CN107130017A - 试剂盒及试剂在制备试剂盒中的用途 - Google Patents

试剂盒及试剂在制备试剂盒中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，该试剂盒用于诊断诊断急性冠脉综合征，该试剂用于检测miR‑155‑5p‑5p、miR‑483‑5p以及miR‑451a的至少之一。发明人通过实验惊喜地发现，miR‑155‑5p、miR‑483‑5p或miR‑451a在斑块破裂前后具有显著的表达差异，其在冠状动脉斑块发生破裂的早期诊断中有较好的诊断价值。用于检测miR‑155‑5p、miR‑483‑5p以及miR‑451a的至少之一的试剂制备的试剂盒可有效用于早期诊断冠状动脉斑块破裂，具有敏感性高、特异性强的特点。

Description

试剂盒及试剂在制备试剂盒中的用途
技术领域
本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及用于诊断急性冠脉综合征的试剂盒及试剂在制备试剂盒中的用途。
背景技术
急性冠脉综合征主要包括不稳定型心绞痛、急性心肌梗死和心源性猝死。急性冠脉综合征的主要病理基础是冠状动脉斑块发生破裂、继发血栓形成所致。尽早识别发生斑块破裂的患者，及时给予抗血栓治疗，对于预防和阻止这些患者发生恶性不良心血管事件(如急性心肌梗死)具有非常重要的临床意义。然而现在并没有很好的诊断手段或标志物，用于识别发生冠状动脉斑块破裂的患者。对于临床上最常见的急性心肌梗死患者，往往在斑块破裂、继发血栓形成后，出现血液中心肌肌钙蛋白升高时方可诊断，这时患者心肌已经发生不可逆损害。如果能够寻找到可用于早期诊断斑块破裂的循环标志物，那么这部分心肌梗死患者会因为及早得到相应的治疗，而避免发生不可逆的心肌坏死。
虽然现在也有一些关于斑块破裂标志物的研究，如一些细胞因子、生长因子、酶等，但这些标志物距离临床应用还有很远的距离。
因此，冠状动脉斑块发生破裂的及早诊断仍是科研工作者拭待解决的关键问题。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
miRNAs是长约20-22nt、单链、非编码RNA，在转录后水平负向调节基因表达。研究表明，miRNAs通过调控多个生物信号通路，参与动脉粥样硬化起始、发展及斑块破裂的全过程。血液中的miRNAs因与转运蛋白结合，或包裹在微颗粒或外泌体内，不易被降解而稳定存在于血液循环中。大量试验数据表明，循环miRNAs可能是诊断冠心病的新型生物标志物。并且发明人发现，经皮冠脉介入治疗的患者，会因球囊扩张和置入支架而出现斑块损伤、破裂。基于上述研究背景和发现，发明人利用经皮冠脉介入治疗所造成的斑块破裂这特点，作为研究人体冠状动脉斑块破裂标志物的天然模型，筛选了球囊扩张前(0h组，即对照组)和扩张后1h(1h组，即斑块破裂组)差异表达的循环miRNAs。发明人惊喜地发现，miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a在球囊扩张前(0h组，即对照组)和扩张后1h(1h组，即斑块破裂组)具有显著的差异表达，miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a可作为临床诊断急性冠脉综合征和冠状动脉斑块发生破裂早期的可靠指标。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断诊断急性冠脉综合征，所述试剂用于检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一。发明人通过实验惊喜地发现，miR-155-5p、miR-483-5p或miR-451a在斑块破裂前后具有显著的表达差异，其在冠状动脉斑块发生破裂的早期诊断中有较好的诊断价值。用于检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的试剂制备的试剂盒可有效用于诊断急性冠脉综合征，具有敏感性高、特异性强的特点。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断冠状动脉斑块发生破裂早期。用于检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的试剂制备的试剂盒可更加有效地用于诊断冠状动脉斑块发生破裂早期，具有敏感性更高、特异性更强的特点。
根据本发明的实施例，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的1小时内。发明人经过实验发现，用于检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的试剂制备的试剂盒可有效用于诊断在1小时内发生破裂的冠状动脉斑块的破裂，具有高敏感性的特点。
根据本发明的实施例，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的0.5小时。发明人发现，在冠状动脉斑块发生破裂后的0.5小时，单独检测miR-155-5p、miR-483-5p或miR-451a，其AUC均大于0.7，其敏感性分别为89.66,89.66,62.07，特异性分别为44.83,79.31,82.76，表明在冠状动脉斑块发生破裂后的0.5小时，单独检测miR-155-5p、miR-483-5p或miR-451a具有较好的诊断价值；且发明人发现，联合诊断miR-155-5p/miR-483-5p或miR-483-5p/miR-451a,诊断价值更高，其AUC分别为0.948，0.982，敏感性分别为79.31，96.55，特异性分别为96.55，89.66。
根据本发明的实施例，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的1小时。发明人发现，在冠状动脉斑块发生破裂后的1小时，单独检测miR-155-5p或miR-483-5p，其AUC均大于0.7，其敏感性分别为72.41，82.76，特异性分别为68.97，82.76，表明在冠状动脉斑块发生破裂后的1小时，单独检测miR-155-5p或miR-483-5p具有较好的诊断价值；且发明人发现，联合诊断miR-155-5p/miR-483-5p或miR-483-5p/miR-451a诊断价值更高，其AUC分别为0.898，0.891，敏感性分别为89.66，82.76，特异性分别为75.86，79.31。
