CN108977434A

CN108977434A - 鼻腔脱落细胞rna的提取方法

Info

Publication number: CN108977434A
Application number: CN201810719347.XA
Authority: CN
Inventors: 张罗; 王成硕; 闫冰; 杨军
Original assignee: Beijing Institute Of Otorhinolaryngology; Beijing Tongren Hospital
Current assignee: Beijing Institute Of Otorhinolaryngology; Beijing Tongren Hospital
Priority date: 2018-07-03
Filing date: 2018-07-03
Publication date: 2018-12-11

Abstract

本发明提出一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，包括以下步骤：获取鼻腔脱落细胞，将所述鼻腔脱落细胞加入RNA抽提液中，混合后加入第一溶剂混合，震荡均匀后静置，经第一次离心处理得上清液，取上清液加入第二溶剂混合，经第二次离心处理后保留第一沉淀，取第一沉淀继续加入第三溶剂混合，经第三次离心处理后保留第二沉淀，再经第四次离心处理保留沉淀，加入去RNA酶及去DNA酶的水溶解沉淀后得到RNA。本发明提供的采用鼻息肉脱落细胞获取RNA的方法，构建了一个新的检测方法，避免进行病理活检，因此可以在不同随访阶段取样，进行患者病程追踪，提供了一种无创的方法获得患者鼻腔上皮细胞，避免了患者的感染风险。

Description

鼻腔脱落细胞RNA的提取方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及鼻腔脱落细胞RNA的提取方法。

背景技术

慢性鼻窦炎伴鼻息肉(Chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)是鼻窦黏膜的慢性炎症，查体可见鼻腔或中鼻道息肉形成。CRSwNP常见症状为鼻堵、流涕或鼻涕倒流、嗅觉减退、面部闷胀感或压力感，持续时间超过12周。患病率约为0.5-4％，CRSwNP常伴有哮喘和过敏性鼻炎，有报道7％的哮喘患者患有CRSwNP,而26-48％的CRSwNP患有哮喘。CRSwNP发病机制目前还不确定，黏膜上皮细胞破坏、宿主免疫系统失衡和病原微生物入侵可能是其发病的主要原因。CRSwNP主要的治疗方式是手术和药物治疗。但研究表明，即使通过规范的药物或手术治疗，慢性鼻窦炎伴鼻息肉的复发率仍高达56％，严重影响患者生活质量，同时带来高额医疗支出，但临床却缺乏根治性治疗方法，因而成为鼻科学研究领域的重点。

依据嗜酸性粒细胞浸润的程度可以将CRSwNP分为嗜酸性粒细胞型(EosinophilicCRSwNP,ECRSwNP)与非嗜酸性粒细胞型(Noneosinophilic CRSwNP,nonECRSwNP)，二者的临床表现、用药和预后均不同，嗜酸性粒细胞型的临床症状较重，以鼻堵和嗅觉减退为主，多合并有哮喘，术后复发率较高。鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞浸润程度与复发关系最为密切，当组织中该细胞百分比超过27％时，复发风险超过90％。嗜酸性粒细胞型息肉对糖皮质激素类药物的敏感度显著高于非嗜酸性粒细胞型。非嗜酸性粒细胞型临床症状一般较轻，且合并哮喘的几率较小，气道炎症较轻，且术后复发率较嗜酸性粒细胞型低，对大环内酯类药物治疗反应好。西方国家以嗜酸性粒细胞型为主，主要表现为TH2炎症反应，而我国的嗜酸性粒细胞型和非嗜酸性粒细胞型比例均约占一半，主要表现为TH1/TH17炎症反应为主。综上所述，嗜酸性粒细胞型和非嗜酸性粒细胞型在免疫病理类型、临床症状、药物治疗反应和预后存在明显不同。不同慢性鼻窦炎伴鼻息肉的炎症/病理分型治疗策略不同。所以对慢性鼻窦炎伴鼻息肉的病理分型的鉴定显得尤为重要。

