CN101177701A

CN101177701A - 人乳头状瘤病毒基因分型检测试剂盒及其基因芯片制备方法

Info

Publication number: CN101177701A
Application number: CNA2007100307236A
Authority: CN
Inventors: 谢龙旭
Original assignee: CHAOZHOU KAIPU BIOCHEMISTRY Co Ltd
Current assignee: CHAOZHOU HYBRIBIO BIOLOGICAL CHEMICAL Co.,Ltd.; HYBRIBIO Ltd.
Priority date: 2007-09-29
Filing date: 2007-09-29
Publication date: 2008-05-14
Anticipated expiration: 2027-09-29
Also published as: CN101177701B

Abstract

本发明公开了一种具有与人乳头状瘤病毒HPV DNA互补的核苷酸序列的探针，和含有该探针的基因分型检测试剂盒及其基因芯片制备方法。该探针选自SEQ ID Nos：1－21和与SEQ ID Nos：1－21互补的序列。该试剂盒包括一个基因芯片，其上带有至少一个上述探针、标记有生物素点的DNA序列、带有编码β－球蛋白部分的DNA序列，各种选自MY09/MY11的引物。该试剂盒的基因芯片通过DNA探针的制备，固定探针，利用氢氧化钠停止反应等步骤制得。本发明的试剂盒能快速、准确地检测出HPV感染及鉴定具体的亚型，更适合中国人，对于子宫颈癌的早期诊断、预防、治疗和手术后的跟踪具有重大的意义。

Description

人乳头状瘤病毒基因分型检测试剂盒及其基因芯片制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有与人乳头状瘤病毒HPV DNA互补的核苷酸序列的探针，和含有该探针的检测HPV具体亚型的基因分型检测试剂盒及其基因芯片制备方法。

背景技术

子宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一。全世界每年约有50万新发子宫颈癌病例，亚洲约38万，中国约15万例，全世界每年约23万妇女死于宫颈癌，亚洲约19万，中国约8万。宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤，特别是人乳头状瘤病毒感染导致当代子宫颈癌及癌前病变发生率日益增高并趋向年轻化，严重威胁着广大妇女的身心健康。所以预防、诊断和治疗宫颈癌对于广大的妇女来说，是一个亟待解决的问题。

从1995年的IARC专题讨论会上通过HPV感染是宫颈癌的主要原因，即HPV感染是宫颈癌发生的先决必要引发条件，到目前为止已鉴定出100多种的HPV基因亚型，约40种与肛门生殖道感染有关。根据在宫颈癌发生中的危险性不同，分为(高危)HR-HPV和(低危)LR-HPV两大类，高危型的HPV与宫颈癌的发生关系比较密切，而且不同HPV亚型的感染其致病性和后果也有差异。基于以上所述，检测出样本中的具体HPV亚型对于子宫颈癌的防治具有重要的指导意义。

早期对宫颈癌的筛查和诊断，主要是采用形态学的检查，包括巴氏图片(Pap smear)和液基细胞学(LCT、TCT)。感染HPV的宫颈上皮细胞可产生形态学的改变。但是无论怎样，这样的方法总会出现一种未确定意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)，常可掩盖一部分有意义的组织病理学异常而出现假阴性结果，需结合分子生物学技术检测HPV感染。

分子生物学包含几种常用的方法。核酸分子杂交，如Southern杂交、原位杂交等，方法比较灵敏，但操作烦琐，不适合临床操作。PCR检测方法操作虽然简单，但是由于其高灵敏性，容易导致非特异性扩增而出现假阳性。商业化杂交捕获(Hybrid CaptureII，HCII)试剂盒不用经过PCR扩增，通过特定的探针直接检测出临床样本中是否存在HPV病毒。但是该方法使用的探针是RNA，可能会影响试剂盒的稳定性。最为关键的是该方法只能检测出样本中是否有HPV病毒的感染，不能鉴定出具体的HPV病毒亚型，不利于临床跟踪检测和治疗。

