CN104694644A - 一种先天性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

一种先天性耳聋基因多通道荧光pcr检测试剂盒 Download PDF

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CN104694644A CN201510090246.7A CN201510090246A CN104694644A CN 104694644 A CN104694644 A CN 104694644A CN 201510090246 A CN201510090246 A CN 201510090246A CN 104694644 A CN104694644 A CN 104694644A
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Abstract

本发明公开了一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，以GJB2基因的35delG、155delTCTG、176del16bp、235delC、299-300delAT、512insAACG突变，和GJB3基因的538C>T、547G＞A突变为检测对象，设计特异性引物和探针；所述探针为特异性检测GJB2基因的35、155、176、235、299位点，和GJB3基因的538、547位点是否含有突变。本发明首次实现了应用多通道荧光PCR方法在同一个反应管中同时检测先天性耳聋的八个突变位点，操作简便快速、准确、高通量、成本低，闭管操作避免交叉污染，使得耳聋筛查目的性强、筛查范围广。

Description

一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，属于基因检测技术领域。
背景技术
耳聋是临床常见的遗传性疾病之一，严重影响人类的生活质量。2006年中国第二次残疾人抽样调查显示：全国残疾总数高达8000多万，现有听力语言残疾者达2780万人，占残疾总数的35％左右，其中单纯听力残疾2004万。听力言语残疾者中7岁以下的聋儿达80万人并以每年新增5万聋儿的速度在增长。由此可见，我国听力损失人群的现状尤为严重。
根据听觉系统所受影响的性质、原因和病变部位可将耳聋分为三类：传导性耳聋(外耳病变)、感音神经性耳聋(内耳病变)、混合性耳聋。而感音神经性耳聋又分为遗传性耳聋(遗传性耳聋包括先天性耳聋、药物性耳聋、迟发性耳聋)、非遗传性耳聋。其中先天性耳聋占遗传性耳聋的60％，主要表现为出生后就对声音没有反应，如果不配戴助听器和接受语言训练，不但无法进行正常的交流，而且还阻碍了聋儿正常的智力发育，成为家庭和社会沉重的负担。多方研究资料证实引起先天性耳聋的基因位点有100多个，主要是GJB2和GJB3基因突变，GJB2基因常见的突变为：235delC、299-300delAT、176del16bp、35delG、512insAACG、155delTCTG；GJB3基因常见的突变为538C>T、547G＞A，以上位点的突变比例占先天性耳聋突变位点的90％以上。
GJB2基因和GJB3基因主要编码间隙连接蛋白26和31，间隙连接蛋白(connexin)，是整合膜蛋白，6分子蛋白形成一个连接子，中间有2-3mm亲水性孔道，允许钾离子、钙离子和小的信号分子通过。在声音传导的过程中，进入毛细胞的钾离子会通过间隙链接重新回到耳蜗血管纹；如果间隙连接蛋白突变，离子交换受到影响，毛细胞的离子梯度失衡，从而引起听力损失。这两种基因突变导致的耳聋为语前、双侧、对称性耳聋，听力损失程度变异较大，可由轻度到极重度，但多数为重度或极重度耳聋，干预措施有配戴助听器和电子耳蜗移植，进行早期听力恢复。
由上述可知，GJB2/GJB3突变患者，主要病变在耳蜗，而听神经是正常的，所以对于此类患者，植入人工耳蜗是目前临床上最为理想的治疗方式。通过对GJB2、GJB3基因常见突变位点检测，一方面可尽早发现尽早治疗，利用聋儿的残余听力，植入人工耳蜗，在人类语言发育的关键时期，进行特殊的语言训练，避免聋哑残疾，对先天性耳聋患者的康复有重大意义，另一方面可以对已生育耳聋患儿的夫妇再次生育时进行产前基因诊断，对育龄夫妇进行携带者的筛查，发现高危人群，从而进行相应的遗传咨询和指导，从根本上降低出生缺陷，提高人口素质。
随着基因检测技术的发展以及对听力健康的关注，目前市场上检测耳聋的试剂盒所用的方法主要有基因芯片法、溶解曲线法、ARMS-PCR法、RFLP法。其中，基因芯片法一般需要提取、PCR扩增、杂交、洗涤、扫描等步骤，操作较复杂耗时长，对操作者和实验场地要求较高。溶解曲线法对仪器的温控性要求很高，要求仪器具有高分辨率溶解曲线分析(HRM)功能，而我们常用的ABI系列荧光定量PCR仪一般缺少此功能。ARMS-PCR法和RFLP法需要对PCR产物进行电泳分析，不适于临床应用。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒能专一地检测先天性耳聋中常见的八个位点，一个PCR反应管内可对这八个位点同时进行检测，明确高突变率位点的类别，确定低突变率位点范围，且操作简便快捷，结果客观可控性强，效率高、成本低，闭管操作防污染，适用多通道荧光PCR仪，是临床上进行先天性耳聋检测的强有力产品。