目前对两种亚型的判断主要依据鼻腔黏膜活检后组织病理标本染色，缺乏无创性生物学标志物用于鉴别诊断。患者在鼻内镜下获得息肉标本后，进行石蜡固定等病理标本的常规处理，然后进行苏木素伊红的染色，接下来通过高倍显微镜观察组织浸润的炎细胞(主要的炎细胞包括嗜酸性粒细胞，中性粒细胞，淋巴细胞，浆细胞)浸润个数，进行细胞分型。然而现有的该方法存在以下问题：该方式为有创检查，增加了患者的感染风险，不适用于免疫力较低人群如儿童、老年人等；而取材时鼻腔出血，往往引起患者恐惧和担忧；另外通过该方法难以获得疾病的实时动态变化信息：不能在术后对愈合期黏膜进行病理活检。但临床数据表明慢性鼻窦炎伴鼻息肉的病理分类会随药物治疗、手术治疗等转归，用治疗前的病理活检结果无法代表全部疾病时期的特征；同时组织病理切片较局限，只能反映切片位置的标本炎症状态，不能反映组织的全貌，可能会造成误诊，而且每张片子都需要病理科医生人工计数，难以批量操作。

近年兴起的实时荧光定量PCR弥补了上述技术的不足。该方法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，最后根据荧光信号对所测DNA样品进行定量分析，该方法操作简便，敏感性高，重复性好且结果准确性高。然而现有技术中尚未筛选得到有效检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的基因，且进一步的更未公开有效提供检测判断伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的基因的提取方法的相关步骤。由此针对本领域中，获取基于实时荧光定量PCR检测伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的方法研究无法突破，且存在较大的阻碍。而在建立荧光定量PCR方法时，针对RNA的提取步骤至关重要，由此可见，能否提供一种针对鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，使其能够作为建立判断伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎亚型的荧光定量PCR方法的基础，且操作便捷，重复性好，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明针对上述的技术问题，提出一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，获取鼻腔脱落细胞，将所述鼻腔脱落细胞加入RNA抽提液中，混合后加入第一溶剂混合，震荡均匀后静置，经第一次离心处理得上清液，取所述上清液加入第二溶剂混合，经第二次离心处理后保留第一沉淀，取所述第一沉淀继续加入第三溶剂混合，经第三次离心处理后保留第二沉淀，再经第四次离心处理保留沉淀，加入去RNA酶及去DNA酶的水溶解沉淀后得到RNA。

作为优选，通过刷取或粘取鼻息肉表面获取鼻腔脱落细胞。

作为优选，采用毛刷于鼻息肉表面按压20～40s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，获取得到鼻腔脱落细胞。

作为优选，所述RNA抽提液为Trizol、RNAiso Blood、RNAiso Plus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍和β-巯基乙醇中的任一种或几种的试剂。

作为优选，所述第一溶剂为氯仿；所述第二溶剂为异丙醇；所述第三溶剂为浓度65％～90％的乙醇。

作为优选，所述RNA抽提液的添加量为0.1～20mL。

作为优选，所述第一溶剂的添加量为40μL～5mL；所述第二溶剂的添加量与第一次离心处理得到的所述上清液的体积相等；所述第三溶剂的添加量与所述第二溶剂体积相等；取所述上清液的体积为40μL～8mL。

作为优选，所述第一次离心处理的条件为经静置3～7min后，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；所述第二次离心处理的条件为经静置8～12min后，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；所述第三次离心处理的条件为于3℃～5℃，7000～14000r/min离心10～20min；所述第四次离心处理的条件为于3℃～5℃，7000～14000r/min离心1～3min，除去上清液后静置10～20min。

作为优选，具体包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入0.1～20mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置3～7min；加入40μL～5mL氯仿，震荡混匀，室温静置3～7min，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；取上清液40μL～8mL，加入等体积的异丙醇，混匀后静置8～12min，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度65％～90％的乙醇，于3℃～5℃，7000～14000r/min离心1～3min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于3℃～5℃，7000～14000r/min离心1～3min，除去上清液，静置10～20min后继续向所述离心管中加入10～100μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。

