CN110904278B - 13型高危hpv多重荧光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种13型高危HPV多重荧光检测试剂盒，包括热启动Taq酶系统、dUTP‑UDG防污染体系，加尾引物、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性探针；本发明的试剂盒适用于定性检测宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中13种可引起宫颈癌的高风险HPV基因型，并对16和18两种基因型进行分型；本试剂盒应用同源加尾系统降低了多个引物之间的干扰，实现了在同一管荧光PCR扩增体系中检测13种HPV基因型，本发明的检测试剂盒，检测通量高，大大降低了筛查成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种13型高危HPV多重荧光检测试剂盒，特别涉及一种基于HAND系统的多重高危HPV荧光检测试剂盒，并对16和18两种基因型进行分型。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30-35岁，浸润癌高发年龄为45-55岁，目前其发病有年轻化的趋势。宫颈癌的早期筛查和发现及治疗是有效防治宫颈癌的关键。
研究表明，宫颈癌的主要病原体是人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)，属于乳多空病毒科，乳头瘤空泡病毒A属，球形DNA病毒，能引起人体皮肤黏膜鳞状上皮增殖。目前已经确定的HPV型别有190余种，约50余种定向感染人体生殖道皮肤及黏膜的复层鳞状上皮。在临床上根据HPV不同亚型致病力大小将HPV分为高危型、中危型和低危型三大类。中、高危型除可引起生殖器疣外，还可引起生殖器癌、宫颈癌，是造成宫颈癌的主要病原体，约99％宫颈癌是由高危HPV持续或反复感染所致；而低危HPV主要引起男女外生殖器的尖锐湿疣等良性病变，如不及时诊断和治疗也有可能发展成癌变。尤其是HPV16和18与宫颈癌的关系非常密切，HPV16主要引发鳞癌，HPV18主要与腺癌相关。因此对HPV亚型的准确分型检测对宫颈癌和其他疣类病变的早起诊断和治疗具有重要意义。
现有的运用荧光PCR进行高危型人乳头瘤病毒基因分型检测技术的缺点是，单独型别的检测耗时长，多个型别的检测因为引物之间的干扰而导致检测灵敏度降低。本试剂盒采用同源加尾系统(Homo-Tag Assisted Non-Dimer，HAND)，在特异引物的5’端添加一段通用引物序列，先使目的基因得到富集并在产物两端加上通用引物序列，接下来通用引物最终完成整个多重扩增反应。这种方法使多对特异引物介导的多重扩增转变为由一个通用引物介导的PCR反应，大大降低了PCR反应的复杂性，具有实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种13型高危HPV多重荧光检测试剂盒，并对16和18两种基因型进行分型。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
13型高危HPV多重荧光检测试剂盒，包括热启动Taq酶系统、dUTP-UDG防污染体系，加尾引物、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，加尾引物的序列如下：
引物1 CAACGGGTCACGTAGCGAGATGAAATAGATGGTCCAGCT(SEQ ID NO:1)
引物2 CAACGGGTCACGTAGCGACGCACAACCGAAGCGTAG(SEQ ID NO:2)
引物3 CAACGGGTCACGTAGCGAGAAGAAAACGATGAAATAGATGGA(SEQ ID NO:3)
引物4 CAACGGGTCACGTAGCGACATTGTGTGACGTTGTGGTTC(SEQ ID NO:4)
引物5 CAACGGGTCACGTAGCGAAGACCGTTGTGTCCAGAAGA(SEQ ID NO:5)
引物6 CAACGGGTCACGTAGCGAGGGTTTCAGTACGAGGTCTTCTC(SEQ ID NO:6)
引物7 CAACGGGTCACGTAGCGATTTCGGGTCGTTGGGCA(SEQ ID NO:7)
引物8 CAACGGGTCACGTAGCGAGGCGTTTTTACACGTCACAGT(SEQ ID NO:8)
引物9 CAACGGGTCACGTAGCGACGCTGTGTCCAGTTGAAAAGC(SEQ ID NO:9)
引物10 CAACGGGTCACGTAGCGACCTCGGTTTCTCTACGTGTTG(SEQ ID NO:10)
引物11 CAACGGGTCACGTAGCGACTTGCATGACATTACAATAGCCTG(SEQ ID NO:11)
引物12 CAACGGGTCACGTAGCGAGGCATGCAGCTAGTGGTTC(SEQ ID NO:12)
引物13 CAACGGGTCACGTAGCGAAGAGGAGGAAAACGATGAAGC(SEQ ID NO:13)
引物14 CAACGGGTCACGTAGCGAGCTCAATTCTGCCGTCACAC(SEQ ID NO:14)
引物15 CAACGGGTCACGTAGCGACAAAGACCACTTGGGCCTG(SEQ ID NO:15)
