CN109486945A - 一种miRNA检测试剂盒及其在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了完整的能够方便快捷的检测miRNA检测试剂盒，无需另外订制特殊引物序列。另一方面通过本试剂盒检测AS病人血清中循环miR‑155的表达水平和斑块组织中miR‑155的表达水平，同时检测不同AS管腔狭窄程度患者血清中miR‑155的表达水平，进一步应用统计学方法分析miR‑155与AS常见风险因素的相关性分析以及应用ROC分析miR‑155对冠脉狭窄程度>75％诊断能力，探讨miR‑155在AS中表达以及临床意义，为AS的辅助诊断以及冠脉狭窄程度分级提供新的思路。

Description

一种miRNA检测试剂盒及其在诊断冠脉管腔狭窄程度中的 应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及miRNA的检测试剂盒和其作为分子标记物在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化(AS)的发病机制是一种多基因遗传、多级涉及免疫和血管管壁细胞成分的多发性、多阶段长期发展共同作用的复杂性疾病，可引起不同程度的血管管腔狭窄引发堵塞等临床严重事件，动脉系统中最常累及冠状动脉。冠状动脉粥样硬化进一步发展下去可使管腔变狭窄、血流量减少，心肌因缺血继而坏死，导致心绞痛、急性心肌梗死、室性心律失常和猝死等严重疾病；在过去的十年统计中，冠状动脉粥样硬化性心脏病一直位于世界十大死亡原因之一。在AS初级阶段，单核细胞会同时受到AS炎症反应刺激而释放的炎症因子及氧化应激的双重作用下，分化形成巨噬细胞，同时，巨噬细胞会摄食并累积氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)从而形成内皮下沉积的泡沫细胞，逐渐形成动脉粥样硬化斑块，进一步使管腔变狭窄，不同的冠脉狭窄程度会引起不同程度的临床事件。
microRNA(miRNA)展现出在进化上高度保守，这类小分子RNA在一系列细胞病理生理学效果和分子信号通路中担任着不可或缺的角色。虽然miRNA在人类基因组中所占比例只有1％-3％，但人类基因的30％却被它们调控着；近年来有报道发现血液、尿液、胸腹水、脑脊液等体液中稳定地存在miRNA，使循环miRNA可能作为疾病诊断、预后生物学标志以及新的治疗靶点。越来越多的研究表明这些小分子RNA通过调控其靶基因的表达从而广泛参与到心血管疾病的病理生理进程中。
在本项目中，我们主要聚焦于一种被MIR155宿主基因(MIR155HG)编码并由B细胞整合簇转录的miRNA：miR-155。目前已有许多报道表明，miR-155在炎症性疾病是一种多功能的miRNA，在不同的细胞、疾病程度、疾病类型中，miR-155可能发挥抑制炎症或促进炎症两种不同的作用，zhu等在他们的研究ApoE基因敲除并伴随高脂饮食的大鼠胸主动脉组织和AS病人的血浆标本中均发现miR-155明显升高，并进一步证实miR-155是通过靶向作用MAP3K10来调节其下游分析信号通路来抑制炎症因子的产生从而削弱了AS的病理进程。但是也有报道称miR-155可能促进AS进程，其可能机制有miR-155在ApoE基因敲除小鼠的骨髓细胞中通过抑制BCL6介导的CCL2的转录水平的抑制，从而促进了AS的发生发展。这些不同的研究结果皆表明miR-155在不同的细胞类型、病理进程和动物模型中有不同程度的升高，其可能参与动脉粥样硬化冠脉管腔狭窄病理进程中。
中国CN201210406314.2号专利涉及抑制micro-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法。具体地，miR-155表达的显著升高与动脉粥样硬化的严重程度呈现正向相关联，miR-155在动脉粥硬化小鼠(ApoE-/-/C57BL/6J)的腹腔巨噬细胞和血清中表达显著升高，oxLDL能特异性诱导小鼠的腹腔巨噬细胞表达和分泌miR-155；在oxLDL诱导的巨噬细胞中，miR-155表达量提高能促进脂质吞噬和活性氧生成；miR-155抑制剂可以显著抑制小鼠腹主动脉的斑块形成；miR-155是动脉粥样硬化疾病治疗一个重要靶点，miR-155抑制剂可以用于预防和治疗动脉粥样硬化。该专利未公开采用试剂盒测定miRNA的表达水平，试剂盒的组成，以及miRNA表达水平与动脉粥样硬化特定症状之间的关系。
中国CN102168132A号专利公开了可用于对miRNA进行相对定量检测的一条茎环引物和多条配套扩增的引物、试剂盒和评价表。试剂盒包括试剂A：逆转录茎环引物混合液50μL；试剂B：M-MuLV逆转录酶；试剂C：逆转录缓冲液；试剂D：通用引物100μL；试剂E：miRNA特异性引物；试剂F：U6特异性引物；试剂G：Taq DNA聚合酶；试剂H：2×PCR缓冲液。本发明所提供的整套试剂盒可对不同类型T细胞的miRNA片段进行相对定量分析，并对个体免疫状态进行评估。该专利为公开miRNA表达水平与动脉粥样硬化特定症状之间的关系。
目前国内外研究miRNA的检测手段主要是芯片技术、测序技术以及实时荧光定量PCR反应，芯片技术可以进行大规模的检测筛选，但由于成本较高且对检测标本要求严格，所以芯片技术不作为常规检测miRNA的方法；测序技术能够通过检测碱基种类从而精确确认miRNA的种类，但也存在成本花费高、耗时长且无法精准定量，故也不将其采纳为miRNA检测的常规方法；实时荧光定量PCR技术具有能够简单方便的进行操作，并能相对定量miRNA的含量，成本花费少等优点，使得其成为检测miRNA的常规手段，但纵观市面上大部分检测miRNA的PCR试剂盒，都需额外制定特殊的miRNA逆转录引物和定量PCR检测用上游和下游引物检测不方便。
通过检测miRNA表达水平的高低能够判断动脉粥样硬化的严重程度，由于脉粥样硬化发病因素较多，使得患者冠脉管腔狭窄程度的诊断结果常常出现较大误差或误判，检测准确度低。因此，急需设计一种miRNA检测试剂盒及其在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种miRNA检测试剂盒及其在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用，本发明提供了完整的能够方便快捷的检测miRNA的试剂盒，无需另外订制特殊引物序列。另一方面通过本试剂盒检测AS病人血清中循环miRNA的表达水平和斑块组织中miRNA的表达水平，同时检测不同AS管腔狭窄程度患者血清中miRNA的表达水平，进一步应用统计学方法分析miRNA与AS常见风险因素的相关性分析以及应用ROC分析miRNA对冠脉狭窄程度>75％诊断能力，探讨miRNA在AS中表达以及临床意义，为AS的辅助诊断以及冠脉狭窄程度分级提供新的思路。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种miRNA检测试剂盒，由逆转录试剂、qPCR试剂组成，
所述逆转录试剂包括：10μM miRNA逆转录引物、10μM U6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂；
所述qPCR试剂包括：10μM miRNA qPCR上游引物、10μM miRNA qPCR下游引物、10μMU6qPCR上游引物、10μM U6qPCR下游引物、2×Ultr动脉粥样硬化YBR Mixture、双蒸水。
所述逆转录试剂中10μM miRNA逆转录引物、10μM U6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂的体积比为1-2:1-2:20-30:8-10:2-3。
所述逆转录试剂中，10μM miRNA逆转录引物、10μM U6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂的体积比为1:1:20:8:2。
所述qPCR试剂中，10μM miRNA qPCR上游引物、10μM miRNA qPCR下游引物、10μMU6qPCR上游引物、10μM U6qPCR下游引物、2×Ultr动脉粥样硬化YBR Mixture、双蒸水的体积比为1:1::1:5:5。
本发明还提供一种miRNA检测试剂盒在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用，通过miRNA检测试剂盒检测血清中miR-155的表达水平，作为识别冠脉狭窄程度76-100％的独立危险因素。
判断依据为，当miR-155的相对表达水平大于77.80，可以诊断为76-100％冠脉狭窄。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了完整的能够方便快捷的检测miRNA的试剂盒，无需另外订制特殊引物序列；
(2)本发明公开了miR-155在AS中表达以及临床意义，为AS的辅助诊断以及冠脉狭窄程度分级中的作用。通过本发明中miR-155检测试剂盒检测miR-155的表达水平，证实了miR-155在动脉粥样硬化患者血清和斑块组织中表达升高，使得将miR-155应用于诊断AS具有一定的临床意义。并且进一步证实了miR-155的表达水平能够辅助对冠脉管腔狭窄程度进行区分，即miR-155随着狭窄程度的加深而升高，提示miR-155对诊断不同狭窄程度的动脉粥样硬化具有一定的分级意义，另外miR-155能够较好的诊断冠脉狭窄程度>75％的患者，Logistic回归分析结果也显示miR-155可能是识别AS狭窄程度76-100％的独立危险因素，提高冠脉管腔狭窄程度的检测准确度、通过其他检测参数同时诊断冠脉管腔狭窄程度以避免误判。
