CN102864232B

CN102864232B - 耳聋易感基因联合检测试剂盒

Info

Publication number: CN102864232B
Application number: CN201210364293.2A
Authority: CN
Inventors: 朱娟娟; 谢龙旭; 李烈军
Original assignee: CHAOZHOU HYBRIBIO BIOLOGICAL CHEMICAL CO LTD
Current assignee: CHAOZHOU KAIPU BIOCHEMISTRY Co Ltd; GUANGDONG HYBRIBIO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd; Guangzhou Kaipu Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2032-09-26
Also published as: CN102864232A

Abstract

本发明公开了一种耳聋易感基因联合检测试剂盒，包括：（1）一个基因芯片，其上带有:（i）核苷酸序列探针，至少是一个选自SEQIDNos：1-26和与SEQIDNos：1-26互补的序列;(ii)标记有生物素点的DNA序列，序列为SEQIDNo.27;（2）各种引物，分别选自SEDIDNo.28-29、SEDIDNo.30-31、SEDIDNo.32-37、SEDIDNo.38-43。本发明所述试剂盒，可实现同步联合检测、提高检测特异性、降低成本、缩短检测时间。

Description

耳聋易感基因联合检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因领域，具体是一种耳聋易感基因联合检测试剂盒。

背景技术

耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见先天性疾病，它可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可由环境因素（如医疗因素，环境暴露，创伤，药物等）或基因和环境两者共同作用而致。在世界范围内，每1000名新生儿中就有1名先天性耳聋患儿，50% 患儿的耳聋与遗传因素有关。据中国残疾人联合会网站统计，中国6000万残疾人口中2100万为听力残疾者。听力言语残疾者中7岁以下的聋儿达80万人并以每年新增3万聋儿的速度在增长。研究表明，大量的迟发性听力下降患者中，亦有许多患者也是由自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多态性造成对致聋环境因素易感性增加而致病。最近的研究表明在中国相当一部分遗传性耳聋仅由为数不多的基因突变引起，GJB2（间隙连接蛋白，gap junction protein,beta 2）、GJB3（间隙连接蛋白，gap junction protein,beta 3）、SLC26A4(Solute carrier family 26,member 4) 和mtDNA（线粒体DNA, mitochondrial DNA）是我国遗传性耳聋患者所涉及的主要基因。

从临床的流行病学统计来看，除少数人群外， GJB2是最常见的耳聋疾病相关基因，约50%的遗传性学语前性NsHL与GJB2有关。GJB2基因突变所致的耳聋临床表型亦较复杂，从遗传方式上看，既可以常染色体隐性遗传，也可以常染色体显性遗传；从听力损失的严重程度看，临床表现为轻度直至深度耳聋都可能与GJB2基因突变相关。GJB2基因是第一个被定位和证实的遗传性耳聋致病基因，其中35delG、176del、235delC、299delAT，被认为是该基因上较常见的突变位点。

GJB3 基因在中国被克隆，它定位于人类染色体1p33 - p35，编码有270个氨基酸的连接蛋白31（connexin31）。GJB3 和 GJB2 一样，都能导致常染色体显性和隐性非综合征性耳聋。

SLC26A4基因由21个外显子组成，编码一种穿膜蛋白pendrin，后者主要在甲状腺、内耳和肾脏表达。在中国，由前庭导水管扩大或前庭导水管扩大伴Mondini畸形导致的听力障碍中最常见的SLC26A4基因突变是IVS7-2A>G，其次可见A2168G，C1229T等，这些基因的检测是耳聋的重要基因筛查项目。

除核基因外，线粒体基因突变也可导致综合征型或非综合征型耳聋。由于线粒体位于细胞质内，其突变所致疾病的传递方式呈母系遗传。线粒体DNA突变是造成母系遗传性耳聋最重要的分子遗传基础，其中，小核糖亚体RNA上两个突变位点A1555G与C1494T是被我国学者认为与氨基糖普类药物性非综合征型耳聋最相关的突变类型。

由于导致语前聋的环境因素的存在，有时无法判断患者是否为遗传性聋，同时耳蜗结构复杂，耳聋听力表现难以区分，常规的电生理检测或生化检测均不能从病因学上给出满意的解释。这一切，都决定了遗传性耳聋基因检测是目前最为有效的病因学分析方法之一。通过基因检测可以做到早发现，这对于语前聋患者尤为重要，可以尽早利用残余听力佩戴助听器或植入电子耳蜗，防止患儿变哑，对于语后聋患者，可以部分预测以后发病的风险和发病的年龄阶段，从而尽早预防，并对患者的婚配、生育提供遗传信息。基因检测比传统检查拥有更高的准确性、更远的前瞻性，它首次使人们面对耳聋从只能患病后被动治疗，而转为可以提前主动的预防和干预。

遗传性耳聋有很高的遗传异质性，与耳聋相关的基因至少有100个，这给临床检测带来了很大的困难。目前，传统基因诊断方法包括酶切，限制性片段长度多态性分析（restriction fragment lengt hpolymorphism，RFLP），变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC），直接测序等。这些传统方法或者不能定性，或者耗时费力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是这些方法难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测。因此有必要建立一种高通量、高效率的基因突变检测方法，以实现临床快速检测或大规模人群筛查。

伴随基因组计划出现和发展的基因芯片技术，具有的高效平行检测特点，与耳聋基因高遗传异质性的特点相契合，是一种极具潜力的耳聋基因检测工具。 Siemering等发表文章指出，应用等位基因特异性寡核苷酸芯片（ASO）对遗传性耳聋基因进行检测，检测结果准确可靠，但应用该方法完成整个检测需要2d时间；Gardner等和Cremers等相继报道了芯片微测序方法进行耳聋突变位点检测的进展，采用该方法完成检测需要6d，但由于需要四色荧光芯片扫描仪进行检测，如多重等位基因特异性PCR通用芯片技术（allele-specific PCR-based universal array，ASPUA），该芯片可在5h之内完成导致遗传性耳聋的4种常见基因（GJB2，GJB3，SLC26A4和线粒体12S rRNA基因）共13个位点的检测。但是由于基因芯片技术制作流程复杂，要求的精密度高，普通实验室难以满足，配套分析软件不统一等，而且由于刚刚步入产业化，价格偏贵，这些缺点使该技术的应用受到一定的限制，无法达到临床快速检测的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种能简单、快速和准确地联合检测mtDNA、GJB2、GJB3和SLC26A4基因的耳聋易感基因联合检测试剂盒。

本发明的一种耳聋易感基因联合检测试剂盒，包括：

（1）一个基因芯片，其上带有:

（i）四种常见耳聋易感基因（mtDNA、GJB2、GJB3和SLC26A4）的13个突变位点及其正常对照互补的核苷酸序列探针（共26条探针），其中探针至少是一个选自SEQ ID Nos：1-26和与SEQ ID Nos：1-26互补的序列，探针序列如下：

名称序列序列号

1494 PN CGTCACCCTCCTCAAG SEQ ID NO.1

1555 PN AGAGGAGACAAGTCGTAAC SEQ ID NO.2

7445 PN ACATAAAATCTAGACAAAAAAGGA SEQ ID NO.3

12201 PN GACCCCTTATTTACCGAGAA SEQ ID NO.4

G2-35 PN GTTCACACCCCCCAGGA SEQ ID NO.5

G2-155 PN GGTGTTGCAGACAAAGTCG SEQ ID NO.6

G2-176 PN GCACACGTTCTTGCAGCC SEQ ID NO.7

G2-235 PN AGCTGCAGGGCCCATA SEQ ID NO.8

G2-299 PN TTCTTCTCATGTCTCCGGT SEQ ID NO.9

G3-538 PN ACATTGCCCGACCTAC SEQ ID NO.10

IVS7-2 PN GTTTTATTTCAGACGATAATTGC SEQ ID NO.11

1229 PN CTGCTCTTTCCCGCACGG SEQ ID NO.12

2168 PN CGGTCCATGATGCTATA SEQ ID NO.13

1494 PM CCGTCACTCTCCTCAAG SEQ ID NO.14

1555 PM GAGGAGGCAAGTCGTAA SEQ ID NO.15

7445 PM CATAAAATCTAGGCAAAAAAGG SEQ ID NO.16

12201 PM CCCCTTACTTACCGAGA SEQ ID NO.17

G2-35 PM ATCCTGGGGGTGTGAAC SEQ ID NO.18

G2-155 PM CGACTTTGCAACACCC SEQ ID NO.19

G2-176 PM CAGCCAGCTACGATCAC SEQ ID NO.20

G2-235 PM TATGGGCCTGCAGCT SEQ ID NO.21

G2-299 PM ACCGGAGACGAGAAGAA SEQ ID NO.22

G3-538 PM ACATTGCCTGACCTACC SEQ ID NO.23

IVS7-2 PM TGTTTTATTTCGGACGATAAT SEQ ID NO.24

1229 PM CTCTTTCCCGCATGGCC SEQ ID NO.25

2168 PM GTCCGTGATGCTATACT SEQ ID NO.26

(ii) 标记有生物素点的DNA序列（Bio），用于监控杂交是否成功，序列为SEQ ID No.27：

Bio CGTAGAAGGGGAAACTGATC SEQ ID No.27;

（2）各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，其中GJB2基因特异性扩增引物的DNA序列选自SED ID No.28-29，GJB3基因特异性扩增引物的DNA序列选自SED ID No.30-31，SLC26A4基因特异性扩增引物的DNA序列选自SED ID No.32-37，mtDNA基因特异性扩增引物的DNA序列选自SED ID No.38-43,具体序列如下：

名称序列序列号

GJB2-F TAGTGATTCCTGTGTTGTGTG SEQ ID NO.28

GJB2-R TTCTGGGTTTTGATCTCCTC SEQ ID NO.29

GJB3-F CTCTTCCTCTACCTGCTGC SEQ ID NO.30

GJB3-R TATTGCCTGGGTCTGGAT SEQ ID NO.31

SLC26A4-F1 TTCACTGCTGGATTGCTCA SEQ ID NO.32

SLC26A4-R1 GTGTTAACCGTACATGTTCTGC SEQ ID NO.33

SLC26A4-F2 CTCTCAGATGGTATGGCGTC SEQ ID NO.34

SLC26A4-R2 TCCTTCATTACTGATTCCTTGTC SEQ ID NO.35

SLC26A4-F3 GTTCTTTGACGACAACATTAG SEQ ID NO.36

SLC26A4-R3 AATGGAACCTTGACCCTCTT SEQ ID NO.37

mtDNA-F1 ATGAGGTGGCAAGAAATG SEQ ID NO.38

mtDNA-R1 TTGGCTAAGGTTGTCTGGTA SEQ ID NO.39

mtDNA-F2 GATGCATACACCACATGAAAC SEQ ID NO.40

mtDNA-R2 TGAGTGTTAGGAAAAGGGCA SEQ ID NO.41

mtDNA-F3 CACAATGGGGCTCACTCA SEQ ID NO.42

mtDNA-R3 ACGAACAATGCTACAGGGAT SEQ ID NO.43

本发明的26种探针包括mtDNA基因常见的4个位点突变（1494 C>T、1555 A>G、7445 A>G、12201 T>C）及突变的正常对照点（1494 N、1555 N、7445 N、12201 N）；GJB2基因常见的5个突变位点（35(-G)、155(-TCTG)、176（del 16bp）、235（-C）、299(-AT)及其正常对照（35 N、155 N、176 N、235 N、299 N）；GJB3基因常见的1个突变位点（538 C>T）及其正常对照（538 N）；SLC26A4基因常见的3个突变位点（IVS7-2 A>G、1229 C>T、2168 A>G）及其正常对照（IVS7-2 N、1229 N、2168 N）。本发明针对各种突变及其正常对照的探针的长度一般在14-25个碱基左右，探针5′或3′端进行胺基化处理。本发明设计的探针有着合理的碱基成分、Tm值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。

本发明上述的试剂盒，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。

本发明上述的试剂盒，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。

本发明上述的试剂盒，所述引物的5′端标记有生物素。

本发明所述基因芯片的制备方法，包括如下步骤：

（1）DNA探针的制备：合成与四种常见耳聋易感基因（mtDNA、GJB2、GJB3和SLC26A4）突变互补的5′或3′末端经过胺基化的DNA片段

从mtDNA、GJB2、GJB3和SLC26A4基因突变区中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计并合成5′或3′末端经过胺基化的DNA片段；

（2）固定探针：将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上

先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针点到膜上，通过探针末端的胺基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固地将探针固定在膜上；

（3）制备基因芯片：利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。

利用本发明所述的耳聋易感基因联合检测试剂盒检测耳聋易感基因的方法包括以下步骤：利用耳聋易感基因联合检测试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA；对扩增后的DNA进行杂交；检测基因芯片表面上结合的DNA。

具体步骤如下：

第一步：扩增样品

将待检样品中提取的DNA通过本发明特异性引物进行PCR扩增，所用引物5′端标记生物素，扩增得到5′端带有生物素标记的DNA产物；

第二步：杂交

使用核酸导流杂交技术平台或者任何形式的核酸水平上的杂交技术，将上述扩增得到的DNA与基因芯片上面分布的核苷酸探针进行反应；

第三步：显色

在碱性磷酸酶AP酶的作用下，利于NBT/BCIP系统显色，肉眼直接观察结果或者利用相应的仪器读取信号并进行分析。

本发明所述耳聋易感基因联合检测试剂盒，提供采用导流杂交技术并结合低密度芯片技术联合检测四种常见耳聋易感基因（mtDNA、GJB2、GJB3和SLC26A4）13个突变位点的检测平台，可实现同步联合检测、提高检测特异性、降低成本、缩短检测时间，对开展耳聋人群筛查，遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。

附图说明

以下是附图的说明，便于理解上述发明的目的和具体特征。

图1为本发明的基因芯片上探针的具体分布位置的图片，每个位置代表不同的基因突变。

图2－1为mtDNA-1494M突变纯合子的检测结果图片。

图2－2为mtDNA-1555M突变纯合子的检测结果图片。

图2－3为mtDNA-7445M突变纯合子的检测结果图片。

图2－4为mtDNA-12201M突变纯合子的检测结果图片。

图2－5为GJB2的35位缺失纯合突变型的检测结果图片。

图2－6为GJB2的155位缺失纯合突变型的检测结果图片。

图2－7为GJB2的176位缺失纯合突变型的检测结果图片。

图2－8为GJB2的235位缺失纯合突变型的检测结果图片。

图2－9为GJB2的299位缺失纯合突变型的检测结果图片。

图2－10为GJB3-538M突变纯合子的检测结果图片。

图2－11为SLC26A4-IVS7-2M突变纯合子的检测结果图片。

图2－12为SLC26A4-2168M突变纯合子的检测结果图片。

图2－13为SLC26A4-1229M突变纯合子的检测结果图片。

图2－14为mtDNA-1494M/N突变杂合子的检测结果图片。

图2－15为mtDNA-1555M/N突变杂合子的检测结果图片。

图2－16为mtDNA-7445M/N突变杂合子的检测结果图片。

图2－17为mtDNA-12201M/N突变杂合子的检测结果图片。

图2－18为GJB2的35与155位复合缺失纯合突变型的检测结果图片。

图2－19为mtDNA-1494M与SLC26A4-1229M复合突变型纯合子的检测结果图片。

图2－20为mtDNA-1494M/N突变杂合子与GJB3-538M突变纯合子复合突变型的检测结果图片。

图2－21为GJB2的176与235缺失纯合突变型与SLC26A4-2168M/N突变杂合子复合突变型的检测结果图片。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细的说明。

实施例中，20%的EDAC溶液、0.1%SDS、0.25%脱脂奶粉、0.05%硫柳汞、0.05%叠氮钠均是指质量比，0.1%Tween20是指体积比。

步骤1 用于检测耳聋易感基因芯片的制备

针对mtDNA基因常见的4个突变位点（1494 C>T、1555 A>G、7445 A>G、12201 T>C）；GJB2基因常见的5个突变位点（35(-G)、155(-TCTG)、176（del 16bp）、235（-C）、299(-AT)；GJB3基因常见的1突变位点（538 C>T）；SLC26A4基因常见的3个突变位点（IVS7-2 A>G、1229 C>T、2168 A>G）,共设计了26条探针，探针序列为SEQ ID Nos：1-26，探针的长度一般在14-25个碱基左右，探针5′或3′端进行胺基化处理。

DNA基因芯片的制作步骤如下：将制备的探针、Bio首先溶解在超纯水中，制成浓度为200uM的母液，然后溶解在pH=8.4的0.5M Na₂CO₃和0.5M NaHCO₃的溶液中，使其最终浓度为5 μM。

对尼龙膜进行处理，首先放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放进20%的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200ml的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，装入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4℃的温度下，备用。

通过微量移液设备将上述制备好的探针、Bio分别点在上述处理过的尼龙膜上，每滴0.4 ul。点膜完成后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内放置12小时，即制得基因芯片。

步骤2 用于扩增待检样品中DNA的特异性引物的设计及检测

步骤2-1 用于待检样品中DNA的特异性PCR引物的设计及PCR扩增

根据耳聋易感基因突变的序列资料设计了8对引物用于检测。分两个PCR反应体系进行扩增，每30μL反应体系包括了27.5μl PCR MIX 、0.5μl 耳聋易感基因DNA酶聚合酶、2μl处理好的样品DNA。反应条件为：95°C 10min，95°C变性30 s、57°C退火30s、72°C延伸30s，共40个循环，最后一步72°C延伸7min。

步骤2-2 利用DNA芯片进行检测

将步骤2-1中获得的待检测DNA样品在步骤1中制备的基因芯片进行检测，DNA样品和基因芯片中尼龙膜上的探针反应，最后根据显色情况进行判断。

将获得的耳聋易感基因的两管扩增产物在95°C下变性5分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟。然后加入到预先温浴到45°C的0.8 mL杂交液（2×SSC/0.1%SDS）中，混合后加入杂交仪的反应孔中，应用于步骤1制得的基因芯片，45°C杂交20分钟，然后用溶液WB1（0.5×SSC/0.1%SDS，42°C温浴）清洗3遍。加入0.5mL封阻液（0.25%脱脂奶粉，0.05%硫柳汞），25°C封闭5分钟。抽干后加入0.5mL的酶标液（TBS中溶解的带有链霉亲和素标记的AP酶），酶标5分钟。用0.8mL溶液A（TBS，0.1% Tween20及0.05%叠氮钠）清洗4遍，然后加入0.5mL的显色液（NBT/BCIP），避光显色5分钟。最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。

序列表

<110> 潮州凯普生物化学有限公司

<120> 耳聋易感基因联合检测试剂盒

<160> 43

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1494 PN

<400> 1

cgtcaccctc ctcaag 16

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1555 PN

<400> 2

agaggagaca agtcgtaac 19

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 7445 PN

<400> 3

acataaaatc tagacaaaaa agga 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 12201 PN

<400> 4

gaccccttat ttaccgagaa 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G2-35 PN