引物16 CAACGGGTCACGTAGCGACGTGTACGTTGCCAGCAA(SEQ ID NO:16)
引物17 CAACGGGTCACGTAGCGACAACTGACCTACACTGCTATGAG(SEQ ID NO:17)
引物18 CAACGGGTCACGTAGCGAGTAGTAATTGCTTGTGGCTTGTTC(SEQ ID NO:18)
引物19 CAACGGGTCACGTAGCGAGCATTGTGACAGAAAAAGACG(SEQ ID NO:19)
引物20 CAACGGGTCACGTAGCGAGGTTCTCTAGATGTTTGTCTCCAG(SEQ ID NO:20)
引物21 CAACGGGTCACGTAGCGATTTCGGGTCGTTGGACA(SEQ ID NO:21)
引物22 CAACGGGTCACGTAGCGATGGCGTTGTTACAGGTTACACT(SEQ ID NO:22)
引物23 CAACGGGTCACGTAGCGAGGACAGTGTCGTGGGTGT(SEQ ID NO:23)
引物24 CAACGGGTCACGTAGCGAGTGTTGCTTTTGGTCCATGC(SEQ ID NO:24)
引物25 CAACGGGTCACGTAGCGAGCTATTTCACAACCCTGAGGA(SEQ ID NO:25)
引物26 CAACGGGTCACGTAGCGACACAGTCTATTGTAACGTCATGCA(SEQ ID NO:26)；
上述的引物分为两部分：特异引物和通用引物，通用引物在特异引物的5’端，其中，13型高危HPV多重荧光检测试剂盒引物1-26分别用于HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68；
优选的，上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒中使用的通用引物的序列如下：
引物27CAACGGGTCACGTAGCGA(SEQ ID NO:27)。
优选的，上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒中使用的探针的序列如下：
探针1 TGGGCTCTGTCCGGTTCTGC(SEQ ID NO:28)
探针2 CTCGTCGGGCTGGTAAATGTTGATG(SEQ ID NO:29)
探针3 TGCAACGTCCTGTCCACCTTCCTC(SEQ ID NO:30)
探针4 CGTCGAGACCTCCAACACACCGC(SEQ ID NO:31)
探针5 CCGACCTGTCCACCGTCCAC(SEQ ID NO:32)
探针6 CCTCGGTTTGCTGTAGTGGTCGTC(SEQ ID NO:33)
探针7 AGTCATGCACAACTACCAGCCCGAC(SEQ ID NO:34)
探针8 CGCATTGCCCCGTCCAACG(SEQ ID NO:35)
探针9 TGTCCATCTGGCCGGTCCAC(SEQ ID NO:36)
探针10 CACATGGTTGGACCGGGTCATG(SEQ ID NO:37)
探针11 CGTCGGGGTCTCCAACACACTGC(SEQ ID NO:38)
探针12 CCTAAGACAGCAACGACAAGCGCG(SEQ ID NO:39)
探针13 CCAATGTCCTGCACAGGTCTGGC(SEQ ID NO:40)。
优选的，上述探针1用于检测常见高风险HPV16；探针2用于检测常见高风险HPV18；探针3-13用于检测常见高风险HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。
优选的，上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒设有内标引物及内标探针，内标引物及内标探针的目标片段为人源基因RNAseP的一段，内标引物的序列如下：
引物28 CGGAGGGAAGCTCATCA(SEQ ID NO:41)
引物29 CCCTAGTCTCAGACCTTCCCA(SEQ ID NO:42)；
内标探针的序列如下：
探针14 CAGGACGCACTCAGCTCGTGG(SEQ ID NO:43)。
优选的，上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒所使用的热启动Taq酶系统中含有经过生物学修饰的热启动Taq酶，dNTPs，dUTP和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为4U，dNTPs为200nM，dUTP为200nM，UDG酶为0.2U。
优选的，上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒为4色荧光检测试剂盒，其探针1连接的荧光基团为FAM，探针2连接的荧光基团为ROX，探针3-13连接的荧光基团为HEX，探针14连接的荧光基团为cy5。
优选的，上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒还设有DNA提取液，DNA提取液的成分为SDS的浓度为0.5-1％(v/v)，氯化钠的浓度为0.2-0.5mol/L，Tris-Hcl的浓度为20-50mmol/L(pH 8.0)，EDTA的浓度为5-10mmol/L，Tween 20的浓度为0.5-2％(v/v)。
