CN104911274B - 一种单细胞实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单细胞实时荧光定量PCR检测方法。该检测方法包括以下步骤：(1)单细胞捕获；(2)cDNA的合成；(3)用SYBRGreen染料法对基因表达水平定量检测。该检测方法采用膜片钳技术中的玻璃微管电极，在倒置相差显微镜下，根据毛细现象原理捕获单个细胞，然后采用Oligo(dT)₂₀引物，以mRNA为模板反转录合成cDNA，对表达丰度极低的基因可采用多次退火环状循环扩增技术进行cDNA扩增复制，最后再进行实时荧光定量PCR检测。本发明所述检测方法误差小、准确度和灵敏度高，适用于急性酶分离的哺乳动物细胞、原代培养的细胞、传代培养的成熟细胞系等多种细胞。本发明还提供一种单细胞实时荧光定量PCR试剂盒。

Description

一种单细胞实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生理学及细胞分子生物学领域，具体涉及一种单细胞实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。

背景技术

基因表达水平的实时定量检测是医学及生命科学研究中的重要内容，是研究疾病的发病机理及临床诊断、治疗的重要技术手段，如在病理状态下检测疾病易感基因或关联基因的表达变化或外加因素处理前后相关基因的表达差异等。目前常规的方法是采集组织块或组织液标本，提取RNA并反转录为cDNA，再进行实时定量检测，根据目前最常用的trizol法提取RNA的要求，组织块质量要求约50-100mg，细胞数量要求约5×10⁶个细胞。现有方法不适用于微量及痕量组织标本基因表达的定量检测。

组织块或组织液成分复杂，含有多种细胞及细胞外基质。某一特定组织的某一种细胞甚至某一个细胞中基因表达的定量检测是现代医学和生命科学研究中至关重要技术手段。然而，现有方法只能针对组织块或组织液整体进行RNA提取、反转录及基因定量检测，不适用于组织中某一种特定细胞甚至某一个特定细胞的基因定量检测。因而，需要一种更为精确、灵敏、高效的基因定量检测技术。

单细胞实时荧光定量PCR技术是以单个细胞为模板，将mRNA反转录为cDNA，再进行相关基因的定量检测。该技术通常包含以下步骤：(1)捕获单细胞，(2)单细胞裂解及基因组DNA消化，(3)反转录合成cDNA，(4)cDNA扩增复制，(5)实时荧光定量PCR检测。该方法精确度高，灵敏度高，能够准确的对单个细胞的基因表达水平进行检测，并且可同时检测同一个细胞内的多个基因。该方法解决了常规方法中组织块成分复杂，不能精确检测单个细胞的缺陷，解决了常规方法中不能检测微量及痕量标本的缺陷。

现有的常规单细胞实时荧光定量PCR技术中主要存在以下问题：

(1)捕获单细胞通常使用的是细胞膜片钳技术，首先将膜片钳玻璃微管电极接触细胞，同时施加一定的负压，将细胞吸入玻璃微管电极中。然而，膜片钳玻璃微管电极口径约为1-5μm，远远小于细胞直径，用这样的电极接触细胞后施加负压，不能将完整的细胞吸入电极，只能将一小部分细胞膜吸破，导致细胞从电极尖端脱落，细胞核及细胞质丢失，无法捕获完整的单个细胞。如果采用电极口径大于细胞直径的玻璃微管电极捕获单细胞，负压抽吸将在吸入细胞的同时吸入大量的细胞浴液，使细胞浴液充满整个玻璃微管电极，并倒灌进入电极夹持器内部，污染电极夹持器。电极夹持器被污染后将导致膜片钳实验噪声增大，严重影响实验结果的准确性，严重影响膜片钳系统的精准性。

过多的细胞浴液还会降低反转录的效率。一般情况下，反转录时反应液体积最多不超过25uL，如果电极中吸入了过多的溶液，在配制反转录反应液时体积容易超过25uL，会改变反应液中酶及各种离子的浓度，将影响反转录的效率及成功率。捕获单细胞时，如果在吸入细胞的同时吸入了过量的细胞浴液，常规的解决方法是在反转录前，通过离心使细胞沉降，然后除去多余的溶液。但通过离心使单个细胞沉降的成功率很低，并且离心易导致细胞受损破裂，RNA丢失，无法获得完整的单个细胞，而降低实验的准确度和灵敏度。

(2)单个细胞mRNA量约1pg，反转录获得的cDNA量极少，对于一些表达丰度低的基因检测难度大，同时，不能满足同时检测多个基因的要求。因此，需要对cDNA进行扩增复制。

常规的cDNA复制扩增只针对目的片段，在目的片段的上游和下游分别设计引物，用PCR方法将含有目的片段的部分cDNA序列进行扩增复制，再以扩增产物为模板，用目的基因的引物进行PCR检测。因此，在检测多个基因时，常规方法需要针对多个不同待检基因分别设计cDNA扩增复制引物，由于不同引物的扩增效率不同，必然将导致该方法在进行多个基因检测时，扩增效率参差不齐，并且操作繁琐。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种单细胞实时荧光定量PCR检测方法。该检测方法采用膜片钳技术中的玻璃微管电极，在倒置相差显微镜下，根据毛细现象原理捕获单个细胞，然后采用Oligo(dT)₂₀引物，以mRNA为模板反转录合成cDNA，对表达丰度极低的基因可采用多次退火环状循环扩增技术进行cDNA扩增复制，最后再进行实时荧光定量PCR检测。本发明所述检测方法误差小、准确度和灵敏度高，适用于急性酶分离的哺乳动物细胞、原代培养的细胞、传代培养的成熟细胞系等多种细胞。