而且，在市面上销售的基因试剂盒所采用的探针大多缺少中国人群常见亚型(53/66/CP8304)，涵盖的亚型少，并不适合国人的情况，往往容易造成检测的疏漏。因此，研制和开发一种适于中国人、简单、快速和准确的HPV分型检测方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有相近的Tm值、涵盖亚型多、更适合中国人的与人乳头状瘤病毒HPV DNA互补的核苷酸序列的探针。

本发明的主要目的是提供一种能简单、快速和准确检测HPV具体亚型的基因分型检测试剂盒及其基因芯片制备方法。

本发明的一种具有与人乳头状瘤病毒HPV DNA互补的核苷酸序列的探针，其中探针选自SEQ ID Nos：1-21和与SEQ ID Nos：1-21互补的序列，每一种探针的核苷酸排列顺序如下：

HPV6 5′-cataagaagataccttaggacttg-3′ (SEQ ID No.1)

HPV11 5′-acttagcagtaacgtctcagatgt-3′ (SEQ ID No.2)

HPV16 5′-ctatacaagtacgtcgtcgatatg-3′ (SEQ ID No.3)

HPV18 5′-gtatcactaagtactcgtcgaatg-3′ (SEQ ID No.4)

HPV31 5′-gacttcaatagtactagtcatcgg-3′ (SEQ ID No.5)

HPV33 5′-ctgatcatgaactacgtcatggat-3′ (SEQ ID No.6)

HPV35 5′-ctagtgtcatgacacgtatcatag-3′ (SEQ ID No.7)

HPV39 5′-cctaagtgtagacacgtatcagtt-3′ (SEQ ID No.8)

HPV42 5′-gctatcgtcatgaactatgctaga-3′ (SEQ ID No.9)

HPV43 5′-actgtgtcatgacacgtatcaagt-3′ (SEQ ID No.10)

HPV44 5′-tagtgctcgagacacgtatcatat-3′ (SEQ ID No.11)

HPV45 5′-atgtgtcatgacacgtatcatagc-3′ (SEQ ID No.12)

HPV CP8 304 5′-gcactaatagttcagttgcag-3′ (SEQ ID No.13)

HPV53 5′-ttctatcatgacacgtatcactgg-3′ (SEQ ID No.14)

HPV52 5′-cagagctcgagacacgtatcaact-3′ (SEQ ID No.15)

HPV56 5′-aatggtcatgacacgtatcaagga-3′ (SEQ ID No.16)

HPV58 5′-agcaaatgaaacagttgcagga-3′ (SEQ ID No.17)

HPV59 5′-gcctaatgaaacagttgcaccc-3′ (SEQ ID No.18)

HPV61 5′-tctgaatgaaacagttgctaca-3′ (SEQ ID No.19)

HPV66 5′-gcatctatagtatcagttagacg-3′ (SEQ ID No.20)

HPV68 5′-atgtgtcatgagtatcatagc-3′ (SEQ ID No.21)

上述的21种亚型HPV，包括13种高危亚型(16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68)，五种低危亚型(6/11/42/43/44)和3种中国人群常见亚型(53/66/CP8304)。本发明针对每一种HPV亚型设计的探针有着合理的碱基成分，探针的Tm值在44.5℃到47℃之间，相对比较均一，即21种亚型探针和对应的PCR产物杂交时最适宜的温度条件基本一致，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。

本发明的一种人乳头状瘤病毒HPV基因分型检测试剂盒，包括：

(1)一个基因芯片，其上带有：

(i)不同HPV型别的核苷酸探针，其中探针至少是一个选自SEQID Nos：1-21和与SEQ ID Nos：1-21互补的序列；

(ii)标记有生物素点的DNA序列(Bio)，用于监控杂交是否成功，序列为SEQ ID No.22：

Bio 5′-cgtccaaggggaaactgatct-3′ (SEQ ID No.22)；

(iii)带有编码β-球蛋白部分的DNA序列(IC)，作为内控点，用于监控PCR体系是否成功，序列为SEQ ID No.23：

IC 5′-ccagggt tagcatgtcaat tcct-3′ (SEQ ID No.23)；

(4)各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，该引物选自MY09/MY11，其序列分别为SEQ ID No.24、SEQ ID No.25：