由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：
本专利的检测方法简便易操作，搭配常用的荧光定量PCR仪，一管反应可同时获得13型高危HPV的检测结果，并且本试剂盒配有内标，即检测人的一段基因，对样本进行控制，在目标HPV所有基因型都为阴性的情况下，如果内标也为阴性，说明样本降解或核酸含量较少或存在抑制，需要重新提取核酸或进行纯化处理，再进行荧光PCR检测。
一般的多重PCR经常会因为各扩增片段相互竞争资源，导致高丰度的模板容易被检测到，低丰度的模板因扩增受抑制而成为假阴性。本专利利用了加尾系统，在特异引物的5’端添加一段通用引物序列，首先使目的基因得到富集并在产物两端加上通用引物序列，接下来通用引物最终完成整个多重扩增反应。这种方法使多重扩增转变为由一个通用引物介导的扩增，大大降低了PCR反应的复杂性，避免因引物、模板之间的差异造成的扩增不一致的情况。
附图说明
图1是HPV16的扩增曲线；
图2是HPV18的扩增曲线；
图3是HPV31的扩增曲线；
图4是HPV33的扩增曲线；
图5是HPV35的扩增曲线；
图6是HPV39的扩增曲线；
图7是HPV45的扩增曲线；
图8是HPV51的扩增曲线；
图9是HPV52的扩增曲线；
图10是HPV56的扩增曲线；
图11是HPV58的扩增曲线；
图12是HPV59的扩增曲线；
图13是HPV68的扩增曲线；
图14是内标的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。
13型高危HPV多重荧光检测试剂盒，包括热启动Taq酶系统、dUTP-UDG防污染体系，加尾引物、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，加尾引物的序列如下：
引物1 CAACGGGTCACGTAGCGAGATGAAATAGATGGTCCAGCT(SEQ ID NO:1)
引物2 CAACGGGTCACGTAGCGACGCACAACCGAAGCGTAG(SEQ ID NO:2)
引物3 CAACGGGTCACGTAGCGAGAAGAAAACGATGAAATAGATGGA(SEQ ID NO:3)
引物4 CAACGGGTCACGTAGCGACATTGTGTGACGTTGTGGTTC(SEQ ID NO:4)
引物5 CAACGGGTCACGTAGCGAAGACCGTTGTGTCCAGAAGA(SEQ ID NO:5)
引物6 CAACGGGTCACGTAGCGAGGGTTTCAGTACGAGGTCTTCTC(SEQ ID NO:6)
引物7 CAACGGGTCACGTAGCGATTTCGGGTCGTTGGGCA(SEQ ID NO:7)
引物8 CAACGGGTCACGTAGCGAGGCGTTTTTACACGTCACAGT(SEQ ID NO:8)
引物9 CAACGGGTCACGTAGCGACGCTGTGTCCAGTTGAAAAGC(SEQ ID NO:9)
引物10 CAACGGGTCACGTAGCGACCTCGGTTTCTCTACGTGTTG(SEQ ID NO:10)
引物11 CAACGGGTCACGTAGCGACTTGCATGACATTACAATAGCCTG(SEQ ID NO:11)
引物12 CAACGGGTCACGTAGCGAGGCATGCAGCTAGTGGTTC(SEQ ID NO:12)
引物13 CAACGGGTCACGTAGCGAAGAGGAGGAAAACGATGAAGC(SEQ ID NO:13)
引物14 CAACGGGTCACGTAGCGAGCTCAATTCTGCCGTCACAC(SEQ ID NO:14)
引物15 CAACGGGTCACGTAGCGACAAAGACCACTTGGGCCTG(SEQ ID NO:15)
引物16 CAACGGGTCACGTAGCGACGTGTACGTTGCCAGCAA(SEQ ID NO:16)
引物17 CAACGGGTCACGTAGCGACAACTGACCTACACTGCTATGAG(SEQ ID NO:17)
引物18 CAACGGGTCACGTAGCGAGTAGTAATTGCTTGTGGCTTGTTC(SEQ ID NO:18)
引物19 CAACGGGTCACGTAGCGAGCATTGTGACAGAAAAAGACG(SEQ ID NO:19)
引物20 CAACGGGTCACGTAGCGAGGTTCTCTAGATGTTTGTCTCCAG(SEQ ID NO:20)
引物21 CAACGGGTCACGTAGCGATTTCGGGTCGTTGGACA(SEQ ID NO:21)
引物22 CAACGGGTCACGTAGCGATGGCGTTGTTACAGGTTACACT(SEQ ID NO:22)
引物23 CAACGGGTCACGTAGCGAGGACAGTGTCGTGGGTGT(SEQ ID NO:23)
引物24 CAACGGGTCACGTAGCGAGTGTTGCTTTTGGTCCATGC(SEQ ID NO:24)
引物25 CAACGGGTCACGTAGCGAGCTATTTCACAACCCTGAGGA(SEQ ID NO:25)
引物26 CAACGGGTCACGTAGCGACACAGTCTATTGTAACGTCATGCA(SEQ ID NO:26)。