本发明的再一目的是提供一种单细胞实时荧光定量PCR试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明所述的单细胞实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)单细胞捕获

A、细胞准备

将细胞悬液滴于浴槽中让其自然贴附，静置8～15min后，加入台式液备用；

B、电极准备

拉制电极的毛细玻璃管先经150～200℃干烤4～8h后再用于拉制电极；将制备电极的毛细玻璃管固定于垂直微管电极拉制仪上；电极经两步拉制，第一步中电流为55～65mA，粗拉使毛细玻璃管中间拉成一窄细状，第二步中电流为50～60mA，拉制使窄细部位断开；

C、细胞收集

借助倒置相差显微镜，利用微推进器，控制微管电极进入浴槽溶液并靠近细胞，利用微推进器接触浴槽底部将电极尖端折断，再利用微推进器将折断尖端的电极顺着细胞的纵长方向靠近细胞，让细胞顺势滑入电极；迅速将电极提出液面，深入到收集细胞的无RNase的PCR管底部，将电极内的细胞连带液体全部推入管内，最后在PCR管侧壁折断电极前端，迅速冷冻；

(2)cDNA的合成

A、细胞裂解

采用冻融法裂解细胞，得到裂解的细胞液；

B、基因组DNA消化

将裂解的细胞液配制成10μl的细胞基因组DNA酶解体系，置于37℃下反应30min，然后加入0.5mol/l的EDTA 1μl，终止反应，其中EDTA的pH为8.0；接着于65℃下孵育10min，再在3～5℃下离心25～40s，备用；

C、反转录合成cDNA

在上述步骤(2)B项得到的体系中加入10pmol/μl的Oligo(dT)₂₀1μl，65℃孵育5min，冰浴1～3min，得变性后的RNA溶液；将变性后的RNA溶液12μl、5×RT Buffer 4μl、dNTP Mixture 2μl、Rever Tra Ace反转录酶1μl和DEPC处理的去离子水1μl混合，配制成反转录反应液；反转录的反应条件为42℃反转录合成20min，99℃变性5min，4℃保存5min，得到cDNA；

D、cDNA扩增

cDNA扩增采用单细胞全基因组扩增试剂盒；

取1μL cDNA，加入5μL Cell Lysis Buffer、0.1μL Cell Lysis Enzyme，混匀，得到体系I，将体系I于PCR仪中50℃孵育50min，80℃孵育10min；然后加入30μL Pre-AmpBuffer、1μL Pre-Amp Enzyme Mix，混匀，得到体系II，将体系II于PCR仪中94℃孵育3min；20℃孵育40s，30℃孵育40s，40℃孵育30s，50℃孵育30s，60℃孵育30s，70℃孵育4min，95℃孵育20s，58℃孵育10s，共8个循环；再加入30μL Amplification Buffer、0.8μL AmpEnzyme Mix，混匀，得到体系III，将体系III于PCR仪中94℃孵育30s；94℃孵育20s，58℃孵育30s，72℃孵育3min，共18个循环，产物纯化后于-20℃保存，得到cDNA模板；

(3)用SYBR Green染料法对基因表达水平定量检测

将SYBR Green PCR master mix 10μl、10μmol/l的上游引物0.5μl、10μmol/l的下游引物0.5μl、cDNA模板2μl、无菌水7μl混合均匀，得到Real time PCR反应体系；

PCR反应程序如下：

①95℃预变性3min；

②94℃变性30sec；

③59℃退火30sec；

④72℃延伸30sec；

⑤78℃温浴1sec；

读板，步骤②至⑤重复44个循环；

72℃延伸10min；

生成熔解曲线，从65℃至98℃，每1℃持续1sec；

72℃延伸10min。

本发明所述检测方法采用膜片钳技术捕获单个细胞，在倒置相差显微镜下，首先将玻璃微管电极接近细胞，但不与细胞接触，当电极尖端接近细胞后，操作微推进器在浴槽底部将电极尖端折断，根据毛细现象原理，细胞会顺势滑入电极，迅速将电极提出液面，深入到无RNA酶的PCR管底部，将电极内的细胞连带液体全部推入管内，最后在PCR管侧壁折断电极前端，迅速冷冻保存。本发明利用玻璃微管电极折断的瞬间毛细现象产生的拉力将细胞吸入电极，这一过程力量适中，既能够将细胞顺利吸入电极并保证细胞膜完整无损，又不会使细胞浴液灌满整个微管电极，解决了现有方法中负压抽吸容易损坏电极夹持器的缺陷。同时，玻璃微管电极在吸入细胞的同时，吸入的细胞浴液一般不超过5uL，解决了现有方法中吸入过多液体而影响反转录反应体系离子浓度的缺陷。

本发明所述检测方法中的单细胞捕获降低了对单细胞的细胞膜损坏，保证了反转录体系的稳定性和准确率，进而保证后续反应的灵敏度，使定量结果更为准确可靠。

本发明所述检测方法以mRNA为模板，用Oligo(dT)₂₀引物进行反转录扩增合成cDNA，然后采用多次退火环状循环扩增技术对cDNA进行复制扩增，该技术能够在4h内，从低于ng级的cDNA扩增复制得到ug级的DNA，该方法可获得95％以上的基因扩增成功率，并可实现AT-GC富集区的成功扩增。本发明所述的cDNA扩增不需要针对多个不同待检基因分别设计cDNA扩增复制引物，操作简便，扩增效率高，有效克服了现有技术的缺陷。

