CN102154524A - 12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒，包括：(1)具有仅与12种高危型HPV的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：1～12的探针及SEQ ID No：13～36的引物；(2)与高危型HPV16的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：37的探针及SEQ ID No：38～39的引物；(3)与高危型HPV18的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：40的探针及SEQ ID No：41～42的引物；(4)与细胞内β-globin基因的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：43的探针及SEQ ID No：44～45的引物；其中，上述每组探针分别标记最大发射波长518nm、538～553nm、574～575、607～615、640、666～667、690染料的其中一种并且不同。本发明的试剂盒可以最大限度减轻我国HPV基因检测所带来的巨额费用，同时保护人民的身体健康。

Description

12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因领域，具体是一种12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒。

背景技术

人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)自20世纪70年代末到20世纪80年代初发现与宫颈癌相关以来，一直受人们的关注。大量的研究结果表明：HPV在宫颈细胞异常以及宫颈癌的病理学上具有最为重要的作用。目前，100多种HPV基因型已被鉴定，其中约40种与生殖道感染相关。高危型主要与宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)II、III级和宫颈癌的发生相关。低危型一般与恶性病变无关，主要引起尖锐湿疣和低级别CIN(CINI)。

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌，在女性恶性肿瘤中居第二位。据统计，世界范围内每年大约有46.6万左右的宫颈癌新发病例，其中80％的病例发生在发展中国家。上世纪50年代，我国就开始积极开展宫颈癌的防治工作，使得宫颈癌的死亡率由上世纪70年代的10.28/10万下降到了上世纪90年代的3.25/10万。尽管在过去的20年间，我国宫颈癌的死亡率大幅下降，但是每年仍然有新发病例13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的28.2％。特别是中西部的部分地区，宫颈癌的死亡率与发病率几十年却始终居高不 下，如甘肃武都、山西阳城等县，宫颈癌死亡率高达36.00/10万，超过全国宫颈癌死亡率的10倍，远高于世界平均水平8.00/10万。造成这种现象的原因除与当地的经济水平等因素有关外，同时与宫颈癌的筛查有关，目前临床上常用的宫颈细胞学检查方法主要有两种：巴氏涂片法(即宫颈刮片)和液基薄层细胞学检查法(TCT)，由于主观因素的影响，这两种方法的假阴性较高，容易造成漏诊。因此，采用合理、廉价的筛查方法，对提早预防、诊断和治疗宫颈癌有非常重要的意义。

早在1977年，Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中有人乳头状瘤病毒(HPV)颗粒的存在，以及Zur Hausen提出HPV病毒与宫颈癌发病相关联的假设后，国内外学者进行了大量的研究，并在1995年的IARC专题讨论会上通过HPV感染是宫颈癌的主要原因，即HPV感染是宫颈癌发生的必要条件。临床证明95-99.7％的宫颈癌病例和高危型HPV病毒感染有关。在过去10年的研究中，通过DNA检测技术已持续发现90％以上的宫颈癌病人都有HPV感染。至今发现的HPV病毒约有100多种，但并非所有的病毒都会引起宫颈癌，根据HPV感染人体后可致宫颈癌的相关性，分为低危型HPV以及高危型HPV，低危型HPV可导致生殖器尖锐湿疣，影响生活质量；高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度宫颈上皮内瘤，其已明确的病毒亚型主要有HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59型和HPV68型等。来自世界范围的宫颈癌组织标本的研究发现， HPV16和HPV18型感染率最高，在检出的所有型别中，HPV16占50％，HPV18占14％，HPV45占8％，HPV31占5％，其他型别的HPV占23％。HPV16、18型感染很普遍，没有明显的地区差异。但是有些HPV型别的感染有地区差异，如HPV45型在非洲西部很常见，而HPV39和59型仅在美洲的中部和南部出现，HPV52，58则在中国妇女中检出率较高。HPV的型别还与宫颈癌的病理类型有关，在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16为主(占51％)，而在宫颈腺癌和宫颈腺鳞细胞癌中HPV18分别占56％和39％。