上述的引物分为两部分：特异引物和通用引物，通用引物在特异引物的5’端，其中，13型高危HPV多重荧光检测试剂盒引物1-26分别用于HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。
上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒中使用的通用引物序列如下：
引物27CAACGGGTCACGTAGCGA(SEQ ID NO:27)；
上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒中使用的探针序列如下：
探针1 TGGGCTCTGTCCGGTTCTGC(SEQ ID NO:28)
探针2 CTCGTCGGGCTGGTAAATGTTGATG(SEQ ID NO:29)
探针3 TGCAACGTCCTGTCCACCTTCCTC(SEQ ID NO:30)
探针4 CGTCGAGACCTCCAACACACCGC(SEQ ID NO:31)
探针5 CCGACCTGTCCACCGTCCAC(SEQ ID NO:32)
探针6 CCTCGGTTTGCTGTAGTGGTCGTC(SEQ ID NO:33)
探针7 AGTCATGCACAACTACCAGCCCGAC(SEQ ID NO:34)
探针8 CGCATTGCCCCGTCCAACG(SEQ ID NO:35)
探针9 TGTCCATCTGGCCGGTCCAC(SEQ ID NO:36)
探针10 CACATGGTTGGACCGGGTCATG(SEQ ID NO:37)
探针11 CGTCGGGGTCTCCAACACACTGC(SEQ ID NO:38)
探针12 CCTAAGACAGCAACGACAAGCGCG(SEQ ID NO:39)
探针13 CCAATGTCCTGCACAGGTCTGGC(SEQ ID NO:40)。
上述探针1用于检测常见高风险HPV16；探针2用于检测常见高风险HPV18；探针3-13用于检测常见高风险HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。
上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒设有内标引物及内标探针，内标引物及内标探针的目标片段为人源基因RNAseP的一段，内标引物的序列如下：
引物28 CGGAGGGAAGCTCATCA(SEQ ID NO:41)
引物29 CCCTAGTCTCAGACCTTCCCA(SEQ ID NO:42)；
内标探针的序列如下：
探针14 CAGGACGCACTCAGCTCGTGG(SEQ ID NO:43)。
上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒所使用的热启动Taq酶系统中含有经过生物学修饰的热启动Taq酶，dNTPs，dUTP和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为4U，dNTPs为200nM，dUTP为200nM，UDG酶为0.2U。
上述13型高危HPV多重荧光检测试剂盒为4色荧光检测试剂盒，其探针1连接的荧光基团为FAM，探针2连接接的荧光基团为ROX，探针3-13连接的荧光基团为HEX，探针14连接的荧光基团为cy5。
主要组成成分见下表：
检测操作如下：
1、样本处理与DNA提取
1)将含有宫颈刷的收集管(内含保存液)震荡60秒，使细胞充分落入保存液中。若收集管中没有保存液，则加入2ml灭菌生理盐水(务必使拭子头完全浸入液体中)，充分震荡。将收集管中的液体(保存液或生理盐水)取2ml转至相应编号的2ml离心管；
2)将上述步骤1)的2ml离心管10,000rpm离心5分钟，弃上清；
3)向步骤2)的离心管中加入1ml生理盐水，震荡30秒，10,000rpm离心5分钟，弃上清；
4)向步骤3)的样品沉淀中加入100μl DNA提取液，充分混匀后于95-100℃下处理5-10min，备用。
DNA的提取可以使用其他公知的方法进行。
2、核酸扩增试剂准备(试剂准备区，冰上操作)
1)从试剂盒中取出HPV PCR反应管，冰上放置，直至完全溶解，瞬时离心备用；
2)往上述反应管中分别加入提取后的待测样本核酸20μl(如样本不足20μl，请用灭菌纯化水补足20μl后加样)、阴性质控品、阳性质控品各20μl。盖紧管盖，5000rpm离心30秒后转移至扩增区；
3)PCR扩增
可在Roche，ABI，bioRAD等可接收FAM，HEX/VIC，ROX/TEXAS RED，CY-5的4色荧光信号的PCR仪上进行扩增。
PCR扩增参数设定为：
60℃时检测荧光值，HPV16的扩增情况由FAM荧光信号表示，HPV18的扩增情况由ROX荧光信号表示，HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68的扩增情况由HEX荧光信号表示，内标的扩增情况由CY-5荧光信号表示。根据荧光值变化曲线，确定检测结果。图1-图14为本试剂盒检测HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68的扩增曲线，以及检测人基因内标的扩增曲线。每种HPV型别选2个不同浓度的阳性样本和一个阴性样本进行检测，检测结果与实际情况完全符合。
