgttagcga tagcatccac acagtacaca ggccaaccac cttaccatct 780

ggtaaagatg accataaaaa gccaactcca tctgaaagtg aaataaacaa tgaaacatta 840

acatccaacg aataa 855

Claims (8)

1.一种虾肝肠胞虫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有以PTP2基因为检测靶基因的引物对，所述PTP2基因的序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有

qPCR SYBRGreen Master Mix和ddH₂O。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应体系为

qPCRSYBR Green Master Mix 5.0μL，上游引物0.2μM，下游引物0.2μM，模板DNA 1.0μL，ddH₂O补足至10μL。

5.利用权利要求1～4任一项所述试剂盒检测虾肝肠胞虫的方法，其特征在于：提取对虾肝胰腺组织提取基因组，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行实时荧光定量PCR，然后根据以标准品建立的标准曲线计算得到拷贝数。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性10sec，60℃退火并延伸30sec，40个循环；熔解曲线阶段95℃，15sec，60℃60sec，95℃1sec。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述试剂盒的反应体系为：

qPCRSYBR Green Master Mix 5.0μL，上游引物0.2μM，下游引物0.2μM，模板DNA 1.0μL，ddH₂O补足至10μL。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述标准曲线中Cq值与模板起始量的对数之间的关系为：Y＝-3.2751x+31.269，R²＝0.993，其中Y为Cq值，x为模板起始量的对数值。

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