高危型HPV导致癌症的机会较高，在99.8％的宫颈癌患者中发现HPV的感染，现已知至少有13种高危型HPV与95％的早期浸润和浸润性子宫颈癌有关。HPV感染使得宫颈癌的相对危险性增加250倍，因此提早诊断HPV感染，防止其向宫颈癌演变有着非常重要的意义。

世界卫生组织明确提出13种HPV高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)应该单独或联同细胞学应用于宫颈癌筛查。美国国立综合癌症网络(NCCN)宫颈癌筛查实践指南及美国阴道镜检查与子宫颈病理学会(ASCCP)另外指出，检测13种高危型HPV时，HPV16和HPV18必须特别重视。它们明确指出即使宫颈细胞学无异常而HPV阳性的30岁以上女性，如其为HPV16、HPV18感染者，应立即进行阴道镜检查。因此，HPV分型检测，特别是HPV16、HPV18的分型检测比13种高危型综合笼统归类检测更具临床指导意义。

现有产品HPV核酸扩增分型检测试剂盒，如凯普人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒，广泛应用于宫颈疾病的诊治全过程，临床 中发挥重要作用，降低宫颈病变漏诊和避免过度诊断治疗，目前已成为宫颈疾病后续的随访指标。但是，如果用于大规模人群筛查即嫌成本较高，且操作要求严格复杂而费事。

至于美国HC2捕获杂交法13种高危型检测试剂盒及国内“13种高危型HPV核酸扩增荧光检测试剂盒”具有操作简单，自动化程度高的优点，但都无法区分具体HPV型，无法鉴定HPV16和HPV18。所以，无论作为临床还是筛查，也存在较明显的缺陷与不足。

为此，如果在荧光PCR(Real-Time PCR)核酸检测技术平台，开发一种能同一反应管就可以将高危型HPV检测又能将HPV16、HPV18分型的高效产品，既满足筛查要求又更好提供临床指导。另外，根据学术界最新的共识，认为HPV66也是高危型，虽然在宫颈癌病人中感染比例较低。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒，包括：

(1)具有仅与12种高危型HPV(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：1～12的探针及SEQ ID No：13～36的引物；

(2)与高危型HPV16的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：37的探针及SEQ ID No：38～39的引物；

(3)与高危型HPV18的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：40 的探针及SEQ ID No：41～42的引物；

(4)与细胞内β-globin基因的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：43的探针及SEQ ID No：44～45的引物；

其中，上述每组探针分别标记最大发射波长518nm、538～553nm、574～575、607～615、640、666～667、690染料的其中一种并且不同。

具体探针和引物的核苷酸排列顺序如下：

序列号	名称	序列(5′-3′)
			SEQ ID NO 1	HPV31 probe	CTGTCTGTCT GTCA
SEQ ID NO 2	HPV33 probe	TGACATACAG ACAGACA
			SEQ ID NO 3	HPV35 probe	TCTACATCTG ACTGC
SEQ ID NO 4	HPV39 probe	CACTGCTGTC TGTAT
			SEQ ID NO 5	HPV45 probe	CATAGACAGA CTGC
SEQ ID NO 6	HPV51 probe	ACACAGCCAT AGTC
			SEQ ID NO 7	HPV52 probe	CACTGCTGCT GTCA
SEQ ID NO 8	HPV56 probe	TTCAACAATC CACAGG
			SEQ ID NO 9	HPV58 probe	CTATCGTCTG CTGT
SEQ ID NO 10	HPV59 probe	ACAGCGTATC AGCAGC
			SEQ ID NO 11	HPV66 probe	TGTCTACTCG TATGTCT
SEQ ID NO 12	HPV68 probe	TCACTGTCAT CTGT
			SEQ ID NO 13	HPV31 primer1	GAGCACACAA GTAGATATTC
SEQ ID NO 14	HPV31 primer2	GTCCTCTGAA ATGTTGTC