3、质控标准如下：
使用本试剂盒，以上两项需在一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，实验应重新进行。
4、结果分析
(1)实验结束后，根据相关仪器的软件进行分析，调节噪声容限至基线噪声以上，使阴性对照Ct值不出现任何数值。
(2)阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。
(3)记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。
结果判断如下：
5、产品性能指标：
本试剂盒能特异检测HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，以上各型别之间，或与其他型别HPV之间和常见性病病原体(CT、NG、HSV、UU等)之间都无交叉反应。
检测10份企业阳性参考品、10份企业阴性参考品，符合率为100％；1份企业检测限参考品重复检测20次，检测结果至少17次阳性；企业精密性参考品重复检测10次，结果Ct值变异系数(CV)≤5％。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 申友基因组研究院（南京）有限公司
<120> 13型高危HPV多重荧光检测试剂盒
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacgggtca cgtagcgaga tgaaatagat ggtccagct 39
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caacgggtca cgtagcgacg cacaaccgaa gcgtag 36
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caacgggtca cgtagcgaga agaaaacgat gaaatagatg ga 42
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caacgggtca cgtagcgaca ttgtgtgacg ttgtggttc 39
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caacgggtca cgtagcgaag accgttgtgt ccagaaga 38
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caacgggtca cgtagcgagg gtttcagtac gaggtcttct c 41
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caacgggtca cgtagcgatt tcgggtcgtt gggca 35
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caacgggtca cgtagcgagg cgtttttaca cgtcacagt 39
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caacgggtca cgtagcgacg ctgtgtccag ttgaaaagc 39
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caacgggtca cgtagcgacc tcggtttctc tacgtgttg 39
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caacgggtca cgtagcgact tgcatgacat tacaatagcc tg 42
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caacgggtca cgtagcgagg catgcagcta gtggttc 37
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caacgggtca cgtagcgaag aggaggaaaa cgatgaagc 39
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caacgggtca cgtagcgagc tcaattctgc cgtcacac 38
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caacgggtca cgtagcgaca aagaccactt gggcctg 37
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caacgggtca cgtagcgacg tgtacgttgc cagcaa 36
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caacgggtca cgtagcgaca actgacctac actgctatga g 41
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caacgggtca cgtagcgagt agtaattgct tgtggcttgt tc 42