优选地，所述步骤(1)中毛细玻璃管的长度为70～80mm，经两步控制后电极尖端直径为0.8～1.2μm。为了防止电极进入液面后液体过多地进入电极，电极尖端的口径不宜太大，本发明优选电极经两步控制后电极尖端直径为0.8～1.2μm。最佳优选地，所述步骤(1)中毛细玻璃管的长度为75mm，电极经两步控制后电极尖端直径为1μm。

优选地，所述步骤(1)中所使用的器械、容器及溶液均做RNA酶灭活处理，可有效避免单细胞样品中的RNA被实验器械、容器及溶液中可能存在的RNA酶降解。

优选地，所述步骤(2)A项中冻融法裂解细胞的方法为：将装有单个细胞的PCR管置于液氮中冷冻2～4min，取出后转移至20～25℃水浴中放置2～4min，重复3次；再于3～5℃下离心1～3min。单个细胞所含的mRNA量极为稀少，约1pg，不适用于常规的RNA抽提方法。本发明采用直接裂解细胞的方法获得RNA。在本发明所述的冻融法裂解细胞的方法中，液氮的沸点为-196℃，温差大，细胞裂解快速、高效，且不用添加任何试剂，发明人经多次试验未发现对后续反应造成影响，保证了细胞PCR扩增的准确性及灵敏度。

优选地，所述步骤(2)B项中10μl的细胞基因组DNA酶解体系包括1U/μl的DNase I1μl，10×Reaction Buffer 1μl，40U/μl的RNase inhibitor 0.25μl，余量为DEPC处理的去离子水和裂解的细胞液。可以有效地实现基因组DNA消化。

本发明所述的上游引物和下游引物是针对检测对象的不同而设计相应的引物。优选地，本发明所述检测方法可分别对肠系膜血管平滑肌细胞进行大电导钙激活钾通道(BKα)基因及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因进行检测。分别以Gene Bank中公布的BKα(NM_001014797.2)及GAPDH(NM_001289746.1)基因序列为模板，按照跨越不同外显子的原则设计实时定量PCR引物。所述步骤(3)中上游引物和下游引物的序列如下：

上游引物P1的序列为SEQ ID NO.1，下游引物P2的序列为SEQ ID NO.2；或者上游引物P1的序列为SEQ ID NO.3，下游引物P2的序列为SEQ ID NO.4。

本发明所述的单细胞实时荧光定量PCR试剂盒，其试剂盒中包含：玻璃微电极，所述电极尖端直径为0.8～1.2μm，充灌电极液后电极阻抗为3～5MΩ；DNase I,RNase-free1U/μl；10×DNaseI Reaction Buffer；0.5mol/l的EDTA，所述EDTA的pH为8.0；10pmol/μl的Oligo(dT)₂₀；5×RT Buffer；dNTP Mixture；Rever Tra Ace反转录酶；DEPC水；Cell LysisBuffer；Cell Lysis Enzyme；Pre-Amp Buffer；Pre-Amp Enzyme Mix；AmplificationBuffer；Amp Enzyme Mix；SYBR Green PCR master mix；10μmol/l的上游引物，10μmol/l的下游引物；cDNA模板2μl；无菌水。

在上述单细胞实时荧光定量PCR试剂盒中，所述上游引物和下游引物是针对检测对象的不同而设计相对应的引物。

本发明的有益效果在于：

(1)与现有的膜片钳利用压力差捕获单细胞方法相比，本发明检测方法利用玻璃微管电极折断的瞬间毛细现象产生的拉力将细胞吸入电极，这一过程力量适中，能顺利的将细胞吸入电极并保证细胞膜完整无损，并且吸入的细胞浴液一般不超过5uL。能够有效的减少吸取溶液的体积，解决了现有方法中由于电极吸入液体过多污染电极夹持器，导致膜片钳实验噪声增大的缺陷。本发明的检测方法有效降低了捕获过程对单细胞的损坏，最大限度地维持细胞的原状，防止单细胞中RNA的丢失，减少外源RNA酶对单细胞中的mRNA的降解作用，进而保证后续反应的灵敏度，使得定量结果更为准确可靠。

(2)与现有的cDNA扩增复制方法相比，本发明采用多次退火环状循环扩增技术，不需要根据不同的目的基因分别设计相应的cDNA扩增复制引物.本发明的cDNA扩增复制可覆盖90％以上的基因座，可实现AT-GC富集区的成功扩增，效率极高，能够从ng级的cDNA扩增复制得到ug级的DNA。

(3)本发明的单细胞实时荧光定量PCR检测方法，能够精确检测到某一特定细胞内的基因表达情况，克服了常规基因表达水平定量检测方法中组织块成分复杂，结果不精确的缺陷，同时弥补了对最小标本量限制的缺点，所需标本量低，只要1个细胞，适用于极其珍贵、稀少的微量标本。同时该检测方法检测效率高，可同时对1个细胞内的多个基因进行检测。

说明书附图

图1为急性酶分离的人体肠系膜血管平滑肌细胞在10×10倍视野下的透射光图片。

图2为急性酶分离的人体肠系膜血管平滑肌细胞在63×10倍视野下的透射光甘油镜图片。

图3为人体肠系膜血管平滑肌细胞的收集示意图。

图4为平滑肌细胞BKα基因PCR荧光曲线图。

图5为平滑肌细胞BKα基因PCR熔解曲线图。

图6为平滑肌细胞GAPDH基因PCR荧光曲线图。

图7为平滑肌细胞GAPDH基因PCR熔解曲线图。

图8为平滑肌细胞cDNA扩增复制前后电泳图(1,2：阴性对照；3,4,5：未扩增复制的cDNA；5：扩增复制后的cDNA)。

图9为平滑肌细胞cDNA扩增复制前后BKα基因PCR荧光曲线图(A:PCR模板为扩增复制后的cDNA；B:PCR模板为扩增复制后的cDNA进行10被稀释；C:PCR模板为扩增复制后的cDNA进行100被稀释；D:PCR模板为未经过扩增复制的cDNA。)

图10为不同方法裂解的细胞PCR电泳图(M：DNA分子量标准；1：0.5μl Trizol裂解细胞；2：1μl Trizol裂解细胞；3：0.5μl triton X-100裂解细胞；4：0μl triton X-100裂解细胞；5：加0.5μl Trizol后冻融细胞；6：加0.5μl Trizol后冻融细胞；7,8：冻融细胞)

图11为不同方法裂解的细胞PCR荧光曲线图(a、b两组采用冻融法裂解细胞；c、d两组采用Triton X-100法裂解细胞)。

图12为cDNA模板稀释后PCR扩增BKα基因电泳图(M：DNA分子量标准；1,2：1/10个细胞的RT-PCR扩增产物；3,4：1/100个细胞的RT-PCR扩增产物；5,6：1/1000个细胞的RT-PCR扩增产物；7,8：1/10000个细胞的RT-PCR扩增产物)。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

以下以检测人肠系膜血管平滑肌BKα基因为例，详细说明本发明的操作方法和步骤。

实施例1

(1)人体血管平滑肌细胞的分离

A、人体血管的获取

人体血管取自医院行腹部手术的患者切除物中的肠系膜动脉A4-A5分支。

B、细胞分离溶液的制备

溶液Ⅰ(mmol/L)：NaCl 127mmol/L、KCl 5.9mmol/L、MgCl₂1.2mmol/L、glucose12mmol/L、HEPES 10mmol/L和CaCl₂2.4mmol/L，溶于0.1％的DEPC水中，用NaOH调节pH至7.40，用于血管的保存和分离。

溶液Ⅱ(mmol/L)：NaCl 127mmol/L、KCl 5.9mmol/L、MgCl₂1.2mmol/L、glucose12mmol/L、HEPES 10mmol/L，溶于0.1％的DEPC水中，用NaOH调节pH至7.40，用于酶的溶解及细胞分离和保存。

酶液Ⅰ(mg/ml)：将木瓜蛋白酶(Sigma)1.0mg/ml、DTT 0.68mg/ml、白蛋白2.0mg/ml，溶于溶液Ⅱ中。

酶液Ⅱ(mg/ml)：将F型胶原酶(Sigma)1.615mg/ml溶于溶液Ⅱ中。

C、急性酶分离人肠系膜动脉平滑肌细胞

将取得的组织块置入4℃的溶液Ⅰ中，在体式显微镜下快速仔细剔除血管壁上的脂肪组织和纤维结缔组织，将血管纵行剖开，并用镊子轻轻刮去血管内外膜，接着将其转入盛溶液Ⅱ的器皿内斜行剪成2mm×2mm的组织条块。将组织条块置于酶液I中，于37℃恒温水浴箱中振荡消化约9min；再置于酶液II中消化约4min，即得到细胞膜悬液，细胞的细胞膜完整光滑、折光性好，如图1和图2所示。然后静置于4℃冰箱中，保存备用。

(2)单细胞捕获

A、细胞准备

将上述分离的细胞悬液滴于浴槽中让其自然贴附，静置8～15min后，加入溶液Ⅱ备用。

B、电极准备

拉制电极的毛细玻璃管(如：Hematocrit Tubes，Drummond，U.S.A.)，内径1.0～1.2mm，外径1.3～1.7mm，长度为70～80mm，先经过150～200℃干烤4～8h后再用于拉制电极，任意拉制机都可以用于电极拉制。本实验使用日本PC-10(NARISHIGE公司)垂直微管电极拉制仪。为了防止电极进入液面后液体过多地进入电极，电极尖端的口径不宜太大。电极经两步拉制，经过一次粗拉使玻璃管中间拉成一窄细状，第二次拉制使窄细部位断开。首先设定电极两步拉制参数:第一步中电流为55～65mA，第二步中电流为50～60mA；然后将制备电极的毛细玻璃管固定于PC-10垂直微管电极拉制仪上。经过两步拉制后电极尖端直径为0.8～1.2μm，若充灌电极液后电极阻抗为3～5MΩ。

电极入水前不灌液、不加正压，直接入液。若加正压入水，则在撤掉正压时液体容易灌入电极，损坏电极夹持器。

C、细胞收集

借助倒置相差显微镜，利用微推进器，控制微管电极进入浴槽溶液并靠近细胞(如图3A所示)，利用微推进器接触浴槽底部将电极尖端折断(如图3B所示)，再利用微推进器尽量将折断尖端的电极靠近细胞，此时由于折断电极产生的虹吸现象会使细胞自然吸进电极内，电极应顺着细胞的纵长方向靠近细胞，让细胞顺势滑入电极(如图3C所示)。迅速利用推进器的粗调将电极提出液面，以免过多的液体灌进电极内。将电极深入到收集细胞的无RNase的PCR管底部，给电极内施以正压，将电极内的细胞连带液体全部推入管内，最后在PCR管侧壁折断电极前端，以保证取到的细胞被置入管中，迅速冷冻。

所述步骤(2)中所有使用的器械、容器及溶液均做RNA酶灭活处理。

(3)cDNA的合成

A、细胞裂解

冻融法裂解细胞：将装有单个细胞的PCR管置于液氮中冷冻2～4min，取出后转移至20～25℃水浴中放置2～4min，重复3次；再于3～5℃下离心1～3min，得到裂解的细胞液。

B、基因组DNA消化

将裂解的细胞液配制成10μl细胞基因组DNA酶解体系，其10μl细胞基因组DNA酶解体系的具体组成如表1所示，然后置于37℃下反应30min；加入0.5mol/L的EDTA(pH 8.0)1μl，终止反应；接着于65℃下孵育10min，再在3～5℃下3000rpm转速离心25～40s，备用。

表1 10μl细胞基因组DNA酶解体系的组成

试剂	使用量
		裂解的细胞溶液	xμl
DNase I(1U/μl)	1μl
		10×Reaction Buffer	1μl
RNase inhibitor(40U/μl)	0.25μl
		DEPC处理的去离子水	7.75-xμl

C、反转录合成cDNA

在上述步骤②得到的体系中加入10pmol/μl的Oligo(dT)₂₀1μl，65℃孵育5min，迅速冰浴1～3min，得变性后的RNA溶液；将变性后的RNA溶液配制成反转录反应液，反转录反应液的体积为20μl，其组成如表2所示。

表2 反转录反应液的组成

试剂	使用量
		5×RT Buffer	4μl
dNTP Mixture(各10mM)	2μl
		Rever Tra Ace反转录酶	1μl
DEPC处理的去离子水	1μl
		变性后的RNA溶液	12μl

反转录的反应条件为：42℃反转录合成20min；99℃变性5min；4℃保存5min，得到cDNA。

D、cDNA扩增复制

单个细胞含mRNA量约为1pg，由此反转录合成的cDNA量有限，不利于低丰度表达基因的检测，也不利于同时对多个基因进行检测。为解决这一问题，本发明采用多次退火环状循环扩增技术对cDNA进行扩增复制，具体采用单细胞全基因组扩增试剂盒(购于江苏亿康基因科技有限公司，货号YK001A/B)进行，操作如下：

取1μL cDNA，加入5μL Cell Lysis Buffer、0.1μL Cell Lysis Enzyme，混匀，得到体系I；

将体系I于PCR仪中50℃孵育50min，80℃孵育10min；然后加入30μL Pre-AmpBuffer、1μL Pre-Amp Enzyme Mix，混匀，得到体系II；

将体系II于PCR仪中94℃孵育3min；20℃孵育40s，30℃孵育40s，40℃孵育30s，50℃孵育30s，60℃孵育30s，70℃孵育4min，95℃孵育20s，58℃孵育10s，共8个循环(其8个循环为20℃孵育40s，30℃孵育40s，40℃孵育30s，50℃孵育30s，60℃孵育30s，70℃孵育4min，95℃孵育20s，58℃孵育10s共八个循环)；再加入30μL Amplification Buffer、0.8μL AmpEnzyme Mix，混匀，得到体系III；

将体系III于PCR仪中94℃孵育30s；94℃孵育20s，58℃孵育30s，72℃孵育3min，共18个循环(其18个循环为94℃孵育20s，58℃孵育30s，72℃孵育3min共18个循环)，产物纯化后于-20℃保存，得到cDNA模板；

(4)用SYBR Green染料法对基因表达水平定量检测

用SYBR Green染料法分别对肠系膜血管平滑肌细胞进行大电导钙激活钾通道(BKα)基因及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因进行检测。

A、引物设计：分别以Gene Bank中公布的BKα(NM_001014797.2)及GAPDH(NM_001289746.1)基因序列为模板，按照跨越不同外显子的原则设计实时定量PCR引物，序列如表3所示，由生工生物工程(上海)有限公司合成。上游引物和下游引物分别是指BKα基因的上游引物BKαF和下游引物BKαR以及GAPDH基因的上游引物GAPDH F和下游引物GAPDH R。

表3 基因引物序列

B、按表4所示配置Real time PCR反应液。

表4 Real time PCR反应体系

试剂	使用量
		SYBR Green PCR master mix	10μl
10μmol/l的上游引物	0.5μl
		10μmol/l的下游引物	0.5μl
cDNA模板	2μl
		无菌水	7μl

C、PCR反应程序如下：

①95℃预变性3min；

②94℃变性30sec；

③59℃退火30sec；

④72℃延伸30sec；

⑤78℃温浴1sec；

读板，步骤②至⑤重复44个循环；

72℃延伸10min；

生成熔解曲线，从65℃至98℃，每1℃持续1sec；

72℃延伸10min。

(5)数据处理

扩增后的PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。Ct值数据用2^-ΔΔCT的方法进行分析，用SPSS19.0进行统计学分析。

(6)检测结果

①BKα荧光定量PCR扩增结果

以合成的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应。图4为平滑肌细胞BKα基因PCR荧光曲线图。图5为平滑肌细胞BKα基因PCR熔解曲线图。图6为平滑肌细胞GAPDH基因PCR荧光曲线图。图7为平滑肌细胞GAPDH基因PCR熔解曲线图。结果显示，取自同一组织块的20个单细胞进行反转录及real-time PCR反应均扩增得到了BKα及GAPDH基因片段，阳性率为100％，各细胞CT值及△CT值如表5所示。BKα基因CT值为27.98±0.54，GAPDH基因CT值为30.79±0.29，△CT值为2.81±0.29，表明20个单细胞的重复性好，一致性高。

表5 cDNA扩增前Real-time PCR CT值

细胞编号	BKα CT	GAPDH CT	△CT
				1	28.06	30.76	2.70
2	28.19	30.84	2.65
				3	28.31	30.62	2.31
4	28.40	30.95	2.55
				5	28.59	31.27	2.68
6	28.07	30.79	2.72
				7	27.91	30.73	2.82
8	27.38	30.45	3.07
				9	28.40	31.00	2.60
10	28.80	31.40	2.60

11	27.56	30.48	2.92
				12	27.59	30.59	3.00
13	28.40	30.96	2.56
				14	28.46	31.16	2.70
15	27.00	30.40	3.40
				16	27.06	30.42	3.36
17	28.08	30.81	2.73
				18	27.94	30.75	2.81
19	28.41	31.03	2.62
				20	27.02	30.41	3.39
平均值	27.98±0.54	30.79±0.29	2.81±0.29

②cDNA扩增复制的检测结果

采用多次退火环状循环扩增技术对cDNA进行扩增复制，然后进行电泳检测。检测结果如图8所示。结果显示扩增复制后的cDNA条带亮度明显高于相同体积的扩增前cDNA，表明本发明采用的扩增复制方法能够有效提高cDNA量。

将上述扩增复制后的cDNA进行稀释10倍、100倍、1000倍，然后进行实时定量PCR扩增BKα基因。图9为平滑肌细胞cDNA扩增复制前后BKα基因PCR荧光曲线图，各细胞CT值如表6所示。结果显示，cDNA扩增复制后CT值明显降低，将扩增复制的cDNA稀释1000倍后CT值仍低于未扩增复制的cDNA，由此表明，本方法扩增复制后的cDNA浓度至少是扩增前的1000倍。

表6 cDNA扩增复制后PCR扩增BKα基因的CT值

注：A组为扩增复制后的cDNA；B组为A组cDNA稀释10倍；C组为A组cDNA稀释100倍；D组为A组cDNA稀释1000倍；E组为未经过扩增复制的cDNA。

综上，本发明的检测方法有效的增加了cDNA量，可满足更多个基因的同步检测，有效克服了单细胞的cDNA不适用于多基因同时检测及低拷贝基因检测的缺陷。

试验例1

本实验例同时采用冻融法、Trizol法和Triton X-100法裂解细胞，其他步骤同实施例1和实施例2，裂解后的细胞继续进行后续试验。

(1)实验方法

冻融法裂解细胞：将装有单个细胞的PCR管置于液氮中冷冻2min，取出后转移至25℃水中放置2min，重复3次，4℃下12000rpm转速离心1min。

Trizol法裂解细胞：在装有单个细胞的PCR管中分别加入1μl的Trizol，室温静止5min；加入0.5μl的Trizol，室温静止5min；加入0.5μl Trizol后再冻融。

Triton X-100法裂解细胞：在装有单个细胞的PCR管中分别加入1μl Triton X-100，室温静止5min；加入0.5μl Triton X-100，室温静止5min；加入0.5μl Triton X-100后再冻融。

(2)实验结果

本对比例同时采用trizol法、triton X-100法和冻融法裂解肠系膜动脉平滑肌细胞，裂解后的细胞经反转录后，扩增BKα基因片段，结果如图10和图11所示，表明用0.5μlTrizol、1μl Trizol以及加入0.5μl Trizol或1μl Trizol后再进行冻融的细胞都没有扩增得到BKα基因片段。

(3)实验讨论

Trizol含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，是一类强力的细胞破碎及蛋白质变性剂。Trizol处理后的细胞直接进行RT-PCR反应，同样可迅速破坏反应体系中反转录酶及DNA聚合酶的结构及活性，使反转录及PCR反应无法进行。

用0.5μl triton X-100及1μl triton X-100裂解的细胞以及冻融法裂解的细胞都能够检测到BKα基因片段的表达，其中triton X-100处理组BKα扩增产物总量明显低于冻融法处理组，同时CT值明显高于冻融法处理组。由此表明，triton X-100处理后的细胞PCR效率被明显抑制。

与其他处理因素相比，冻融法处理后的细胞实时定量PCR CT值最小，扩增产物DNA条带最亮。表明冻融法处理后的细胞PCR扩增效率较高。冻融法是利用热胀冷缩的原理使细胞膜胀破，DNA、RNA从细胞中释放出来，再加入DNase I处理使DNA降解，全过程在无RNase的环境中完成，保证了RNA不会被降解。冻融法未添加离子去垢剂、变性剂等影响DNA聚合酶活性的成分，PCR扩增效率不受影响，冻融法处理后细胞的PCR扩增效率最高。因此，本发明中所述的冻融法是最为安全、有效、简便、快速的单细胞裂解方法。

实验例2

本实验例为单细胞PCR扩增效率检测实验例。

(1)实验方法

使用8个肠系膜血管平滑肌单细胞进行实验，前续步骤与实施例1相同(即cDNA扩增复制之前的步骤均与实施例1相同)，每个单细胞均合成得到的cDNA体积为20μl，取2μlcDNA配制PCR反应体系，则PCR体系中含有1/10个细胞的cDNA。

PCR反应体系包括：cDNA 2μl；Ex Taq聚合酶(5U/μl)0.25μl；10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺Plus)5μl；dNTP Mixture(各2.5mM)4μl；上游引物BKαF 1μl，下游引物BKαR 1μl；去离子水36.75，总体积50μl。同时，将反转录合成的cDNA进行10ⁿ倍数稀释，分别取不同倍数稀释后的cDNA 2μl配制PCR反应体系，此时PCR体系中含有10^-(n+1)个细胞的cDNA。PCR反应体系包括：cDNA 2μl；Ex Taq聚合酶(5U/μl)0.25μl；10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺Plus)5μl；dNTPMixture(各2.5mM)4μl；上游引物BKαF 1μl，下游引物BKαR 1μl；去离子水36.75，总体积50μl。具体的cDNA稀释倍数、相对应的细胞数量及细胞编号如表7所示。

表7 cDNA模板稀释倍数及相应的细胞数量

编号	cDNA稀释倍数(10n)	细胞数量(10-(n+1))
			1,2	100	1/10
3,4	101	1/100
			5,6	102	1/1000
7,8	103	1/10000

(2)实验结果

以1、10、100、1000倍稀释cDNA，用不同倍数稀释的cDNA为模板PCR扩增BKα基因。结果如图12所示，随着稀释倍数的增加，扩增的BKαDNA数量逐渐减少，cDNA模板稀释1000倍后仍然能扩增到BKα基因片段。

(3)实验讨论

单个细胞mRNA含量极低，这是单细胞RT-PCR区别于常规组织样品RT-PCR的明显特征，更是单细胞RT-PCR的关键问题及技术难点。本发明将单个细胞反转录的cDNA以10ⁿ倍数逐级稀释，当稀释至1000倍，即PCR体系中含有1/10000个细胞的cDNA时，PCR反应仍然可以扩增到目的基因。由此表明，本发明所述对cDNA进行全部复制的方法完全能够克服单细胞RNA含量极低的缺陷，具有极高的灵敏度及精确度，完全适用于单个细胞甚至更少cDNA模板的PCR扩增实验。

对比例1负压抽吸法捕获单细胞

(1)细胞的分离

细胞的分离方法同实施例1中步骤(1)。

(2)电极准备

拉制电极的毛细玻璃管(如：Hematocrit Tubes，Drummond，U.S.A.)长度为75mm，先经过180℃干烤6h后再用于拉制电极，任意拉制机都可以用于电极拉制。为了能够将完整的单个细胞吸入，电极尖端口径略大于细胞直径，约10～15μm。本实验使用日本PC-10(NARISHIGE公司)垂直微管电极拉制仪。电极经两步拉制，经过一次粗拉使玻璃管中间拉成一窄细状，第二次拉制使窄细部位断开。首先设定电极两步拉制参数:第一步为电流59mA，第二步电流为54mA；然后将制备电极的毛细玻璃管固定于PC-10垂直微管电极拉制仪上。经过两步拉制后将电极尖端进行打磨，使打磨后的电极尖端直径约为10μm，充灌电极液后电极阻抗为500-600KΩ。

(3)细胞收集

电极略加正压后放入细胞浴液中，入水前不冲灌电极液。借助倒置相差显微镜，利用微推进器，控制微管电极靠近细胞，电极应顺着细胞的纵长方向接触细胞，施加负压将细胞吸入电极后立刻停止负压。迅速利用推进器的粗调将电极提出液面。将电极深入到无RNA酶的PCR管底，给电极内施以正压，将细胞及液体全部注入管内，最后在PCR管侧壁折断电极前端，以保证取到的细胞被置入管中，迅速冷冻。

(4)实验结果

用上述负压抽吸法捕获了10个单细胞，其中有8个细胞在负压吸取时，细胞浴液充满了整个玻璃微管电极。用玻璃微管电极捕获单个细胞的方法是借助于细胞膜片钳系统完成的，因此，单细胞的捕获必须在不损坏膜片钳系统的基础上完成。

在细胞膜片钳实验中，电极夹持器是连接探头与玻璃微管电极的桥梁，它必须具备机械稳定性与低噪声的特点，才能保证良好的封接并记录到低噪声的离子通道电流。电极夹持器多由于电极内液体从电极尾端漏出或被负压吸出而被污染，从而导致噪声增大，影响正常的离子通道电流记录。

根据细胞膜片钳技术操作规则，在灌注电极内液时，一定要尽量保持玻璃微管电极尾端不能沾有电极内液，如沾有电极内液，一定要清理干净后再将电极插入电极夹持器中；另外，当电极尖端过大或折断时，不要给予负压吸引，防止电极内液被吸入夹持器，导致噪声增大，影响离子通道电流记录。

在上述实验结果中，负压抽吸的10个细胞中有8个在吸取时液体灌满电极。因此，负压抽吸法捕获单细胞违反了细胞膜片钳技术的操作规则，将对膜片钳系统的稳定性和灵敏性造成损坏。表明本发明所述的细胞捕获方法显著优于负压抽吸法捕获单细胞。

实施例2

本发明所述的单细胞实时荧光定量PCR试剂盒，其试剂盒中包含：玻璃微电极，所述电极尖端直径为0.8～1.2μm，充灌电极液后电极阻抗为3～5MΩ；DNase I,RNase-free1U/μl；10×DNaseI Reaction Buffer；0.5mol/l的EDTA，所述EDTA的pH为8.0；10pmol/μl的Oligo(dT)₂₀；5×RT Buffer；dNTP Mixture；Rever Tra Ace反转录酶；DEPC水；Cell LysisBuffer；Cell Lysis Enzyme；Pre-Amp Buffer；Pre-Amp Enzyme Mix；AmplificationBuffer；Amp Enzyme Mix；SYBR Green PCR master mix；10μmol/l的上游引物，10μmol/l的下游引物；cDNA模板2μl；无菌水。