根据本发明的实施例，所述试剂为用于识别miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的探针、抗体、活性因子或用于扩增miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的引物。用于识别miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a至少之一的的探针、抗体或活性因子能够特异性识别miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一，用于扩增miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的引物能够特异性扩增miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一，从而通过PCR，检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的表达量，其中miR-155-5p、miR-483-5p的表达量增加或miR-451a的表达量下降，是早期冠状动脉斑块发生破裂的指示。
根据本发明的实施例，所述探针具有SEQ ID NO：1～6所示的核苷酸序列，所述引物具有SEQ ID NO：7～12所示的核苷酸序列。具有SEQ ID NO：1～6所示的核苷酸序列的探针可通过碱基互补配对与miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一特异性结合，具有SEQ ID NO：7～12所示的核苷酸序列的引物能够特异性扩增miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一，获得的扩增条带清晰，杂带少。
ACCCCTATCACGATTAGCATTAA(SEQ ID NO：1)。
CTCCCTTCTTTCCTCCCGTCTT(SEQ ID NO：2)。
AACTCAGTAATGGTAACGGTTT(SEQ ID NO：3)。
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT(SEQ ID NO：4)。
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCCCT(SEQ ID NO：5)。
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA(SEQ ID NO：6)。
GCGCGCGTTAATGCTAATCGTGAT(SEQ ID NO：7)。
ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG(SEQ ID NO：8)。
GCGCGA AGACGG GAGGAA AGA(SEQ ID NO：9)。
ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG(SEQ ID NO：10)。
CGCGCGAAA CCGTTACCATTA C(SEQ ID NO：11)。
ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG(SEQ ID NO：12)。
其中，特异性识别miR-155-5p的探针具有SEQ ID NO：1或4所示核苷酸序列；特异性识别miR-483-5p的探针具有SEQ ID NO：2或5所示核苷酸序列；特异性识别miR-451a的探针具有SEQ ID NO：3或6所示核苷酸序列；SEQ ID NO：7和8是用于扩增miR-155-5p的特异性引物；SEQ ID NO：9和10是用于扩增miR-483-5p的特异性引物；SEQ ID NO：11和12是用于扩增miR-451a的特异性引物。
本发明的第二方面，本发明提出了一种用于诊断急性冠脉综合征的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括试剂，所述试剂用于检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一。发明人通过实验惊喜地发现，miR-155-5p、miR-483-5p或miR-451a在斑块破裂前后具有显著的表达差异，其在冠状动脉斑块发生破裂的早期诊断中有较好的诊断价值。包括用于检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的试剂的试剂盒可有效用于诊断急性冠脉综合征，具有敏感性高、特异性强的特点。
根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断冠状动脉斑块发生破裂早期。包含用于检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的试剂的试剂盒可更加有效地用于诊断冠状动脉斑块发生破裂早期，具有敏感性更高、特异性更强的特点。
根据本发明的实施例，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的1小时内。发明人经过实验发现，包含用于检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的试剂的试剂盒可有效用于诊断在1小时内发生破裂的冠状动脉斑块的破裂，具有高敏感性、高特异性的特点。
根据本发明的实施例，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的0.5小时。发明人发现，在冠状动脉斑块发生破裂后的0.5小时，单独检测miR-155-5p、miR-483-5p或miR-451a，其AUC均大于0.7，其敏感性分别为89.66,89.66,62.07，特异性分别为44.83,79.31,82.76，表明在冠状动脉斑块发生破裂后的0.5小时，单独检测miR-155-5p、miR-483-5p或miR-451a具有较好的诊断价值；且发明人发现，联合诊断miR-155-5p/miR-483-5p或miR-483-5p/miR-451a,诊断价值更高，其AUC分别为0.948，0.982，敏感性分别为79.31，96.55，特异性分别为96.55，89.66。
根据本发明的实施例，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的1小时。发明人发现，在冠状动脉斑块发生破裂后的1小时，单独检测miR-155-5p或miR-483-5p，其AUC均大于0.7，其敏感性分别为72.41，82.76，特异性分别为68.97，82.76，表明在冠状动脉斑块发生破裂后的1小时，单独检测miR-155-5p或miR-483-5p具有较好的诊断价值；且发明人发现，联合诊断miR-155-5p/miR-483-5p或miR-483-5p/miR-451a诊断价值更高，其AUC分别为0.898，0.891，敏感性分别为89.66，82.76，特异性分别为75.86，79.31。