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caacgggtca cgtagcgagc attgtgacag aaaaagacg 39
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caacgggtca cgtagcgagg ttctctagat gtttgtctcc ag 42
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caacgggtca cgtagcgatt tcgggtcgtt ggaca 35
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caacgggtca cgtagcgatg gcgttgttac aggttacact 40
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caacgggtca cgtagcgagg acagtgtcgt gggtgt 36
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caacgggtca cgtagcgagt gttgcttttg gtccatgc 38
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caacgggtca cgtagcgagc tatttcacaa ccctgagga 39
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caacgggtca cgtagcgaca cagtctattg taacgtcatg ca 42
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caacgggtca cgtagcga 18
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgggctctgt ccggttctgc 20
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctcgtcgggc tggtaaatgt tgatg 25
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tgcaacgtcc tgtccacctt cctc 24
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cgtcgagacc tccaacacac cgc 23
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccgacctgtc caccgtccac 20
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cctcggtttg ctgtagtggt cgtc 24
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agtcatgcac aactaccagc ccgac 25
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cgcattgccc cgtccaacg 19
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tgtccatctg gccggtccac 20
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cacatggttg gaccgggtca tg 22
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgtcggggtc tccaacacac tgc 23
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cctaagacag caacgacaag cgcg 24
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccaatgtcct gcacaggtct ggc 23
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cggagggaag ctcatca 17
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccctagtctc agaccttccc a 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
caggacgcac tcagctcgtg g 21
Claims (3)
1.13型高危HPV多重荧光检测试剂盒，包括热启动Taq酶系统、dUTP-UDG防污染体系，加尾引物、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，其特征在于：所述加尾引物为HPV特异性引物，加尾引物的序列如下：