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，以GJB2基因的35delG、155delTCTG、176del16bp、235delC、299-300delAT、512insAACG突变，和GJB3基因的538C>T、547G＞A突变为检测对象，设计特异性引物和探针，所述特异性引物包括用于扩增35delG、155delTCTG、176del16bp、235delC、299-300delAT的引物1，其序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于扩增512insAACG的引物2，其序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示；用于扩增538C>T和547G＞A的引物3，其序列如序列表中SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示；所述探针为特异性检测GJB2基因的35、155、176、235、299位点，和GJB3基因的538、547位点是否含有突变，其探针序列如序列表中SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14所示。
具体的，35、155、176、235、299五个位点在GJB2基因上的位置比较集中，故共用一对引物(引物1)，以避免引物过多造成干扰，正向引物选在35位点上游保守区，反向引物选在299位点下游保守区，扩增片段长度为378bp；GJB2基因上的512位点独用一对引物(引物2)，引物位置选在512位点两侧翼的保守区，扩增片段长度为100bp；538、547两个位点在GJB3基因上的距离相近，故共用一对引物(引物3)，正向引物选在538位点上游保守区，反向引物选在547位点下游保守区，扩增片段长度为150bp。所述引物序列如下：
引物1F:5’-ATGGATTGGGGCACGCTG-3’(SEQ ID NO:1)，
引物1R：5'-GACCTTCTGGGTTTTGAT-3'(SEQ ID NO:2)
引物2F：5’-GTACGACGGCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO:3)
引物2R：5’-GACAGTCTTCTCCGTGGG-3’(SEQ ID NO:4)
引物3F：5'-CTCTTCCTCTACCTGCTGC-3'(SEQ ID NO:5)
引物3R：5'-GCCCACCATGAAGTAGGTG-3'(SEQ ID NO:6)
所述探针序列如下：
35P:5’-ATCCTGGGGGTGTGAA-3’(SEQ ID NO:7)
155P:5’-CCGACTTTGCAACACCCTG-3’(SEQ ID NO:8)
176P:5’-ATCGTAGCTGGCTGCAGG-3’(SEQ ID NO:9)
235P:5’-CCGGCTATGGGCCTGCAGCT-3’(SEQ ID NO:10)
299P:5’-TGGCCTACCGGAGACGAGAAG-3’(SEQ ID NO:11)
512P:5’-TGAAGTGCAACGAACGCCTGGC-3’(SEQ ID NO:12)
538P:5'-TGGACTGCTACATTGCCTGA-3'(SEQ ID NO:13)
547P:5'-AGATTTTCTTCTTGGTAGG-3'(SEQ ID NO:14)
所述探针还分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团，其中，用于检测235、299、176位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5；用于检测35、155、512、538、547位点的探针的荧光发光基团均为TAMRA；各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。
该先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，还包括用于监测扩增模板的有效性的1对β-Actin内参引物和1条内参探针，其序列分别如序列表中SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQID NO:17所示。
具体的，β-Actin内参引物的序列如下：
β-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3'(SEQ ID NO:15)
β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3'(SEQ ID NO:16)
内参探针的序列为：
β-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'(SEQ ID NO:17)
所述内参探针的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。
该先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，还包括有阴性质控、阳性质控，阴性质控为连入T载体的内参基因、正常GJB2基因、正常GJB3基因部分序列，其序列如序列表中SEQ IDNO:18所示；阳性质控为连入T载体的内参基因、含235、299、176、512突变位点部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:19所示。质控的设立可保证检测结果在控，避免假阴性、假阳性的出现。