<400> 5

gttcacaccc cccagga 17

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G2-155 PN

<400> 6

ggtgttgcag acaaagtcg 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G2-176 PN

<400> 7

gcacacgttc ttgcagcc 18

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G2-235 PN

<400> 8

agctgcaggg cccata 16

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G2-299 PN

<400> 9

ttcttctcat gtctccggt 19

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G3-538 PN

<400> 10

acattgcccg acctac 16

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IVS7-2 PN

<400> 11

gttttatttc agacgataat tgc 23

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1229 PN

<400> 12

ctgctctttc ccgcacgg 18

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2168 PN

<400> 13

cggtccatga tgctata 17

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1494 PM

<400> 14

ccgtcactct cctcaag 17

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1555 PM

<400> 15

gaggaggcaa gtcgtaa 17

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 7445 PM

<400> 16

cataaaatct aggcaaaaaa gg 22

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 12201 PM

<400> 17

ccccttactt accgaga 17

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G2-35 PM

<400> 18

atcctggggg tgtgaac 17

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G2-155 PM

<400> 19

cgactttgca acaccc 16

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G2-176 PM

<400> 20

cagccagcta cgatcac 17

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G2-235 PM

<400> 21

tatgggcctg cagct 15

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G2-299 PM

<400> 22

accggagacg agaagaa 17

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G3-538 PM

<400> 23

acattgcctg acctacc 17

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IVS7-2 PM

<400> 24

tgttttattt cggacgataa t 21

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1229 PM

<400> 25

ctctttcccg catggcc 17

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2168 PM

<400> 26

gtccgtgatg ctatact 17

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bio

<400> 27

cgtagaaggg gaaactgatc 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GJB2-F

<400> 28

tagtgattcc tgtgttgtgt g 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GJB2-R

<400> 29

ttctgggttt tgatctcctc 20

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GJB3-F

<400> 30

ctcttcctct acctgctgc 19

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GJB3-R

<400> 31

tattgcctgg gtctggat 18

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SLC26A4-F1

<400> 32

ttcactgctg gattgctca 19

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SLC26A4-R1

<400> 33

gtgttaaccg tacatgttct gc 22

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SLC26A4-F2

<400> 34

ctctcagatg gtatggcgtc 20

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SLC26A4-R2

<400> 35

tccttcatta ctgattcctt gtc 23

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SLC26A4-F3

<400> 36

gttctttgac gacaacatta g 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SLC26A4-R3

<400> 37

aatggaacct tgaccctctt 20

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mtDNA-F1

<400> 38

atgaggtggc aagaaatg 18

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mtDNA-R1

<400> 39

ttggctaagg ttgtctggta 20

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mtDNA-F2

<400> 40

gatgcataca ccacatgaaa c 21

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mtDNA-R2

<400> 41

tgagtgttag gaaaagggca 20

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mtDNA-F3

<400> 42

cacaatgggg ctcactca 18

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mtDNA-R3

<400> 43

acgaacaatg ctacagggat 20

Claims

1.一种耳聋易感基因联合检测试剂盒，包括：

（1）一个基因芯片，其上带有:

（i）四种常见耳聋易感基因的13个突变位点及其正常对照互补的核苷酸序列探针，其中探针为SEQ ID Nos：1-26和与SEQ ID Nos：1-26互补的序列;

(ii) 标记有生物素点的DNA序列，用于监控杂交是否成功，序列为SEQ ID No.27;

（2）各种引物，用于扩增临床样本中的DNA序列，其中GJB2基因特异性扩增引物的DNA序列为SED ID No.28-29，GJB3基因特异性扩增引物的DNA序列为SED ID No.30-31，SLC26A4基因特异性扩增引物的DNA序列为SED ID No.32-37，mtDNA基因特异性扩增引物的DNA序列为SED ID No.38-43。

2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。

3. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述基因芯片的探针是固定在尼龙膜上。

4. 权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述引物的5′端标记有生物素。