作为优选，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。

作为更优选，具体包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入1mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置5min；加入200μL氯仿，震荡混匀，室温静置5min，于4℃，12000r/min离心15min；取上清液200μL，加入200μL异丙醇，混匀后静置10min，于4℃，12000r/min离心15min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度75％的乙醇，于4℃，7500r/min离心15min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于4℃，7500r/min离心2min，除去上清液，静置15min后继续向所述离心管中加入50μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为1.8，得到RNA。

作为优选，所述鼻腔脱落细胞RNA为鼻腔脱落细胞中用于判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因的RNA；所述判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因为CLC基因、ALOX15基因、CST1基因或SAA2基因。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1、本发明提供的鼻腔脱落细胞中RNA的提取方法，构建了一个新的鼻腔细胞的RNA提取方法，避免进行病理活检，因此可以在不同随访阶段取样，进行患者病程追踪，提供了一种无创的方法获得患者鼻腔上皮细胞，避免了患者的感染风险，且使最终获取的RNA纯度高，有利于RNA的保护，适宜针对鼻息肉脱落细胞进行RNA提取的操作，且成本较低便于操作。

2、本发明提供的鼻腔脱落细胞中RNA的提取方法，能够有效的在微量鼻息肉脱落细胞中提取得到RNA，为后续定量检测判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因提供了基础和保障，且本发明所提供的提取方法简单快捷，重复性好，适宜在科学研究领域广泛推广应用。

3、本发明提供的采用鼻息肉脱落细胞获取RNA的方法，为日后针对慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的检测基因筛选技术提供了基础，可适用于判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因的RNA的提取，为临床指导和药物治疗提供了可靠的基础。保证了用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒在临床应用的可行性。

4、本发明采用鼻息肉脱落细胞获取RNA的方法，通过采用刷取或粘取的方式从鼻息肉的表面获取鼻息肉细胞来提取获得RNA，以便于为确定患者的慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的研究提供基础和保障，避免了对患者造成创面，提高了患者检查的安全性，且操作更便捷，节约了人力成本。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，获取鼻腔脱落细胞，将所述鼻腔脱落细胞加入RNA抽提液中，混合后加入第一溶剂混合，震荡均匀后静置，经第一次离心处理得上清液，取所述上清液加入第二溶剂混合，经第二次离心处理后保留第一沉淀，取所述第一沉淀继续加入第三溶剂混合，经第三次离心处理后保留第二沉淀，再经第四次离心处理保留沉淀，加入去RNA酶及去DNA酶的水溶解沉淀后得到RNA。

在一可选实施例中，通过刷取或粘取鼻息肉表面获取鼻腔脱落细胞。本发明的方法基于该种方式避免了对患者造成创面，提高了患者检查的安全性，且操作更便捷，节约了人力成本。

在一可选实施例中，采用毛刷于鼻息肉表面按压20～40s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，获取得到鼻腔脱落细胞。采用上述限定方法，在操作时效果最佳，通过最简便的方式有效的获取到鼻息肉脱落细胞。满足鼻腔脱落细胞RNA的提取方法的需求。

在一可选实施例中，所述RNA抽提液为Trizol、RNAiso Blood、RNAiso Plus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍和β-巯基乙醇中的任一种或几种的试剂。在筛选得到的上述RNA，针对鼻腔脱落细胞的RNA提取效果最佳。其中的Trizol、RNAisoBlood和RNAiso Plus均为本领域中常规使用的RNA抽提液的商品名称。

在一可选实施例中，所述第一溶剂为氯仿；所述第二溶剂为异丙醇；所示第三溶剂为浓度65％～90％的乙醇。其中所述氯仿使有机相和无机相分离，从而使蛋白和RNA分离，异丙醇可用于沉淀RNA，乙醇可用于清洗异丙醇(不易挥发的醇类)，而乙醇较易挥发，从而得到不含醇类污染的高纯度RNA。

在一可选实施例中，所述RNA抽提液的添加量为0.1～20mL。

在一可选实施例中，所述第一溶剂的添加量为40μL～5mL；所述第二溶剂的添加量与第一次离心处理得到的所述上清液的体积相等；所述第三溶剂的添加量与所述第二溶剂体积相等；取所述上清液的体积为40μL～8mL。