SEQ ID NO 15	HPV33 primer1	CGTCTATATC TAGCAACCA
			SEQ ID NO 16	HPV33 primer2	GCTGTTCTAT TGTCCAAG
SEQ ID NO 17	HPV35 primer1	TGGACAGTGT TGACAGAG
			SEQ ID NO 18	HPV35 primer2	CCCAATCTAT ATCTTGAACA CTTTA
SEQ ID NO 19	HPV39 primer1	GACCTGGCAG ACTTTATTG
			SEQ ID NO 20	HPV39 primer2	CCTGGTATTC CTGCCTAC
SEQ ID NO 21	HPV45 primer1	CGGTGGGATA CATGACTA
			SEQ ID NO 22	HPV45 primer2	CCAACAACCA AGCAAAAG
SEQ ID NO 23	HPV51 primer1	GCCCATTAGG AGACATTA
			SEQ ID NO 24	HPV51 primer2	CGGATAACTG TCCAGTAA
SEQ ID NO 25	HPV52 primer1	GCATCTGGTC ATGTATTG
			SEQ ID NO 26	HPV52 primer2	CCTGGAATAG GTGTACTAC
SEQ ID NO 27	HPV56 primer1	AAGGCAGCTT ATTCTGTG
			SEQ ID NO 28	HPV56 primer2	CTCAGCACGT GTTAGTTC
SEQ ID NO 29	HPV58 primer1	AGCGGTAATA GAACGAAGA
			SEQ ID NO 30	HPV58 primer2	CTGTGTAGTA CTTTGTACTG AATC
SEQ ID NO 31	HPV59 primer1	GCAAGAGTAA GAGAATTAAG A
			SEQ ID NO 32	HPV59 primer2	GTTGGACATA GAGGTTTTAG
SEQ ID NO 33	HPV66 primer1	CGATGTCAAT GTCCGTTA
			SEQ ID NO 34	HPV66 primer2	GCATGGTTAT ACTGTAGATT C

SEQ ID NO 35	HPV68 primer1	CATGGAATAG ATGATAGTGT A
			SEQ ID NO 36	HPV68 primer2	GCAGCATTAC TATTACAATC
SEQ ID NO 37	HPV16 probe	CACTATCGTC TACTATGTCA
			SEQ ID NO 38	HPV16 primer1	ACAGGTATAT CAAATATTAG TGAA
SEQ ID NO 39	HPV16 primer2	CTTGCATTAC TATTAGTGTC TG
			SEQ ID NO 40	HPV18 probe	TCTATGTCAC GAGC
SEQ ID NO 41	HPV18 primer1	AGCCCCAAAA TGAAATTC
			SEQ ID NO 42	HPV18 primer2	CACACTTACA ACACATACA
SEQ ID NO 43	β-globin probe	TGCTTCTGAC ACAACT
			SEQ ID NO 44	β-globin primer1	GAGCCATCTA TTGCTTACA
SEQ ID NO 45	β-globin primer2	CTCACCACCA ACTTCATC

本发明是基于多重荧光PCR技术，通过实时荧光PCR仪，进行同步核酸扩增与检测，而提供一种可以在同一反应管中检测第一组不分型12种高危型HPV(31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)、第二组高危型HPV 16、第三组高危型HPV 18及第四组细胞内β-globin基因的试剂盒；第四组同步检测细胞内保守基因β-globin，用于评估采集样本质量及PCR抑制因素，对检测过程进行质量控制。本发明所有的探针Tm接近相同且高于引物的Tm大约8～10℃，所有引物的Tm接近相同为58～60℃，确保引物在延伸时探针保持与目标序列的结合。

本发明的试剂盒既可以将高危型HPV检测又能将HPV16、HPV18具体分型，同时还可通过β-globin基因对检测过程进行质量控制，满 足了筛查要求且能更好地提供临床指导，这样可以最大限度减轻我国HPV基因检测所带来的巨额费用，从而降低病人的经济负担，达到有效利用资源的目的，同时保护人民的身体健康。

附图说明

以下是附图的说明，便于理解上述发明的目的和具体特征。

图1是第一组12种高危型HPV中的模板在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。

图2是第二组高危型HPV 16模板在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。

图3是第三组高危型HPV 18模板在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。

图4是第四组细胞内β-globin基因模板在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。

图5是含有第一组至第四组的模板在ABI7500上的检测结果的扩增曲线。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细的说明。