引物1CAACGGGTCACGTAGCGAGATGAAATAGATGGTCCAGCT
引物2CAACGGGTCACGTAGCGACGCACAACCGAAGCGTAG
引物3CAACGGGTCACGTAGCGAGAAGAAAACGATGAAATAGATGGA
引物4CAACGGGTCACGTAGCGACATTGTGTGACGTTGTGGTTC
引物5CAACGGGTCACGTAGCGAAGACCGTTGTGTCCAGAAGA
引物6CAACGGGTCACGTAGCGAGGGTTTCAGTACGAGGTCTTCTC
引物7CAACGGGTCACGTAGCGATTTCGGGTCGTTGGGCA
引物8CAACGGGTCACGTAGCGAGGCGTTTTTACACGTCACAGT
引物9CAACGGGTCACGTAGCGACGCTGTGTCCAGTTGAAAAGC
引物10CAACGGGTCACGTAGCGACCTCGGTTTCTCTACGTGTTG
引物11CAACGGGTCACGTAGCGACTTGCATGACATTACAATAGCCTG
引物12CAACGGGTCACGTAGCGAGGCATGCAGCTAGTGGTTC
引物13CAACGGGTCACGTAGCGAAGAGGAGGAAAACGATGAAGC
引物14CAACGGGTCACGTAGCGAGCTCAATTCTGCCGTCACAC
引物15CAACGGGTCACGTAGCGACAAAGACCACTTGGGCCTG
引物16CAACGGGTCACGTAGCGACGTGTACGTTGCCAGCAA
引物17CAACGGGTCACGTAGCGACAACTGACCTACACTGCTATGAG
引物18CAACGGGTCACGTAGCGAGTAGTAATTGCTTGTGGCTTGTTC
引物19CAACGGGTCACGTAGCGAGCATTGTGACAGAAAAAGACG
引物20CAACGGGTCACGTAGCGAGGTTCTCTAGATGTTTGTCTCCAG
引物21CAACGGGTCACGTAGCGATTTCGGGTCGTTGGACA
引物22CAACGGGTCACGTAGCGATGGCGTTGTTACAGGTTACACT
引物23CAACGGGTCACGTAGCGAGGACAGTGTCGTGGGTGT
引物24CAACGGGTCACGTAGCGAGTGTTGCTTTTGGTCCATGC
引物25CAACGGGTCACGTAGCGAGCTATTTCACAACCCTGAGGA
引物26CAACGGGTCACGTAGCGACACAGTCTATTGTAACGTCATGCA；
上加尾引物的5’端连接有通用序列，通用引物的序列如下：
引物27CAACGGGTCACGTAGCGA；
所述荧光探针为HPV特异性探针，HPV特异性探针的序列如下：
探针1TGGGCTCTGTCCGGTTCTGC
探针2CTCGTCGGGCTGGTAAATGTTGATG
探针3TGCAACGTCCTGTCCACCTTCCTC
探针4CGTCGAGACCTCCAACACACCGC
探针5CCGACCTGTCCACCGTCCAC
探针6CCTCGGTTTGCTGTAGTGGTCGTC
探针7AGTCATGCACAACTACCAGCCCGAC
探针8CGCATTGCCCCGTCCAACG
探针9TGTCCATCTGGCCGGTCCAC
探针10CACATGGTTGGACCGGGTCATG
探针11CGTCGGGGTCTCCAACACACTGC
探针12CCTAAGACAGCAACGACAAGCGCG
探针13CCAATGTCCTGCACAGGTCTGGC；
所述试剂盒内还设有内标引物及内标探针，内标引物的序列如下：
引物28CGGAGGGAAGCTCATCA
引物29CCCTAGTCTCAGACCTTCCCA；
内标探针的序列如下：
探针14CAGGACGCACTCAGCTCGTGG。
2.根据权利要求1所述的13型高危HPV多重荧光检测试剂盒，其特征在于：所述热启动Taq酶系统中含有经过生物学修饰的热启动Taq酶，dNTPs，dUTP和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为4U，dNTPs为200nM，dUTP为200nM，UDG酶为0.2U。
3.根据权利要求1-2任一项所述的13型高危HPV多重荧光检测试剂盒，其特征在于：所述的多重荧光检测试剂盒为4色高危荧光检测试剂盒，其探针1连接的荧光基团为FAM，探针2连接的荧光基团为ROX，探针3-13连接的荧光基团为HEX，探针14连接的荧光基团为cy5。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Type 13 High Risk HPV Multiple Fluorescence Detection Kit Granted publication date: 20230117 Pledgee: Bank of China Limited Nanjing Jiangbei New Area Branch Pledgor: Shenyou Genomics Research Institute (Nanjing) Co.,Ltd. Registration number: Y2024980011460 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |