CN112575079B - 外泌体miRNA作为诊断2型糖尿病合并冠心病的分子标志物及其应用 - Google Patents
外泌体miRNA作为诊断2型糖尿病合并冠心病的分子标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子诊断技术领域,具体涉及外泌体miRNA作为诊断2型糖尿病合并冠心病的分子标志物及其应用。所述外泌体miRNA为miR‑15a‑3p、miR‑18a‑5p、miR‑19a‑3p、miR‑133a‑3p、miR‑155‑5p和miR‑210‑3p中任一种或两种以上的分子标志物组合,所述外泌体miRNA的具体核酸序列如SEQ NO.4、8、11、3、2、1所示。基于一个总的发明构思,本发明还包括外泌体miRNA在制备用于诊断2型糖尿病合并冠心病的试剂盒、微阵列或生物芯片中的应用。本发明证明上述六种血浆外泌体miRNA可以作为2型糖尿病合并冠心病的分子诊断标志物,将其制成诊断2型糖尿病合并冠心病的试剂盒、微阵列或生物芯片,通过检测受试者血浆外泌体miRNA的表达量,可以对2型糖尿病合并冠心病进行快速诊断和判定。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域,具体涉及外泌体miRNA作为诊断2型糖尿病合并冠心病的分子标志物及其应用。
背景技术
冠心病(coronary heart disease,CHD)在心血管系统疾病中占有重要地位,它是由冠状动脉粥样硬化引起的管腔狭窄或闭塞,导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏疾病。近年来该病在国内的发病率不断上升,日益成为威胁我国人民健康的重要因素。糖尿病与冠心病的发展密切相关,在糖尿病人群中冠心病的发病率较高,与单纯冠心病患者相比,其冠状动脉病变呈现弥漫性,多支病变的特点,且管腔的狭窄程度较普通冠心病狭窄程度更加严重,此外糖尿病合并冠心病与普通冠心病的临床症状存在差异,其表现为疼痛症状与部位不典型,胸痛较普通冠心病患者不明显,或仅表现胸闷等症状,冠心病并发心律失常患者可无心悸等症状,根据文献显示可能与糖尿病损伤神经系统或末梢血管有关,不利于糖尿病合并冠心病的及早诊断。有研究显示糖尿病患者往往伴随体内大血管的损伤,提示糖尿病不仅是一种血管性疾病,也是一种炎症性疾病。随着糖尿病的患病率的增加,其发病特点呈现年轻化、复杂化的趋势,对家庭和社会的危害也日益显现。虽然目前已经对冠心病的研究取得较大进展,但是两者的研究仍不足,其发病机制与关系仍不确切。临床迫切需要寻找冠心病、冠心病合并糖尿病的分子诊断标记,进行早预防、早治疗,尤其是对冠心病合并糖尿病患者,早期诊断将有效提高患者生存率。
目前临床上冠心病诊断的金标准是冠状动脉造影,但因其有费用高、有创性、有检查风险的特点存在缺陷,因此研发一种无创、快速灵敏且低成本的分子诊断方法势在必行。外泌体是由细胞分泌而来的微小囊泡,直径约为30-200nm,具有双层膜结构,天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞(免疫细胞、神经细胞、干细胞),都可以产生并释放外泌体。外泌体可以携带脂质体、蛋白质、mRNA和miRNA到达靶组织,并且可以参与细胞交流,免疫反应以及肿瘤的生长和迁移。最新研究显示,在疾病状态下外泌体miRNA会发生含量、种类等的变化,与血液中游离的miRNA相比,检测外泌体miRNA作为生物标记具有许多优势。外泌体可以有效地保护内含物免受核酸酶降解,从而保持循环中外泌体miRNA的完整性和功能性,这些特征使得外泌体成为一个有价值的诊断工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种外泌体miRNA作为诊断2型糖尿病合并冠心病的分子标志物及其应用,为2型糖尿病合并冠心病诊断提供一种有效的诊断工具。
为了实现上述技术目的,本发明采用以下技术方案:
外泌体miRNA作为诊断2型糖尿病合并冠心病的分子标志物,所述外泌体miRNA为miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-133a-3p、miR-155-5p和miR-210-3p中任一种或两种以上的分子标志物组合,所述外泌体miRNA的具体核酸序列如SEQ NO.4、8、11、3、2、1所示。
优选的,所述外泌体miRNA为miR-155-5p、miR-133a-3p和miR-15a-3p。
进一步优选的,所述外泌体为血浆外泌体。
基于一个总的发明构思,本发明还包括外泌体miRNA在制备用于诊断2型糖尿病合并冠心病的试剂盒、微阵列或生物芯片中的应用。
本发明还包括检测所述外泌体miRNA表达量的物质在制备诊断2型糖尿病合并冠心病的产品中的应用。
优选的,所述检测外泌体miRNA表达量的物质为引物或探针。
一种荧光定量检测所述外泌体miRNA的引物组合,所述的引物组合如下所示:
(1)miR-155-5p的引物:5’-AAGCGACCTTAATGCTAATCGTGA-3’
(2)miR-133a-3p的引物:5’-AACACGCTTTGGTCCCCTTC-3’
(3)miR-15a-3p的引物:5’-AACACGCCAGGCCATATTGTG-3’
本发明公开了基于血浆外泌体miRNA的诊断2型糖尿病合并冠心病的分子标志物及其应用。基于small RNA测序筛选及qRT-PCR验证结果表明,miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-133a-3p、miR-155-5p和miR-210-3p等六种人血浆外泌体miRNA在2型糖尿病合并冠心病患者与健康对照组间差异性表达。并通过ROC曲线分析六种血浆外泌体miRNA诊断2型糖尿病合并冠心病患者的效能,结果显示上述六种外泌体miRNA的AUC值分别为0.874、0.871、0.698、0.745、0.901和0.786。将AUC值最高的外泌体miR-155-5p,与miR-15a-3p、miR-133a-3p组合用于效能预测,分析结果该标志物组合的AUC值达到0.959(0.906,1),P<0.001,高于单个指标,且其灵敏度和特异度分别为80.8%和100%。
本发明证明上述六种血浆外泌体miRNA可以作为2型糖尿病合并冠心病的分子诊断标志物。将其制成诊断2型糖尿病合并冠心病的试剂盒、微阵列或生物芯片,通过检测受试者血浆外泌体miRNA的表达量,对2型糖尿病合并冠心病进行快速诊断和判定:当外泌体miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-133a-3p、miR-155-5p和miR-210-3p中至少一种miRNA表达量下调或miR-19a-3p表达量上调,亦或miR-155-5p、miR-133a-3p和miR-15a-3p表达量均下调时,提示该受试者患有2型糖尿病合并冠心病,具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1健康对照组与2型糖尿病合并冠心病患者的血浆外泌体TEM图像(比例尺,100nm);
图2健康对照组与2型糖尿病合并冠心病患者的血浆外泌体粒径分析曲线;
图3三种代表性外泌体特异性标志物的蛋白质印迹;图中CTR,健康对照;DM-IHD,糖尿病合并冠心病;
图4差异表达的血浆外泌体miRNA表达谱分层聚类结果;图中CTR,健康对照;DM-IHD,糖尿病合并冠心病;
图5差异表达的血浆外泌体miRNA表达谱的火山图;
图6采用qRT-PCR验证呈差异表达的六种血浆外泌体miRNA在两组间的相对表达情况示意图;
图7六种血浆外泌体miRNA表达水平的ROC曲线分析分析;
图8血浆外泌体miR-155-5p、miR-15a-3p和miR-133a-3p组合模型的ROC曲线分析。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
1)试验试剂
本发明健康对照组和2型糖尿病合并冠心病患者的血浆样本来自于郑州大学第一附属医院。其他所用试剂或耗材为普通市售或本领域技术人员通过公开途径可以获得的。
2)试验方法
使用EDTA抗凝采血管采集人外周血,以2500g离心15min,取上层血浆至2ml无菌管中,置于-80℃冰箱中冻存。从冰箱取出血浆后于25℃水浴中进行解冻,然后转移至离心管中于4℃以3000g离心10min,去除样品中的细胞碎片;去除细胞碎片的离心上清液转移至新的离心管后,于4℃以10000g离心20min,去除样品中杂质。取1.6ml上清液,加入0.4mlExoquick试剂(System Biosciences公司)4℃静置30分钟。离心(3000g×30分钟)后弃上清,再次离心(3000g×5分钟)后弃上清,所得沉淀物即为外泌体。
使用Exoquick试剂盒(System Biosciences公司)提取外泌体。将所得的5μl外泌体悬液加到Formvar-carbon载样铜网上,使用PBS液清洗铜网后放在50μl 1%戊二醛液滴上5min,然后放在100μl ddH2O洗涤2分钟。用草酸双氧铀液和甲基纤维素液染色,滤纸上吸去多余液体后,空气中干燥5min,使用JEOL-1230透射电子显微镜对所得外泌体形态进行鉴定。并采用ZetaView PMX 110粒子追踪器和蛋白质印迹对所得外泌体粒径和特异性标志物进行分析和鉴定。
3)分析方法
采用Graphpad Prism 8软件进行统计分析以及作图,符合正态分布的连续变量以均数±标准差(mean±SD)表示,两组间数据比较采用独立样本t检验;
采用SPSS 22.0软件计算曲线下的面积并作图,评估外泌体miRNA的诊断效能。P<0.05为差异具有统计学意义。
实施例
收集来自6例健康对照和6例2型糖尿病合并冠心病患者的血浆,并在-80℃下及时保存。采集者的基本临床特征见表1。
表1采集者的基本临床特征
注:连续变量为均数±标准差(mean±SE),分类变量用百分比表示。CTR,健康对照;DM-IHD,糖尿病合并冠心病患者。
使用Exoquick试剂盒(System Biosciences公司)从上述血浆样品中提取外泌体,并将所得外泌体固定于载样铜网上,染色、干燥后,使用JEOL-1230透射电子显微镜对所得外泌体形态进行鉴定;并采用ZetaView PMX 110粒子追踪器和蛋白质印迹对所得外泌体粒径和特异性标志物进行分析和鉴定。其中,TEM图像见图1;纳米粒子追踪分析(NTA)结果见图2;蛋白质印迹结果见图3(Alix,CD 63和CD 81)。图1至图3结果表明所提取的囊泡在形态、粒径分布以及特异性标志物标记方面符合外泌体特征。
将上述所得外泌体进行small RNA高通量测序:
取适量外泌体于1.5ml EP管中,加入Trizol试剂(Invitrogen公司)800ul,充分混合,裂解10min,12000rpm离心10min取上清震荡混匀后,4℃放置10min,然后加入200ul氯仿,振荡混匀后,4℃放置10min后进行12000rpm离心(10min);取上清,加入与上清等体积的异丙醇,加入一定体积的糖原,-20℃过夜,再次以12000rpm于4℃离心10min,弃上清;加入70%乙醇1ml,于4℃以12000rpm再次离心;加入10ul DEPC水后,用Nanodrop(ThermoFisher公司)测定RNA浓度。
样品检测合格后,使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina公司)试剂盒进行外泌体miRNAs文库构建。得到测序数据后,使用cutadapt软件截去reads两端接头,保留修剪后长度大于17nt的reads。使用FANse3超高精度序列比对算法将各样本测序得到的reads与该物种参考序列(Human mature miRNA,miRBase 22.1)进行比对。
比较健康对照组和2型糖尿病合并冠心病患者血浆外泌体miRNA差异表达。基因表达定量用TPM作为单位,即每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本数,消除测序深度对reads计数的影响。两组间外泌体差异miRNA的筛选,采用edgeR进行分析,基于负二项分布进行统计,检验方法为exactTest。差异基因的筛选阈值为:|log2FC|>1且P value<0.05。利用z-score归一化法得到的血浆外泌体miRNA表达谱分层聚类结果见图4;血浆外泌体miRNA表达谱的火山图见图5。分析结果显示,共计138个外泌体miRNA在2型糖尿病合并冠心病患者和对照组中差异表达。
根据small RNA高通量测序和之前的研究结果,选择13种外泌体miRNA进行大样本验证。13种外泌体miRNA分别为:miR-301a-5p、miR-19a-3p、miR-133a-3p、miR-155-5p、miR-26a-5p、miR-20a-5p、miR-181b-5p、miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-30e-5p、miR-92a-2-5p、miR-181a-5p以及miR-210-3p;具体核酸序列如SEQ NO.1~13所示。
利用qRT-PCR对上述外泌体miRNA进行验证:
收集来自14例健康对照和26例2型糖尿病合并冠心病患者的血浆,于-80℃条件及时保存。采集者的基本临床特征见表2。
表2验证样本的临床基本特征
注:连续变量为均数±标准差(mean±SE),分类变量用百分比表示。CTR,健康对照;DM-IHD,糖尿病合并冠心病患者。
1、提取外泌体总RNA
使用Exoquick试剂盒(System Biosciences公司)提取血浆中外泌体。取适量外泌体于1.5ml EP管中,加入800ul Trizol试剂(Invitrogen公司),充分混合,裂解10min,12000rpm离心10min取上清。震荡混匀后,4℃放置10min,然后加入200ul氯仿,振荡混匀后,4℃放置10min后进行12000rpm离心(10min);取上清,加入与上清等体积的异丙醇,加入一定体积的糖原,-20℃过夜,再次以12000rpm于4℃离心10min,弃上清;加入1ml 70%乙醇,于4℃以12000rpm再次离心;待RNA刚变透明时,加入适量Nuclease-free water,55℃水浴5min,使RNA完全溶解,紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
2.RNA逆转录cDNA
采用PrimeScriptTM RT(Takara公司)试剂盒将RNA逆转录为cDNA。首先按表3于冰上配制反应混合液消除RNA中的基因组,为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,应先按反应数+2的量配制MasterMix,然后再分装到每个反应管中,最后加入RNA样品。然后在42℃孵育2分钟,4℃保存。
表3消除RNA中的基因组
逆转录反应体系及反应条件如表4和5所示;
表4逆转录反应体系
表5逆转录反应条件
3.qRT-PCR检测
使用Stepone plus荧光定量PCR仪(Applied Biosystems公司)对外泌体miRNA进行分析,每个样品进行三次重复分析。表6为13种miRNA以及cel-miR-39的核酸序列以及其正向引物序列,通用反向引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-3’。引物对均由Umibio公司设计以及合成,并采用NCBI blast比对分析探索引物的灵敏度和特异度。表7和表8分别为qRT-PCR反应体系和反应条件,其中Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)购自Takara公司。以cel-miR-39作为外参,Log2(2-ΔΔCT)表示目的基因的相对表达水平。
表6外泌体miRNA核酸序列以及其正向引物序列
表7 qRT-PCR检测反应体系
表8 qRT-PCR检测反应条件
4.结果与分析:
两组样品qRT-PCR验证结果见图6。qRT-PCR结果显示,两组间有六种血浆外泌体miRNA表达量存在差异且P值<0.05,分别为miR-15a-3p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-133a-3p、miR-155-5p和miR-210-3p,说明这六种miRNA在健康对照和2型糖尿病合并冠心病患者组间的差异具有统计学意义。
用Graphpad Prism 8软件进行统计分析以及作图,并利用SPSS 22.0软件计算曲线下的面积,评估外泌体miRNA的诊断效能。6种血浆外泌体miRNA表达水平的ROC曲线分析见图7。ROC结果显示,miR-15a-3p(NO.4)、miR-18a-5p(NO.8)、miR-19a-3p(NO.11)、miR-133a-3p(NO.3)、miR-155-5p(NO.2)和miR-210-3p(NO.1)对2型糖尿病合并冠心病的诊断效能AUC值分别为0.874、0.871、0.698、0.745、0.901和0.786。其中,外泌体miR-155-5p对2型糖尿病合并冠心病的诊断效能最高,以外泌体miR-155-5p为基础加入miR-133a-3p和miR-15a-3p,考察三种外泌体miRNA作为组合模型的诊断效能。