具体的，一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，由DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控组成，其中，每50μl PCR反应液的组成为：10×PCR缓冲液5.0μl、MgCl22.0～5.0mM、dNTPs 0.5～1.5mM、引物0.2～2.0μM、探针0.1～1.0μM、Taq酶2.0～4.0U、UNG酶0.5～1.0U，加水至50μl。所述引物为引物1、引物2、引物3和内参引物；所述探针为8条检测是否含有突变的探针和1条内参探针。UNG酶的加入有效去除PCR扩增前的U-DNA污染。
采用该先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒进行检测的方法，步骤为：
将待检测样品的DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控加入到PCR反应管内，混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：50℃2min；95℃3min；95℃15s，60℃45s，40个循环，每个循环在60℃采集荧光；根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在突变。
首先阴性质控、阳性质控的检测结果应与预期相符，即阴性质控仅有FAM曲线扩增，无其它荧光曲线扩增，阳性质控FAM、VIC、ROX、Cy5、TAMRA曲线均有扩增。只有阴性质控、阳性质控扩增曲线结果与预期相符后，才可对样本孔进行分析。
若样品孔采集到FAM信号，表明内参基因扩增正常，样本DNA是有效的；
若样品孔未采集到FAM信号，表明内参基因扩增失败，样本DNA无效或仪器存在问题，本次检测结果无效；
若样品孔有FAM、VIC信号，无ROX、Cy5、TAMRA信号，表明样本为235突变；
若样品孔有FAM、ROX信号，无VIC、Cy5、TAMRA信号，表明样本为299突变；
若样品孔有FAM、Cy5信号，无VIC、ROX、TAMRA信号，表明样本为176突变；
若样品孔有FAM、TAMRA信号，无VIC、ROX、Cy5信号，表明样本为35、155、512、538、547突变中的某一种或几种。
本发明的有益效果：
(1)本发明的检测试剂盒中引入管家基因肌动蛋白β-Actin作为内参对照，设计1对特异引物和1条特异探针，扩增片段长度为94bp，在同一PCR管内与待测位点引物同时扩增，以检测样本DNA的有效性、监测PCR体系的有效性，除此之外，还可检测样品孔或仪器是否存在问题，防止出现假阴性。
(2)由于35、155、176、235、299五个位点在GJB2基因上的位置比较集中，本发明采取将上述五个位点共用一对引物，有效避免了引物过多造成的干扰。
(3)本发明分别针对35、155、176、235、299、512、538、547位点处设计8条特异的突变型探针，35、155、235、512、538位点的探针序列在模板链上设计，176、299、547位点的探针序列在互补链上设计，以避免位点间距离过近相互干扰，同时减轻DNA聚合酶对1条以上探针的水解压力。
(4)本发明分别针对内参基因、235、299、176位点的共四条探针进行不同荧光标记，内参基因-FAM，235-VIC，299-ROX，176-Cy5，首先根据内参基因的特异荧光曲线有无判断样本DNA是否有效，进而根据VIC、ROX、Cy5特异荧光曲线有无可具体明确235、299、176位点是否存在突变，从而对与先天性耳聋相关的高致病率位点进行有效确认；对突变率较235、299、176低的位点35、155、512、538、547进行同种荧光TAMRA标记，若反应孔有TAMRA信号，则样本的突变位点为35、155、512、538、547中的某一种或几种，从而提高位点覆盖率。
(5)本发明首次实现了应用多通道荧光PCR方法在同一个反应管中同时检测先天性耳聋的八个突变位点，该方法操作简便快速、准确、高通量、成本低，闭管操作避免交叉污染，使得耳聋筛查目的性强、筛查范围广，有效预防先天性耳聋发生，易于推广及应用。
附图说明
图1为阴性质控的PCR扩增曲线；
图2为阳性质控的PCR扩增曲线；
图3为正常人样本PCR扩增曲线；
图4为235突变型样本PCR扩增曲线；
图5为235、299突变型样本PCR扩增曲线。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒组成及其检测方法
1.试剂盒的组成：
DNA提取液1管(5.0ml)、PCR反应液1管(1.1ml)、阴性质控1管(50μl)、阳性质控1管(50μl)；
每50μl PCR反应液的组成为：10×PCR缓冲液5.0μl、MgCl23.0mM、dNTPs 1.0mM、引物1.0μM、探针0.5μM、Taq酶3.0U、UNG酶1.0U，加水至50μl。
其中，引物为引物1、引物2、引物3和内参引物，其序列分别为：
引物1F:5’-ATGGATTGGGGCACGCTG-3’(SEQ ID NO:1)，
引物1R：5'-GACCTTCTGGGTTTTGAT-3'(SEQ ID NO:2)
引物2F：5’-GTACGACGGCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO:3)
引物2R：5’-GACAGTCTTCTCCGTGGG-3’(SEQ ID NO:4)