MY09 5′-cgtccmarrggawactgatc-3′ (SEQ ID No.24)

MY11 5′-gcmcagggwcataayaatgg-3′ (SEQ ID No.25)

其中m表示a或c，r表示a或g，w表示a或t，y表示c或t。

选用MY引物对在于该类引物对HPV的检测比较敏感，特别是对多亚型感染的检测，增加了HPV检测的准确性。

本发明上述的试剂盒，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。

本发明上述的试剂盒，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。

本发明上述的试剂盒，所述引物的5′端标记有生物素。

本发明所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)DNA探针的制备：合成与HPV DNA互补的5′末端经过胺基化的DNA片段

从HPV DNA的L1区中挑选出特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计并合成出5′末端经过胺基化的DNA片段；

(2)固定探针：将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上

先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针点到膜上，通过探针末端的胺基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固地将探针固定在膜上；

(3)制备基因芯片：利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。

利用本发明所述的HPV基因分型检测试剂盒检测HPV感染的方法包括以下步骤：利用HPV基因分型检测试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA；对扩增后的DNA进行杂交；检测基因芯片表面上结合的DNA。

具体步骤如下：

第一步：扩增样品

将临床样本中提取的DNA通过HPV基因分型检测试剂盒进行扩增，所用引物的5′端标记有生物素，扩增得到5′端带有生物素标记的DNA产物；

第二步：杂交

使用导流杂交技术，将上述扩增得到的DNA与基因芯片上面分布的DNA探针、Bio和IC进行反应；

第三步：显色

在碱性磷酸酶AP酶的作用下，利用NBT/BCIT系统显色，肉眼直接观察结果。

在基因检测中，由于操作步骤繁琐，操作失误难以避免，本发明在试剂盒中使用了标记有生物素点的DNA序列和带有编码β-球蛋白部分的DNA序列，分别用于监控杂交和PCR体系是否成功，便于操作人员在检测过程出错时，快速区分是在PCR时出错还是在杂交时出错，以便迅速找出发生错误的原因，缩短检测时间。另外，在现有技术中，由于探针载体多采用玻璃等，通透性差，一般只能使用传统杂交方法进行杂交，操作起来较为麻烦，检测时间长，一般至少都在6个小时以上，而且显色结果的背景不干净；本发明使用尼龙膜做为探针载体，由于尼龙膜较其它固体支持物(如玻璃等)具有良好的通透性，不但利于导流杂交技术的应用，且具有很好的弹性，便于生产和操作，缩短了检测时间，只需要3.5小时左右，显色结果的背景干净。

本发明所述HPV基因分型检测试剂盒能够快速、准确检测出HPV感染及鉴定具体的亚型，对于子宫颈癌的早期诊断，预防、治疗和手术后的跟踪具有重大的意义。

附图说明

以下是附图的说明，便于理解上述发明的目的和具体特征。

图1是表示基因芯片上探针和监控点的类型和具体的分布位置的图片，数字代表不同的HPV亚型，“Bio”代表标记有生物素点的DNA序列，“IC”代表带有编码β-球蛋白部分的DNA序列，“+”代表位置标记。