<110> 四川医科大学

<120> 一种单细胞实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒

<160> 4

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 1

ccatttgcgg acttaggg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 2

aactcatagg gcgggttg 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 3

gagtccactg gcgtcttca 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：引物

<400> 4

tcttgaggct gttgtcatac ttc 23

Claims (7)

1.一种单细胞实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)单细胞捕获

A、细胞准备

将细胞悬液滴于浴槽中让其自然贴附，静置8～15min后，加入台式液备用；

B、电极准备

拉制电极的毛细玻璃管先经150～200℃干烤4～8h后再用于拉制电极；将制备电极的毛细玻璃管固定于垂直微管电极拉制仪上；电极经两步拉制，第一步中电流为55～65mA，粗拉使毛细玻璃管中间拉成一窄细状，第二步中电流为50～60mA，拉制使窄细部位断开；

C、细胞收集

借助倒置相差显微镜，利用微推进器，控制微管电极进入浴槽溶液并靠近细胞，利用微推进器接触浴槽底部将电极尖端折断，再利用微推进器将折断尖端的电极顺着细胞的纵长方向靠近细胞，让细胞顺势滑入电极；迅速将电极提出液面，深入到收集细胞的无RNase的PCR管底部，将电极内的细胞连带液体全部推入管内，最后在PCR管侧壁折断电极前端，迅速冷冻；

(2)cDNA的合成

A、细胞裂解

采用冻融法裂解细胞，得到裂解的细胞液；

B、基因组DNA消化

将裂解的细胞液配制成10μl的细胞基因组DNA酶解体系，置于37℃下反应30min，然后加入0.5mol/l的EDTA 1μl，终止反应，其中EDTA的pH为8.0；接着于65℃下孵育10min，再在3～5℃下离心25～40s，备用；

C、反转录合成cDNA

在上述步骤(2)B项得到的体系中加入10pmol/μl的Oligo(dT)₂₀ 1μl，65℃孵育5min，冰浴1～3min，得变性后的RNA溶液；将变性后的RNA溶液12μl、5×RT Buffer 4μl、dNTPMixture 2μl、Rever Tra Ace反转录酶1μl和DEPC处理的去离子水1μl混合，配制成反转录反应液；反转录的反应条件为42℃反转录合成20min，99℃变性5min，4℃保存5min，得到cDNA；

D、cDNA扩增

取1μL cDNA，加入5μL Cell Lysis Buffer、0.1μL Cell Lysis Enzyme，混匀，得到体系I，将体系I于PCR仪中50℃孵育50min，80℃孵育10min；然后加入30μL Pre-Amp Buffer、1μL Pre-Amp Enzyme Mix，混匀，得到体系II；

将体系II于PCR仪中94℃孵育3min；20℃孵育40s，30℃孵育40s，40℃孵育30s，50℃孵育30s，60℃孵育30s，70℃孵育4min，95℃孵育20s，58℃孵育10s，共8个循环；再加入30μLAmplification Buffer、0.8μL Amp Enzyme Mix，混匀，得到体系III；

将体系III于PCR仪中94℃孵育30s；94℃孵育20s，58℃孵育30s，72℃孵育3min，共18个循环；产物纯化后于-20℃保存，得到cDNA模板；

(3)用SYBR Green染料法对基因表达水平定量检测

将SYBR Green PCR master mix 10μl、10μmol/l的上游引物0.5μl、10μmol/l的下游引物0.5μl、cDNA模板2μl、无菌水7μl混合均匀，得到Real time PCR反应体系；

PCR反应程序如下：

①95℃预变性3min；

②94℃变性30sec；

③59℃退火30sec；

④72℃延伸30sec；

⑤78℃温浴1sec；

读板，步骤②至⑤重复44个循环；

72℃延伸10min；

生成熔解曲线，从65℃至98℃，每1℃持续1sec；

72℃延伸10min。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中毛细玻璃管的长度为70～80mm，经两步控制后电极尖端直径为0.8～1.2μm。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中所使用的器械、容器及溶液均做RNA酶灭活处理。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)A项中冻融法裂解细胞的方法为：将装有单个细胞的PCR管置于液氮中冷冻2～4min，取出后转移至20～25℃水浴中放置2～4min，重复3次；再于3～5℃下离心1～3min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)B项中10μl的细胞基因组DNA酶解体系包括1U/μl的DNase I 1μl，10×Reaction Buffer 1μl，40U/μl的RNaseinhibitor 0.25μl，余量为DEPC处理的去离子水和裂解的细胞液。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中上游引物和下游引物的序列如下：

上游引物P1的序列为SEQ ID NO.1，下游引物P2的序列为SEQ ID NO.2；或者上游引物P1的序列为SEQ ID NO.3，下游引物P2的序列为SEQ ID NO.4。

7.一种单细胞实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，试剂盒中包含：玻璃微电极，所述电极尖端直径为0.8～1.2μm，充灌电极液后电极阻抗为3～5MΩ；DNase I,RNase-free 1U/μl；10×DNaseI Reaction Buffer；0.5mol/l的EDTA，所述EDTA的pH为8.0；10pmol/μl的Oligo(dT)₂₀；5×RT Buffer；dNTP Mixture；Rever Tra Ace反转录酶；DEPC水；Cell LysisBuffer；Cell Lysis Enzyme；Pre-Amp Buffer；Pre-Amp Enzyme Mix；AmplificationBuffer；Amp Enzyme Mix；SYBR Green PCR master mix；10μmol/l的上游引物，10μmol/l的下游引物；cDNA模板2μl；无菌水。