引物3F：5'-CTCTTCCTCTACCTGCTGC-3'(SEQ ID NO:5)
引物3R：5'-GCCCACCATGAAGTAGGTG-3'(SEQ ID NO:6)
β-ActinF:5'-CACCCAGCACAATGAAGA-3'(SEQ ID NO:15)
β-ActinR:5'-AAGGTGGACAGCGAGGC-3'(SEQ ID NO:16)
探针为8条检测是否含有突变的探针和1条内参探针，其序列分别为：
35P:5’-ATCCTGGGGGTGTGAA-3’(SEQ ID NO:7)
155P:5’-CCGACTTTGCAACACCCTG-3’(SEQ ID NO:8)
176P:5’-ATCGTAGCTGGCTGCAGG-3’(SEQ ID NO:9)
235P:5’-CCGGCTATGGGCCTGCAGCT-3’(SEQ ID NO:10)
299P:5’-TGGCCTACCGGAGACGAGAAG-3’(SEQ ID NO:11)
512P:5’-TGAAGTGCAACGAACGCCTGGC-3’(SEQ ID NO:12)
538P:5'-TGGACTGCTACATTGCCTGA-3'(SEQ ID NO:13)
547P:5'-AGATTTTCTTCTTGGTAGG-3'(SEQ ID NO:14)
β-ActinP:5'-CTCCTGAGCGCAAGTACTCCGTG-3'(SEQ ID NO:17)
对上述探针进行荧光标记，上述探针分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团，其中，用于检测235、299、176位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5；用于检测35、155、512、538、547位点的探针的荧光发光基团均为TAMRA，内参探针的荧光发光基团为FAM；各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。
阴性质控为连入T载体的内参基因、正常GJB2基因、正常GJB3基因部分序列，其序列为：
cacccagcacaatgaagatcaagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccaccttatggattggggcacgctgcagacgatcctggggggtgtgaacaaacactccaccagcattggaaagatctggctcaccgtcctcttcatttttcgcattatgatcctcgttgtggctgcaaaggaggtgtggggagatgagcaggccgactttgtctgcaacaccctgcagccaggctgcaagaacgtgtgctacgatcactacttccccatctcccacatccggctatgggccctgcagctgatcttcgtgtccacgccagcgctcctagtggccatgcacgtggcctaccggagacatgagaagaagaggaagttcatcaagggggagataaagagtgaatttaaggacatcgaggagatcaaaacccagaaggtccgcatcgaaggctccctgtggtggacctacacaagcagcatcttcttccgggtcatcttcgaagccgccttcatgtacgtcttctatgtcatgtacgacggcttctccatgcagcggctggtgaagtgcaacgcctggccttgtcccaacactgtggactgctttgtgtcccggcccacggagaagactgtcttcacagtgttcatgattgcagtgtctggaatttgcatcctgctgaatgtcactgaattgtgttatttgctaattagatattgttctgggaagtcaaaaaagccagtttaacctcttcctctacctgctgcacactctctggcatggcttcaatatgccgcgcctggtgcagtgtgccaacgtggccccctgccccaacatcgtggactgctacattgcccgacctaccgagaagaaaatcttcacctacttcatggtgggcg。
阳性质控为连入T载体的内参基因、含235、299、176、512突变位点部分序列，其序列为：
cacccagcacaatgaagatcaagatcattgctcctcctgagcgcaagtactccgtgtggatcggcggctccatcctggcctcgctgtccaccttatggattggggcacgctgcagacagccagctacgatcactacttccccatctcccacatccggctatgggcctgcagctgatcttcgtgtccacgccagcgctcctagtggccatgcacgtggcctaccggagacgagaagaagaggaagttcatcaagggggagataaagagtgaatttaaggacatcgaggagatcaaaacccagaaggtccgcatcgaaggctccctgtggtggacctacacaagcagcatcttcttccgggtcatcttcgaagccgccttcatgtacgtcttctatgtcatgtacgacggcttctccatgcagcggctggtgaagtgcaacgaacgcctggccttgtcccaacactgtggactgctttgtgtcccggcccacggagaagactgtc.