附图说明
图1为动脉粥样硬化病人血清中miR-155相对表达量；
图2为斑块组织中miR-155的相对表达量；
图3为不同管腔狭窄程度患者血清miR-155相对表达量；
图4为ROC分析miR-155对冠脉狭窄程度>75％诊断能力。
具体实施方式
下面本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例提供一种miRNA检测试剂盒，包括以下组分：
上述试剂盒组成可用于荧光定量PCR反应100次，在-20℃下保存，以上试剂来源由上述各试剂公司提供。
本发明还提供所述一种miRNA检测试剂盒在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用，具体实施方式为，
1、病例资料分析
1.1实验方法：收集经血管造影确诊为动脉粥样硬化80例患者血清，根据血管造影检查管腔狭窄程度1％～25％、26％～50％、51％～75％、76％～100％各14例。动脉粥样硬化的血管造影具体诊断指标按照中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布的《WS319冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断标准2010》和中华医学会发布的《非ST段抬高急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南2012》，造影结果均显示边缘光滑的充盈缺损和向心性狭窄，内膜表面完整的斑块或管壁增厚。同时选取60例无AS临床表现者作为正常对照组，所有外周血标本均在空腹采血完4小时之内经4℃1600g离心10分钟、4℃16000g离心10分钟分离血清后快速置于液氮速冻后储存于-80℃。
1.2实验结果：80例AS病人组比较60例无AS临床症状表现的正常对照组的临床生化指标中甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、载脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)均有明显升高，高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)明显降低，但载脂蛋白A(apolipoprotein A,ApoA)无明显差异，如表1所示。
表1.对照组与AS病人组临床生化指标比较
2、动脉粥样硬化病人血清和斑块组织中miR-155相对表达量
2.1实验方法
2.1.1RNA提取：病人组和对照组血清中miRNA、斑块组织中的RNA通过以下方法提取：①取出-80℃超低温冰箱保存的患者血清置于室温溶解，充分溶解后4℃；斑块组织经研磨器研碎。②吸取300μL血清/斑块组织，加入1mLTrizol LS溶液，迅速震荡摇匀30s，充分混匀样品。③加入200μL氯仿，强烈震荡20s后静置3min；④在4℃，12000g离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中。⑤小心将上层水层移至另一个新的离心管；⑥加入0.5mL异丙醇，充分混匀，静置10min，然后在4℃，12000g离心10min；⑦吸弃上清，加入用75％乙醇1mL，振荡器上剧烈摇荡离心管15s，充分混匀，在4℃，7500g离心5min；⑧吸弃上清，室温下干燥5min，加入25μLDEPC水溶解RNA。
2.1.2RNA浓度检测和标化：分光光度计260nm和280nm波长下检测吸光度，并计算比值，确定RNA的纯度及浓度，并按照检测结果取适量RNA定量至1μg，备后续实验。
2.1.3逆转录：
表2.逆转录试剂表
试剂 体积
miR-155逆转录引物 0.5μL
U6逆转录引物 0.5μL
5×RT Buffer 2μL
RT Enzyme Mix 0.5μL
RNA 1μg
Nuclease-free Water 加至10μL
反应条件：37℃条件下进行15分钟的逆转录反应，在98℃条件下进行5分钟酶失活反应。
2.1.4定量PCR反应：
表3.PCR反应试剂
试剂 体积
逆转录产物cDNA 2μL
2×UltraSYBR Mixture 25μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
双蒸水 加至50μL