通过对14例健康正常对照和26例冠心病合并2型糖尿病患者的检测发现,外泌体miR-155-5p、miR-133a-3p和miR-15a-3p组合在诊断2型糖尿病合并冠心病患者方面达到最佳效能(图8),AUC值达到0.959(0.906,1),P<0.001,高于单个指标,且其灵敏度和特异度分别为80.8%和100%。说明以外泌体miR-155-5p、miR-133a-3p和miR-15a-3p为组合的诊断模型是新型2型糖尿病合并冠心病诊断的生物标志物组合:外泌体中miR-155-5p、miR-133a-3p和miR-15a-3p表达量均下调则提示该受试者患有2型糖尿病合并冠心病。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 外泌体miRNA作为诊断2型糖尿病合并冠心病的分子标志物及其应用
<130> NONE
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
cugugcgugu gacagcggcu ga 22
<210> 2
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 2
uuaaugcuaa ucgugauagg gguu 24
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 3
uuuggucccc uucaaccagc ug 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 4
caggccauau ugugcugccu ca 22
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 5
aacauucaac gcugucggug agu 23
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 6
aacauucauu gcugucggug ggu 23
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 7
uguaaacauc cuugacugga ag 22
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 8
uaaggugcau cuagugcaga uag 23
<210> 9
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 9
uucaaguaau ccaggauagg cu 22
<210> 10
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 10
uaaagugcuu auagugcagg uag 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工合成
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ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23
<210> 12
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<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 12
cagugcaaua guauugucaa agc 23
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 13
ggguggggau uuguugcauu ac 22
<210> 14
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 14
ucaccgggug uaaaucagcu ug 22
Claims (4)
1.检测血浆外泌体miRNA表达量的物质在制备诊断2型糖尿病合并冠心病的产品中的应用,其特征在于,所述血浆外泌体miRNA为miR-155-5p、miR-133a-3p和miR-15a-3p,所述外泌体miRNA的具体核酸序列如SEQ NO.2、3、4所示。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品为试剂盒、微阵列或生物芯片。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述检测血浆外泌体miRNA表达量的物质为引物或探针。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,采用荧光定量检测所述血浆外泌体miRNA的引物组合如下:
(1)miR-155-5p的引物:5’-AAGCGACCTTAATGCTAATCGTGA-3’
(2)miR-133a-3p的引物:5’-AACACGCTTTGGTCCCCTTC-3’
(3)miR-15a-3p的引物:5’-AACACGCCAGGCCATATTGTG-3’。
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Citations (2)
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- 2020-12-31 CN CN202011625119.XA patent/CN112575079B/zh active Active
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2 型糖尿病并发冠心病患者血浆 miRNA-let7家族表达变化及诊断价值分析;杜开慧等;《山东医药》;20191231;第59卷(第32期);摘要 * |
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