根据本发明的实施例，所述试剂为用于识别miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的探针、抗体、活性因子或用于扩增miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的引物。用于识别miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a至少之一的的探针、抗体或活性因子能够特异性识别miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一，用于扩增miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的引物能够特异性扩增miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一，从而通过PCR，检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的表达量，其中miR-155-5p、miR-483-5p的表达量增加或miR-451a的表达量下降，是早期冠状动脉斑块发生破裂的指示。
根据本发明的实施例，所述探针具有SEQ ID NO：1～6所示的核苷酸序列，所述引物具有SEQ ID NO：7～12所示的核苷酸序列。具有SEQ ID NO：1～6所示的核苷酸序列的探针可通过碱基互补配对与miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一特异性结合，具有SEQ ID NO：7～12所示的核苷酸序列的引物能够特异性扩增miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一，获得的扩增条带清晰，杂带少。
附图说明
图1是根据本发明实施例的在治疗前(0h)和球囊扩张术后1h(1h)循环miRNAs的表达水平；
图2是根据本发明实施例的在治疗前(0h)和CAG结束后1h(1h)循环miRNAs的表达水平；以及
图3是根据本发明实施例的在治疗前(0h)和球囊扩张后0.5h(0.5h)和1h(1h)循环miRNAs的表达水平。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
(1)研究对象：择期行经皮冠脉介入治疗、仅放入1个支架的稳定冠心病患者，冠心病诊断参照2014年ACC/AHA/AATS/PCNA/SCAI/STS指南。
(2)研究设计
研究依次分三个阶段：筛查miRNAs差异表达谱(n＝10)、验证芯片中所有差异表达miRNAs(n＝10)、扩大人群进一步验证第二阶段得到的差异表达miRNA(n＝29)。
1)筛查miRNAs差异表达谱：分别留取患者行球囊扩张前(0h组，即对照组)和扩张后1h(1h组，即斑块破裂组)的血，提取血浆RNA，采用low density TaqManw HumanMicroRNA Card A(version 2.0)和B(version 3.0)Array(Applied Biosystems,FosterCity,CA)进行miRNA表达谱筛查，可检测754个miRNAs表达水平。通过significanceanalysis of microarrays(SAM)法，分析得到斑块破裂组相对于破裂前，有24个差异表达miRNAs。该24个miRNAs随后进入第二研究阶段。
2)验证芯片中所有差异表达miRNAs：为了验证芯片结果的正确性，将筛查出的24个miRNAs在另一组患者中进行real-time PCR检测。为了除外造影剂对循环miRNAs表达水平的影响，发明人还留取了10例仅行造影检查患者的血液(对照组：造影前，实验组：造影结束后1h)。最后仅6个miRNAs进入第三个研究阶段。
3)扩大验证阶段：分别留取患者行球囊扩张前(0h组，即对照组，斑块破裂前)和扩张后0.5h、1h(实验组，即斑块破裂后0.5h和1h)的血，提取血浆RNA后，通过real-time PCR检测上述6个miRNAs在另一组患者中的表达水平。最终对斑块破裂前后表达水平有差异的miRNA，进行受试者工作曲线分析，判断这些miRNA作为斑块破裂标志物的诊断价值。
实施例1斑块破裂后1h相比于破裂前的miRNAs差异表达谱
所有入选患者的基线资料见表1。留取10例患者球囊扩张前(即斑块破裂前)和球囊扩张后(即斑块破裂后)1h的血浆标本，提取RNA后，进行芯片检测，发现与斑块破裂前相比，斑块破裂1h后出现差异表达的miRNA共24个，7个上调miRNAs，14个下调miRNAs，见表2。
表1：研究人群基线资料
表2：斑块破裂后差异表达miRNAs
以上是两组间差异表达倍数(fold change)>2倍，错误发现率(false discoveryrate)＜0.0001％的miRNAs
实施例2验证上述芯片中24个差异表达miRNAs：
在另外10个患者中，留取球囊扩张前(即斑块破裂前)和球囊扩张后(即斑块破裂后)1h的血浆标本，提取RNA后，通过real-time PCR，检测由芯片筛查出的24个miRNAs表达水平，发现8个仍存在差异表达miRNAs，包括miR-155-5p、miR-212-3p、miR-483-5p、miR-1233-3p、miR-20b-5p、miR-122-5p、miR-451a、miR-486-5p，见图1。此外，由于miR-376a表达丰度很低，在前3个近乎检测不到，故放弃后续验证。
由于收取的球囊扩张前后的标本均存在造影剂，故为了消除造影剂对miRNA水平的影响，发明人收取了10例患者造影前和造影结束后1h的血浆，检测上述8个差异表达miRNAs的水平，结果发现造影前后，miR-212-3p和miR-1233-3p存在差异表达，见图2。故总的来说，斑块破裂后1h和破裂前，差异表达miRNA是miR-155-5p、miR-483-5p、miR-20b-5p、miR-122-5p、miR-451a、miR-486-5p。
实施例3扩大人群验证上述6个差异表达miRNAs，并确定这些miRNA对斑块破裂的诊断能力