图2a是表示HPV6DNA分析结果的图片。

图2b是表示HPV11DNA分析结果的图片。

图2c是表示HPV42DNA分析结果的图片。

图2d是表示HPV43DNA分析结果的图片。

图2e是表示HPV44DNA分析结果的图片。

图3a是表示HPV16DNA分析结果的图片。

图3b是表示HPV18DNA分析结果的图片。

图3c是表示HPV31DNA分析结果的图片。

图3d是表示HPV33DNA分析结果的图片。

图3e是表示HPV35DNA分析结果的图片。

图3f是表示HPV39DNA分析结果的图片。

图3g是表示HPV45DNA分析结果的图片。

图3h是表示HPV51DNA分析结果的图片。

图3i是表示HPV52DNA分析结果的图片。

图3j是表示HPV56DNA分析结果的图片。

图3k是表示HPV58DNA分析结果的图片。

图3l是表示HPV59DNA分析结果的图片。

图3m是表示HPV68DNA分析结果的图片。

图4a是表示HPV53DNA分析结果的图片。

图4b是表示HPV66DNA分析结果的图片。

图4c是表示HPVCP8304DNA分析结果的图片。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细的说明。

实施例中，20％的EDAC溶液、0.1％SDS、0.25％脱脂奶粉、0.05％硫柳汞、0.05％叠氮钠均是指质量比，0.1％Tween 20是指体积比。

实施例1 基因芯片的制备

根据世界范围内的HPV感染研究结果和国内的实际HPV感染情况，选择出21种亚型HPV，包括13种高危亚型(16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68)，五种低危亚型(6/11/42/43/44)和3种中国人群常见亚型(53/66/CP8304)。针对每一种HPV亚型，设计和合成5′端带有胺基的特异性基因探针，并制备IC和Bio，用于HPV的检测。

DNA基因芯片的制作步骤如下：将制备的探针、IC和Bio首先溶解在超纯水中，制成浓度为200uM的母液，然后溶解在pH＝8.4的0.5MNa₂CO₃和0.5M NaHCO₃的溶液中，使其最终浓度为2uM。

对尼龙膜进行处理，首先放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放进20％的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200ml的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20℃、湿度为45％的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，装入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4℃的温度下，备用。

通过微量移液设备将上述制备好的探针、IC和Bio分别点在上述处理过的尼龙膜上，每滴0.4ul。点膜完成后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45％的烘干箱内放置12小时，即制得基因芯片。

实施例2 样品制备

实施例2-1阳性对照组样品的制备

利用MY09/MY11引物对插入到pMD-T vector中的HPV18片段进行扩增。PCR反应体系为25ul，包含10x buffer，2.5ul；25mM MgCl₂，6.0ul；10mM d(A/C/G)TP，0.5ul；100uM生物素标记引物MY09，0.25ul；100uM生物素标记引物MY11，0.25ul；内对照DNA，1.0ul；ddH₂O，12.4ul；100mM dUTP，0.1ul；UNGase(1U/ul)，0.25ul；TaqDNA聚合酶，0.25ul；膜板DNA，1.0ul；共25ul。PCR反应程序为：首先95℃变性9分钟，然后95℃，20秒；55℃，30秒；72℃，30秒；进行40个循环，最后72℃延伸5分钟。

实施例2-2 HPV标准品的制备

同实施例2-1相似步骤制备生物素结合的扩增HPV DNA样品，不同之处在于利用上述各种质粒作为模板。

实施例2-3临床样本中DNA样品的制备

采用煮沸和异丙醇沉淀法制备和纯化临床样本中的DNA，然后参照实施例2-1中的方法扩增得到带有生物素标记的DNA。

实施例3利用DNA基因芯片检测HPV DNA

利用导流杂交技术，将实施例2中扩增得到的DNA样品用实施例1中制备的基因芯片进行检测，DNA样品和基因芯片中尼龙膜上的探针、Bio和I C反应，最后根据显色情况进行判断，有显色的探针点表示相应的HPV亚型，IC点显色表示扩增成功，Bio点显色表示杂交成功。进行临床样本检测的同时，做阳性HPV18阳性对照和阴性对照。