在一可选实施例中，所述第一次离心处理的条件为经静置3～7min后，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；所述第二次离心处理的条件为经静置8～12min后，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；所述第三次离心处理的条件为于3℃～5℃，7000～14000r/min离心10～20min；所述第四次离心处理的条件为于3℃～5℃，7000～14000r/min离心1～3min，除去上清液后静置10～20min。

在一可选实施例中，具体包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入0.1～20mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置3～7min；加入40μL～5mL氯仿，震荡混匀，室温静置3～7min，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；取上清液40μL～8mL，加入等体积的异丙醇，混匀后静置8～12min，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度65％～90％的乙醇，于3℃～5℃，7000～14000r/min离心1～3min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于3℃～5℃，7000～14000r/min离心1～3min，除去上清液，静置10～20min后继续向所述离心管中加入10～100μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。

在一可选实施例中，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到高纯度RNA。

在一可选实施例中，具体包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入1mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置5min；加入200μL氯仿，震荡混匀，室温静置5min，于4℃，12000r/min离心15min；取上清液200μL，加入200μL异丙醇，混匀后静置10min，于4℃，12000r/min离心15min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度75％的乙醇，于4℃，7500r/min离心15min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于4℃，7500r/min离心2min，除去上清液，静置15min后继续向所述离心管中加入50μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA纯度为1.8，得到RNA。

在一可选实施例中，所述鼻腔脱落细胞RNA为鼻腔脱落细胞中用于判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因的RNA；所述判断慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的基因为CLC基因、ALOX15基因、CST1基因或SAA2基因。

针对CLC基因为已知基因，基因ID为1178，其DNA序列如SEQIDNO:1所示，基因NM号为001828.5；针对CST1基因为已知基因，基因ID为1469，其DNA序列如SEQIDNO:2所示，基因NM号为001898.2；针对ALOX15基因，基因ID为246，其DNA序列如SEQIDNO:3所示，基因NM号为001140.4；针对SAA2基因，基因ID为6289，DNA序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示，DNA序列如SEQIDNO:4所示的基因NM号为001127380.2，DNA序列如SEQIDNO:5所示的基因NM号为030754.4。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1：

样本的收集与处理：

某患者用生理盐水冲洗鼻腔后，在鼻内镜下用毛刷(Copan公司产)于鼻息肉表面按压30s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，将毛刷置于由细胞裂解液，4℃短期保存(不超过24小时)，或转移入低于-20℃长期保存。

一种鼻腔脱落细胞中RNA的提取方法，包括以下步骤：

向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入0.1mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置3min；加入40μL氯仿，震荡混匀，室温静置3min，于3℃，10000r/min离心10min；取上清液40μL，加入等体积的异丙醇，混匀后静置8min，于3℃，10000r/min离心10min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度65％的乙醇，于3℃，7000r/min离心1min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于3℃，7000r/min离心1～3min，除去上清液，静置10min后继续向所述离心管中加入10μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为1.7，得到RNA。

实施例2：

样本的收集与处理：

一种鼻腔脱落细胞中RNA的提取方法，包括以下步骤：

向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入1mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置5min；加入200μL氯仿，震荡混匀，室温静置5min，于4℃，12000r/min离心15min；取上清液200μL，加入200μL异丙醇，混匀后静置10min，于4℃，12000r/min离心15min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度75％的乙醇，于4℃，7500r/min离心15min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于4℃，7500r/min离心2min，除去上清液，静置15min后继续向所述离心管中加入50μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为1.8，得到RNA。

实施例3：

样本的收集与处理：

一种鼻腔脱落细胞中RNA的提取方法，包括以下步骤：

向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入20mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置7min；加入4mL氯仿，震荡混匀，室温静置7min，于5℃，14000r/min离心20min；取上清液5mL，加入等体积的异丙醇，混匀后静置12min，于5℃，14000r/min离心20min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度90％的乙醇，于5℃，14000r/min离心3min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧所述离心管，于5℃，14000r/min离心3min，除去上清液，静置20min后继续向所述离心管中加入100μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为2.1，得到RNA。