为了进一步验证上述6个差异表达的miRNAs，最终确定可用于诊断斑块破裂的miRNAs，发明人在另外29例患者中，留取球囊扩张前和扩张后0.5h、1h的血浆标本，提取RNA后，对miR-155-5p、miR-483-5p、miR-20b-5p、miR-122-5p、miR-451a、miR-486-5p的水平进行real-time PCR检测，结果如下：球囊扩张后0.5h，较球囊扩张前，差异表达miRNA为miR-155-5p、miR-483-5p、miR-451a；球囊扩张后0.5h，较球囊扩张前，差异表达miRNA为miR-155-5p、miR-483-5p，见图3。
为了评估miR-155-5p、miR-483-5p、miR-451a诊断斑块破裂的能力，利用上述29例患者real-time PCR数据，发明人进行了受试者工作特征曲线分析(ROC curve analyses)。发现miR-483-5p在斑块破裂后0.5h和1h的曲线下面积(AUC)均最高，分别是0.937(CI：0.841-0.984)和0.894(CI：0.785-0.960)。miRNA联合诊断分析结果显示，斑块破裂后0.5h，miR-483-5p和miR-451a的AUC最高，为0.982(CI：0.907-0.999)。斑块破裂后1h，miR-483-5p和miR-155-5p的AUC较单个miR-483-5p的AUC仅轻度增高，联合诊断的AUC为0.898(CI：0.790-0.962)。三个miRNAs单一诊断和联合诊断斑块破裂的AUC见表3。
通过上述三个阶段研究，最终确定miR-155-5p、miR-483-5p、miR-451a是斑块破裂早期的潜在诊断标志物，用于早期识别高危冠心病患者。
表3：受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curves)分析
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学人民医院
<120> 试剂盒及试剂在制备试剂盒中的用途
<130> PIDC3170001
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<170> PatentIn version 3.3
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<223> 特异性识别miR-451a的探针具有的核苷酸序列
<400> 6
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaactca 50
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 用于扩增miR-155-5p的特异性引物
<400> 7
gcgcgcgtta atgctaatcg tgat 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 用于扩增miR-155-5p的特异性引物
<400> 8
atccagtgca gggtccgagg 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 用于扩增miR-483-5p的特异性引物
<400> 9
gcgcgaagac gggaggaaag a 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 用于扩增miR-483-5p的特异性引物
<400> 10
atccagtgca gggtccgagg 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 用于扩增miR-451a的特异性引物
<400> 11
cgcgcgaaac cgttaccatt ac 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 用于扩增miR-451a的特异性引物
<400> 12
atccagtgca gggtccgagg 20

Claims (10)

1.试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断急性冠脉综合征，所述试剂用于检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于诊断冠状动脉斑块发生破裂早期。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的1小时内，
任选地，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的0.5小时，
任选地，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的1小时。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂为用于识别miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的探针、抗体、活性因子或用于扩增miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的引物。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述探针具有SEQ ID NO：1～6所示的核苷酸序列，所述引物具有SEQ ID NO：7～12所示的核苷酸序列。
6.一种用于诊断急性冠脉综合征的试剂盒，其特征在于，包括试剂，所述试剂用于检测miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于诊断冠状动脉斑块发生破裂早期。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的1小时内，
任选地，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的0.5小时，
任选地，所述早期是指冠状动脉斑块发生破裂后的1小时。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为用于识别miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的探针、抗体、活性因子或用于扩增miR-155-5p、miR-483-5p以及miR-451a的至少之一的引物。
10.根据权利要9所述的试剂盒，其特征在于，所述探针具有SEQ ID NO：1～6所示的核苷酸序列，所述引物具有SEQ ID NO：7～12所示的核苷酸序列。
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