本发明人通过分析临床样本的DNA，分别制备具有仅与12种高危型HPV(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：1～12的探针及SEQ ID No：13～36的引物；仅与高危型HPV16的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：37 的探针及SEQ ID No：38～39的引物；仅与高危型HPV18的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：40的探针及SEQ ID No：41～42的引物，仅与细胞内β-globin基因的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：43的探针及SEQ ID No：44～45的引物；第一组探针标记最大发射波长518nm染料、第二组探针标记最大发射波长553nm染料、第三组探针标记最大发射波长607nm染料、第四组探针标记最大发射波长667nm染料。以此来检测12种HPV感染及鉴定HPV16、HPV18，并且同时检测细胞内β-globin基因的DNA用于评估样本质量及PCR抑制因素。

同时准备试验所需的DNA聚合酶、PCR MIX，后者包括除模板以外的所有PCR反应所需试剂，以及用于阳性对照的HPV16、18、31质粒和阴性对照的超纯水。

样品采集及处理：

1.宫颈脱落细胞：由医生以窥阴器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈过多的分泌物擦去。将宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转3至5圈。慢慢取出宫颈刷，将其放入装有细胞保存液的样本管中。在管口处将多余的刷柄折断，将刷头留在样本管中，旋紧管盖，做好样品标识并保持洗脱管直立放置。

2.宫颈分泌物：使用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈口，拭子深入宫颈管1～2cm，捻动拭子，并停留30秒后取出，其放入标有编号的取样管中。

3.男性泌尿生殖道分泌物采集：用细小棉拭子伸入尿道2-5cm， 捻动拭子采集分泌物，将其放入标有编号的取样管中。

样品采用常规提取DNA的方法提取DNA。

样品检测：

将样品提取的DNA 2μl加入PCR反应液并混匀后，再放置于荧光定量PCR仪中反应，采用常规的扩增程序95℃10分钟，热循环95℃15秒，60℃60秒，共45循环。

扩增后曲线分析：

样品的Ct值显示为Undet，判断为阴性。样本的Ct值≤40，判断为阳性；若为40＜Ct值＜45的样品建议重做，重做结果Ct值＜40者为阳性，否则为阴性。

为检测本发明试剂盒诊断HPV感染的准确性和有效性，对931例临床样品与人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒(简称21分型)做对比实验，评价试验系统和对照系统的一致性。定性检测产品的结果多为计数统计资料，可按下表进行统计分析：

配对计数资料统计例表

阳性符合率和阴性符合率的公式为：

阳性符合率＝a/a+c*100％

阴性符合率＝b/b+d*100％

阳性符合率和阴性符合率满足临床要求，认为两个方法或产品等效。

本发明试剂盒与人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒(简称21分型)对HPV16检测结果比较：

指标	本试剂盒
		HPV16阳性符合率	100％

HPV16阴性符合率

100％

本发明试剂盒与人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒(简称21分型)对HPV18检测结果比较：

指标	本试剂盒
		HPV18阳性符合率	100％
HPV18阴性符合率	99.89％

本发明试剂盒与人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒(简称21分型)对除HPV16、HPV18外的12种高危型HPV检测结果比较：

指标	本试剂盒
		12HPV阳性符合率	100％
12HPV阴性符合率	99.53％

本发明试剂盒与人乳头状瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒(简称21分型)对HPV16、HPV18及12种高危型HPV检测结果合并比较：

指标	本试剂盒
		12+2HPV阳性符合率	100％
12+2HPV阴性符合率	99.40％

结合上述实验结果，本发明试剂盒与对比试剂在灵敏度和特异度方面具有很高的一致性，对疾病的诊断起到了快速、准确的效果，完全满足临床应用的要求。

Claims (1)

1.一种12+2高危型人乳头状瘤病毒核酸检测试剂盒，包括：

(1)具有仅与12种高危型HPV的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：1～12的探针及SEQ ID No：13～36的引物；

(2)与高危型HPV16的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：37的探针及SEQ ID No：38～39的引物；

(3)与高危型HPV18的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：40的探针及SEQ ID No：41～42的引物；

(4)与细胞内β-globin基因的DNA互补的核甘酸序列的SEQ ID No：43的探针及SEQ ID No：44～45的引物；

其中，上述每组探针分别标记最大发射波长518nm、538～553nm、574～575、607～615、640、666～667、690染料的其中一种并且不同。

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