上述中实施例2为优选实施例，在该方法的限定条件内，可适用于1.5mL离心管，使得该体系能够一次完成，如果更大体积，可能需要多个平行离心管或更大体积离心管，大体积高转速离心管对设备要求和离心管材质要求都高于1.5mL离心管。实施例2具有成本低，提取RNA纯度高的优点。

鼻腔脱落细胞RNA的提取方法本发明提供的采用鼻息肉脱落细胞获取RNA的方法，为日后针对慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的检测基因筛选技术提供了基础，为临床指导和药物治疗提供了可靠的基础。保证了用于检测慢性鼻窦炎伴鼻息肉亚型的试剂盒在临床应用的可行性。

序列表

<110> 张罗

王成硕

闫冰

杨军

北京市耳鼻咽喉科研究所

首都医科大学附属北京同仁医院

<120> 鼻腔脱落细胞RNA的提取方法

<130> CC18K10086CCN

<141> 2018-07-03

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 649

<212> DNA

<213> human

<400> 1

catttaaatt ctgcagctca gagattcaca cagaagtctg gacacaattc agaagagcca 60

cccagaagga gacaacaatg tccctgctac ccgtgccata cacagaggct gcctctttgt 120

ctactggttc tactgtgaca atcaaagggc gaccacttgc ctgtttcttg aatgaaccat 180

atctgcaggt ggatttccac actgagatga aggaggaatc agacattgtc ttccatttcc 240

aagtgtgctt tggtcgtcgt gtggtcatga acagccgtga gtatggggcc tggaagcagc 300

aggtggaatc caagaatatg ccctttcagg atggccaaga atttgaactg agcatctcag 360

tgctgccaga taagtaccag gtaatggtca atggccaatc ctcttacacc tttgaccata 420

gaatcaagcc tgaggctgtg aagatggtgc aagtgtggag agatatctcc ctgaccaaat 480

ttaatgtcag ctatttaaag agataaccag acttcatgtt gccaaggaat ccctgtctct 540

acgtgaactt gggattccaa agccagctaa cagcatgatc ttttctcact tcaatcctta 600

ctcctgctca ttaaaactta atcaaacttc acaaaaaaaa aaaaaaaaa 649

<210> 2

<211> 782

<212> DNA

<213> human

<400> 2

gggctccctg cctcgggctc tcaccctcct ctcctgcagc tccagctttg tgctctgcct 60

ctgaggagac catggcccag tatctgagta ccctgctgct cctgctggcc accctagctg 120

tggccctggc ctggagcccc aaggaggagg ataggataat cccgggtggc atctataacg 180

cagacctcaa tgatgagtgg gtacagcgtg cccttcactt cgccatcagc gagtataaca 240

aggccaccaa agatgactac tacagacgtc cgctgcgggt actaagagcc aggcaacaga 300

ccgttggggg ggtgaattac ttcttcgacg tagaggtggg ccgcaccata tgtaccaagt 360

cccagcccaa cttggacacc tgtgccttcc atgaacagcc agaactgcag aagaaacagt 420

tgtgctcttt cgagatctac gaagttccct gggagaacag aaggtccctg gtgaaatcca 480

ggtgtcaaga atcctaggga tctgtgccag gccattcgca ccagccacca cccactccca 540

ccccctgtag tgctcccacc cctggactgg tggcccccac cctgcgggag gcctccccat 600

gtgcctgcgc caagagacag acagagaagg ctgcaggagt cctttgttgc tcagcagggc 660

gctctgccct ccctccttcc ttcttgcttc taatagccct ggtacatggt acacaccccc 720

ccacctcctg caattaaaca gtagcatcgc ctccctctga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780