2.检测方法：
1)基因组DNA提取：
全血：取200μl EDTA抗凝血至1.5ml新的无菌EP管中，加入600μl双蒸水，振荡混匀，室温放置10min；期间混匀2-3次，12000rpm离心5min，弃上清；加入200μl DNA提取液(使用前充分混匀，使颗粒悬浮)，100℃水浴8min；12000rpm离心5min，取上清用于检测。
干血斑：取直径约为3mm血片于1.5ml新的无菌EP管中，加入500μl双蒸水，漩涡振荡，室温放置5min；12000rpm离心1min，弃上清；加入200μlDNA提取液(使用前充分混匀，使颗粒悬浮)，100℃水浴8min，取出振荡15-30s；12000rpm离心5min，取上清用于检测。
2)加样、PCR扩增：
分装45μl PCR反应液于PCR反应管内，分装管数＝n+2(注：n为待测样本数，2为用于阴性质控、阳性质控的管数)；分别加入5μl待测DNA模板、阴性/阳性质控，混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应；反应程序为50℃2min；95℃3min；95℃15s，60℃45s，40个循环，每个循环在60℃采集荧光。
3)结果分析：
根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在突变。首先阴性质控、阳性质控的检测结果应与预期相符，即阴性质控仅有FAM曲线扩增，无其它荧光曲线扩增，如图1所示，阳性质控FAM、VIC、ROX、Cy5、TAMRA曲线均有扩增，如图2所示。只有阴性质控、阳性质控扩增曲线结果与预期相符后，才可对样本孔进行分析。
若样品孔采集到FAM信号，如图3所示，表明内参基因扩增正常，样本DNA是有效的；
若样品孔未采集到FAM信号，表明内参基因扩增失败，样本DNA无效或仪器存在问题，本次检测结果无效；
若样品孔有FAM、VIC信号，无ROX、Cy5、TAMRA信号，如图4所示，表明样本为235突变；
若样品孔有FAM、ROX信号，无VIC、Cy5、TAMRA信号，表明样本为299突变；
若样品孔有FAM、VIC和ROX信号，无Cy5、TAMRA信号，如图5所示，表明样本为235和299突变；
若样品孔有FAM、Cy5信号，无VIC、ROX、TAMRA信号，表明样本为176突变；
若样品孔有FAM、TAMRA信号，无VIC、ROX、Cy5信号，表明样本为35、155、512、538、547突变中的某一种或几种。
试验证明，本发明的试剂盒的检测准确率为100％，假阳性率为0，假阴性率为0，结果准确可靠。本发明试剂盒的检测时间约1小时，与现有的检测试剂盒相比，简单快速；而且，本试剂盒检测所需仪器价格相对较低且较普遍，故检测成本相对较低。

Claims (10)

1.一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，以GJB2基因的35delG、155delTCTG、176del16bp、235delC、299-300delAT、512insAACG突变，和GJB3基因的538C>T、547G＞A突变为检测对象，设计特异性引物和探针，所述特异性引物包括用于扩增35delG、155delTCTG、176del16bp、235delC、299-300delAT的引物1，其序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；用于扩增512insAACG的引物2，其序列如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；用于扩增538C>T和547G＞A的引物3，其序列如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述探针为特异性检测GJB2基因的35、155、176、235、299位点，和GJB3基因的538、547位点是否含有突变，其探针序列如序列表中SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14所示。
2.如权利要求1所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针还分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团，其中，用于检测235、299、176位点的探针的荧光发光基团分别为VIC、ROX、Cy5；用于检测35、155、512、538、547位点的探针的荧光发光基团均为TAMRA；各探针的荧光淬灭基团均为BHQ-1。
3.如权利要求1所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括用于监测扩增模板的有效性的1对β-Actin内参引物和1条内参探针，其序列分别如序列表中SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示。
4.如权利要求3所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述内参探针为荧光标记的探针，其荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ-1。
5.如权利要求1所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括有阴性质控、阳性质控；
所述阴性质控为连入T载体的内参基因、正常GJB2基因、正常GJB3基因部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:18所示；阳性质控为连入T载体的内参基因、含235、299、176、512突变位点部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:19所示。
6.一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，其具体组成为：DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控；其中，每50μl PCR反应液的组成为：10×PCR缓冲液5.0μl、MgCl22.0～5.0mM、dNTPs 0.5～1.5mM、引物0.2～2.0μM、探针0.1～1.0μM、Taq酶2.0～4.0U、UNG酶0.5～1.0U，加水至50μl。
7.如权利要求6所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物为引物1、引物2、引物3和内参引物，其序列分别如序列表中SEQ ID NO:1至SEQID NO:6和SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16所示。
8.如权利要求6所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针为8条检测是否含有突变的探针和1条内参探针，其序列分别如序列表中SEQ IDNO:7至SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17所示。
9.如权利要求6所述的一种先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性质控为连入T载体的内参基因、正常GJB2基因、正常GJB3基因部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:18所示；阳性质控为连入T载体的内参基因、含235、299、176、512突变位点部分序列，其序列如序列表中SEQ ID NO:19所示。
10.权利要求1-9任一项所述的先天性耳聋基因多通道荧光PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤如下：将待检测样品的DNA提取液、PCR反应液、阴性质控和阳性质控加入到PCR反应管内，混匀后置于荧光定量PCR仪上进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：50℃2min；95℃3min；95℃15s，60℃45s，40个循环，每个循环在60℃采集荧光；根据扩增曲线的信号情况定性判断是否存在突变。
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