将扩增获得的25ul产物95℃下变性5分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟。然后加入到事先温浴到45℃的0.5ml杂交液中(2xSSC/0.1％SDS)，混匀后加入到杂交仪的反应孔中，应用于实施例1制得的基因芯片，45℃杂交10分钟。然后用溶液B(2xSSC/0.1％SDS，45℃温浴)清洗3遍。加入0.5ml封阻液(0.25％脱脂奶粉，0.05％硫柳汞)，25℃封闭5分钟。抽干后加入0.5ml的酶标液(TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶)，酶标5分钟。用0.8ml溶液A(TBS，0.1％Tween 20及0.05％叠氮钠)清洗4遍，然后加入0.5ml的显色液(NBT/BCIP)，避光显色5分钟。最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。

序列表

<110>潮州凯普生物化学有限公司

<120>人乳头状瘤病毒基因分型检测试剂盒及其基因芯片制备方法

<160>25

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV6

<400>1

cataagaaga taccttagga cttg 24

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV11

<400>2

acttagcagt aacgtctcag atgt 24

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV16

<400>3

ctatacaagt acgtcgtcga tatg 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV18

<400>4

gtatcactaa gtactcgtcg aatg 24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV31

<400>5

gacttcaata gtactagtca tcgg 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV33

<400>6

ctgatcatga actacgtcat ggat 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV35

<400>7

ctagtgtcat gacacgtatc atag 24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV39

<400>8

cctaagtgta gacacgtatc agtt 24

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV42

<400>9

gctatcgtcat gaactatgc taga 24

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV43

<400>10

actgtgtcat gacacgtatc aagt 24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV44

<400>11

tagtgctcga gacacgtatc atat 24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV45

<400>12

atgtgtcatg acacgtatca tagc 24

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPVcp8304

<400>13

gcactaatag ttcagttgca g 21

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV53

<400>14

ttctatcatg acacgtatca ctgg 24

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV52

<400>15

cagagctcga gacacgtatc aact 24

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV56

<400>16

aatggtcatg acacgtatca agga 24

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV58

<400>17

agcaaatgaa acagttgcag ga 22

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV59

<400>18

gcctaatgaa acagttgcac cc 22

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV61

<400>19

tctgaatgaa acagttgcta ca 22

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV66

<400>20

gcatctatag tatcagttag acg 23

<210>21

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HPV68

<400>21

atgtgtcatg agtatcatag c 21

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Bio

<400>22

cgtccaaggg gaaactgatc t 21

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IC

<400>23

ccagggttag catgtcaatt cct 23

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物MY09

<400>24

cgtccmarrg gawactgatc 20

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物MY11

<400>25

gcmcagggwc ataayaatgg 20

Claims

1.一种具有与人乳头状瘤病毒HPV DNA互补的核苷酸序列的探针，其中探针选自SEQ ID Nos：1-21和与SEQ ID Nos：1-21互补的序列。

2.一种人乳头状瘤病毒HPV基因分型检测试剂盒，包括：

(1)一个基因芯片，其上带有：

(i)不同HPV型别的核苷酸探针，其中探针至少是一个选自SEQ ID Nos：1-21和与SEQ ID Nos：1-21互补的序列；

(ii)标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQ ID No.22；

(iii)带有编码β-球蛋白部分的DNA序列，作为内控点，序列为SEQ ID No.23；

(2)各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，该引物选自MY09/My11，其序列分别为SEQ ID No.24、SEQ ID No.25。

3.权利要求2所述人乳头状瘤病毒HPV基因分型检测试剂盒，其特征是所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。

4.权利要求2所述人乳头状瘤病毒HPV基因分型检测试剂盒，其特征是所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。

5.权利要求2所述人乳头状瘤病毒HPV基因分型检测试剂盒，其特征是所述引物的5′端标记有生物素。

6.权利要求2所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)DNA探针的制备：合成与HPV DNA互补的5′末端经过胺基化的DNA片段；

(2)固定探针：将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上；

(3)制备基因芯片：利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。