aa 782

<210> 3

<211> 2715

<212> DNA

<213> human

<400> 3

gagcgaaaca tctttgagca agatgggtct ctaccgcatc cgcgtgtcca ctggggcctc 60

gctctatgcc ggttccaaca accaggtgca gctgtggctg gtcggccagc acggggaggc 120

ggcgctcggg aagcgactgt ggcccgcacg gggcaaggag acagaactca aggtggaagt 180

accggagtat ctggggccgc tgctgtttgt gaaactgcgc aaacggcacc tccttaagga 240

cgacgcctgg ttctgcaact ggatctctgt gcagggcccc ggagccgggg acgaggtcag 300

gttcccttgt taccgctggg tggagggcaa cggcgtcctg agcctgcctg aaggcaccgg 360

ccgcactgtg ggcgaggacc ctcagggcct gttccagaaa caccgggaag aagagctgga 420

agagagaagg aagttgtacc ggtggggaaa ctggaaggac gggttaattc tgaatatggc 480

tggggccaaa ctatatgacc tccctgtgga tgagcgattt ctggaagaca agagagttga 540

ctttgaggtt tcgctggcca aggggctggc cgacctcgct atcaaagact ctctaaatgt 600

tctgacttgc tggaaggatc tagatgactt caaccggatt ttctggtgtg gtcagagcaa 660

gctggctgag cgcgtgcggg actcctggaa ggaagatgcc ttatttgggt accagtttct 720

taatggcgcc aaccccgtgg tgctgaggcg ctctgctcac cttcctgctc gcctagtgtt 780

ccctccaggc atggaggaac tgcaggccca gctggagaag gagctggagg gaggcacact 840

gttcgaagct gacttctccc tgctggatgg gatcaaggcc aacgtcattc tctgtagcca 900

gcagcacctg gctgcccctc tagtcatgct gaaattgcag cctgatggga aactcttgcc 960

catggtcatc cagctccagc tgccccgcac aggatcccca ccacctcccc ttttcttgcc 1020

tacggatccc ccaatggcct ggcttctggc caaatgctgg gtgcgcagct ctgacttcca 1080

gctccatgag ctgcagtctc atcttctgag gggacacttg atggctgagg tcattgttgt 1140

ggccaccatg aggtgcctgc cgtcgataca tcctatcttc aagcttataa ttccccacct 1200

gcgatacacc ctggaaatta acgtccgggc caggactggg ctggtctctg acatgggaat 1260

tttcgaccag ataatgagca ctggtggggg aggccacgtg cagctgctca agcaagctgg 1320

agccttccta acctacagct ccttctgtcc ccctgatgac ttggccgacc gggggctcct 1380

gggagtgaag tcttccttct atgcccaaga tgcgctgcgg ctctgggaaa tcatctatcg 1440

gtatgtggaa ggaatcgtga gtctccacta taagacagac gtggctgtga aagacgaccc 1500

agagctgcag acctggtgtc gagagatcac tgaaatcggg ctgcaagggg cccaggaccg 1560

agggtttcct gtctctttac aggctcggga ccaggtttgc cactttgtca ccatgtgtat 1620

cttcacctgc accggccaac acgcctctgt gcacctgggc cagctggact ggtactcttg 1680

ggtgcctaat gcaccctgca cgatgcggct gcccccgcca accaccaagg atgcaacgct 1740

ggagacagtg atggcgacac tgcccaactt ccaccaggct tctctccaga tgtccatcac 1800

ttggcagctg ggcagacgcc agcccgttat ggtggctgtg ggccagcatg aggaggagta 1860

tttttcgggc cctgagccta aggctgtgct gaagaagttc agggaggagc tggctgccct 1920

ggataaggaa attgagatcc ggaatgcaaa gctggacatg ccctacgagt acctgcggcc 1980

cagcgtggtg gaaaacagtg tggccatcta agcgtcgcca ccctttggtt atttcagccc 2040

ccatcaccca agccacaagc tgaccccttc gtggttatag ccctgccctc ccaagtccca 2100

ccctcttccc atgtcccacc ctccctagag gggcaccttt tcatggtctc tgcacccagt 2160

gaacacattt tactctagag gcatcacctg ggaccttact cctctttcct tccttcctcc 2220

tttcctatct tccttcctct ctctcttcct ctttcttcat tcagatctat atggcaaata 2280

gccacaatta tataaatcat ttcaagacta gaataggggg atataataca tattactcca 2340

caccttttat gaatcaaata tgattttttt gttgttgtta agacagagtc tcactttgac 2400

acccaggctg gagtgcagtg gtgccatcac cacggctcac tgcagcctca gcgtcctggg 2460

ctcaaatgat cctcccacct cagcctcctg agtagctggg actacaggct catgccatca 2520

tgcccagcta atattttttt attttcgtgg agacggggcc tcactatgtt gcctaggctg 2580

gaaataggat tttgaaccca aattgagttt aacaataata aaaagttgtt ttacgctaaa 2640

gatggaaaag aactaggact gaactatttt aaataaaata ttggcaaaag aaaaaaaaaa 2700

aaaaaaaaaa aaaaa 2715

<210> 4

<211> 2053

<212> DNA

<213> human

<400> 4

aggctcacta taaatagcag ccacctctcc ctggcagaca gggacccgca gctcagctac 60

agcacagatc agcaccatga agcttctcac gggcctggtt ttctgctcct tggtcctgag 120

tgtcagcagc cgaagcttct tttcgttcct tggcgaggct tttgatgggg ctcgggacat 180

gtggagagcc tactctgaca tgagagaagc caattacatc ggctcagaca aatacttcca 240

tgctcggggg aactatgatg ctgccaaaag gggacctggg ggtgcctggg ctgcagaagt 300

gatcagttta ttttcagctg aactgtagag agtgaaggaa gaagcctttt ttcttcactc 360

ctacatgacc caggcattga tccaggcaat gaagattcag tgtaaataac caccactaac 420

aagaccatgg cctttggaac ctgtgctaag aggcatggat gagctccctc agcatgtgga 480

tggagactga agagaggtct gaaggctcag tgtggtgtct ccattctcta agaagtttgg 540

aggagaagct ggatacagca aaacagactg agaaggagca gctgttggga aaggaggaaa 600

actaggaaag catggtgttc cagaatccct gatggagata ttgattagta gtatcagatt 660

ctgcttagca gttgaggagt tcacctttgg cttaagcaac atggagtcat tgactatctc 720

gtgaaggtgg ttgcaggaga aggtctggag aactaaatgg agcagtgata agagagaatg 780

ggagatggta tgataggact cctggacacc ccagacatca atcaaaacac cacagacaag 840

aaggtgtgga tacaaaaact agcagttaga agaaataata gaaaatgaac tccaactact 900

tctgaaaaaa aagtaatgag ggcaattaat acattgaaga aagcctcaat aagtacaaca 960

gtgtagtact gacttatata tagaaaaaac ctgatcagtg gaaccaaatc ctcagaatta 1020

gacataagtg catatgagaa ttttgtatgt gataaaggtt gtatgttaac gtattaagta 1080

aaagacggac tattcaacaa atgggattgg tacaactggg tgaccatcta aaataacatc 1140

atgttgaaaa catactgtat atattacggt aggacaaatt ccaaatatgc taaatattta 1200

taaacaaata aggaaaatga taataataat attaacatta tctggtgaat ccatggaaaa 1260

ttcttttata gcccaaagta gggaaagctg caacaacaag gatggaactg gaggtcatta 1320

tgctaagtga aatcattcag gaacagaaag acaaacatca catgttctca cttatttgtg 1380

ggatctaaaa atcaaaacaa ttgaattcat ggagatagag aatagaagga tggttaccag 1440

aggctgggaa gggtagtggg gaggggggga gtgaggggag gtgaggatgg ttaatgagta 1500

ccaaaaaaat acttagaatg aataagagct agtatttgat agcacaacgg gggactatag 1560

tcagtaataa tttagctgta cattgtaaaa taaccaaaag agtataattg gattatttgt 1620

aacacaaagg ataaatgctt gaggggatgg atacccaatt ttccatgatg tgattattgc 1680

gcattgcatg gctgtaccaa aatatctcat gtaccccata attatataca cctactatgt 1740

acccacaaaa aatttttaaa aaggaatgaa ataaaaacat ttgagtttaa gaaaaccaca 1800

aaaaaacaaa gtagggaaag ctcttcaaat actatgaaat tgagaagaca actaaagaaa 1860

atattaataa agacaagaac ataaataatt tctttggcag aacataagcc atcataatca 1920

gaagataaat aagctgggaa aaatatttgt aactcatatc ctagataaca tactcatttt 1980

ccctgtatat aaaaagtttc tctaatgtga taaataaaaa cacaataaac cagtaaaaaa 2040

tgaaaaaaaa aaa 2053

<210> 5

<211> 594

<212> DNA

<213> human

<400> 5

aggctcacta taaatagcag ccacctctcc ctggcagaca gggacccgca gctcagctac 60

agcacagatc agcaccatga agcttctcac gggcctggtt ttctgctcct tggtcctgag 120

tgtcagcagc cgaagcttct tttcgttcct tggcgaggct tttgatgggg ctcgggacat 180

gtggagagcc tactctgaca tgagagaagc caattacatc ggctcagaca aatacttcca 240

tgctcggggg aactatgatg ctgccaaaag gggacctggg ggtgcctggg ctgcagaagt 300

gatcagcaat gccagagaga atatccagag actcacaggc cgtggtgcgg aggactcgct 360

ggccgatcag gctgccaata aatggggcag gagtggcaga gaccccaatc acttccgacc 420

tgctggcctg cctgagaaat actgagcttc ctcttcactc tgctctcagg agacctggct 480

atgaggccct cggggcaggg atacaaagtt agtgaggtct atgtccagag aagctgagat 540

atggcatata ataggcatct aataaatgct taagaggtgg aatttgttga aaca 594

Claims

1.一种鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：获取鼻腔脱落细胞，将所述鼻腔脱落细胞加入RNA抽提液中，混合后加入第一溶剂混合，震荡均匀后静置，经第一次离心处理得上清液，取所述上清液加入第二溶剂混合，经第二次离心处理后保留第一沉淀，取所述第一沉淀继续加入第三溶剂混合，经第三次离心处理后保留第二沉淀，再经第四次离心处理保留沉淀，加入去RNA酶及去DNA酶的水溶解沉淀后得到RNA。

2.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：通过刷取或粘取鼻息肉表面获取鼻腔脱落细胞。

3.根据权利要求2所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：采用毛刷于鼻息肉表面按压20～40s，旋转3～4圈，刷取息肉表面，获取得到鼻腔脱落细胞。

4.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：所述RNA抽提液为Trizol、RNAiso Blood、RNAiso Plus或其它含有苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、异硫氰酸胍和β-巯基乙醇中的任一种或几种的试剂。

5.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：所述第一溶剂为氯仿；所述第二溶剂为异丙醇；所述第三溶剂为浓度65％～90％的乙醇。

6.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：所述RNA抽提液的添加量为0.1～20mL。

7.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：所述第一溶剂的添加量为0.04～5mL；所述第二溶剂的添加量与第一次离心处理得到的所述上清液的体积相等；所述第三溶剂的添加量与所述第二溶剂体积相等；取所述上清液的体积为0.04～8mL。

8.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：所述第一次离心处理的条件为经静置3～7min后，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；所述第二次离心处理的条件为经静置8～12min后，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；所述第三次离心处理的条件为于3℃～5℃，7000～14000r/min离心10～20min；所述第四次离心处理的条件为于3℃～5℃，7000～14000r/min离心1～3min，除去上清液后静置10～20min。

9.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：向装有鼻腔脱落细胞的离心管中加入0.1～20mLRNA抽提液进行溶解、振荡后，室温静置3～7min；加入40μL～5mL氯仿，震荡混匀，室温静置3～7min，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min；取上清液40μL～8mL，加入等体积的异丙醇，混匀后静置8～12min，于3℃～5℃，10000～14000r/min离心10～20min弃上清，保留第一沉淀；向所述第一沉淀中加入与异丙醇等体积的浓度65％～90％的乙醇，于3℃～5℃，7000～14000r/min离心10～20min，弃上清，保留第二沉淀；盖紧离心管，于3℃～5℃，7000～14000r/min离心1～3min，除去上清液，静置10～20min后继续向所述离心管中加入10～100μL去RNA酶及去DNA酶的水溶解所述第二沉淀，采用分光光度计测量RNA纯度，得到RNA。

10.根据权利要求1所述的鼻腔脱落细胞RNA的提取方法，其特征在于：采用分光光度计测量RNA溶液OD260/OD280比值为1.7～2.1时，得到RNA。