反应条件：95℃条件下进行10min预变性，在95℃条件下进行15s的变性反应，退火/延伸到60℃保温1min，将上述PCR反应过程循环40次。
2.1.5Real-time PCR结果分析：miR-155的相对表达水平结果采用相对定量方法(2-ΔCT)表示。同一样本的CT值减去其内参U6的CT值，获得ΔCT值(△CT sample＝CTsample-CT U6sample)，每个样本重复三次。
2.2实验结果：qRT-PCR结果显示miR-155在对照组和动脉粥样硬化病人血清中相对表达量分别为9.66±23.08、26.22±45.71，AS患者血清中miR-155的表达量明显高于对照组，如图1所示。miR-155在正常血管组织和对应动脉粥样硬化斑块组织中相对表达量分别为2.41±2.91、5.21±5.46，斑块组织中miR-155的表达量明显高于正常血管组织，如图2所示。3、miR-155的相对表达量与管腔狭窄程度的关系。
3.1试验方法：收集的80例AS病人标本中有56例为冠状动脉粥样硬化患者，根据CTA检查56例患者在1％～25％、26％～50％、51％～75％、76％～100％四个不同管腔狭窄程度各14例，RNA提取、浓度测定、逆转录、定量PCR以及计算方式同上，统计学处理用SPSS13.0软件进行统计学分析。符合正态分布的数据，计量数据用均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间数据进行各组间单因素方差分析One-Way ANOVA，两两比较，满足方差齐性要求时用Bonferroni法，不满足方差齐性要求时用Tamhane’s T2检验。不符合正态分布的数据，两组间比较采用秩和检验；多组中两两比较采用Kruskal-Wallis检验。符合正态分布的数据，线性相关采用pearson相关分析；不符合正态分布的数据，采用spearman等级相关分析，P<0.05认为差异有统计学意义。
3.2实验结果：miR-155的相对表达量在四种狭窄程度患者血清中相对表达量分别为7.54±5.80，12.20±9.82，32.70±18.07，77.80±61.91，结果显示miR-155的表达水平随着管腔狭窄程度的加深而升高，如图3所示。同时，将血管造影诊断为不同狭窄程度的结果作为标准，对56例AS患者进行确诊，应用ROC分析miR-155对冠脉狭窄程度>75％诊断能力，结果显示，当miR-155相对表达量大于77.80时，miR-155对冠脉狭窄程度>75％的患者具有较好的识别能力，如图4所示，纵坐标为真阳性率(灵敏度)，横坐标为假阳性率(1-特异度)，曲线下面积为0.789，P＜0.05。进一步，将AS常见发病因素如年龄、性别、胆固醇、LDL-C、以及本研究中的miR-155为变量建立Logistic回归模型，将所有变量统一纳入进行Logistic回归分析，结果如表4所示，结果显示miR-155可作为识别狭窄76-100％的独立危险因素。
图4.Logistic回归分析miR-155识别AS狭窄程度76-100％的独立危险因素
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种miRNA检测试剂盒，其特征在于，由逆转录试剂、qPCR试剂组成，
所述逆转录试剂包括：10μM miRNA逆转录引物、10μM U6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂；
所述qPCR试剂包括：10μM miRNA qPCR上游引物、10μM miRNA qPCR下游引物、10μM U6qPCR上游引物、10μM U6 qPCR下游引物、2×Ultr动脉粥样硬化YBR Mixture、双蒸水。
2.根据权利要求1所述的一种miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂中10μMmiRNA逆转录引物、10μM U6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂的体积比为1-2:1-2:20-30:8-10:2-3。
3.根据权利要求2所述的一种miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂中10μMmiRNA逆转录引物、10μM U6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂的体积比为1:1:20:8:2。
4.根据权利要求1所述的一种miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述qPCR试剂中10μMmiRNA qPCR上游引物、10μM miRNA qPCR下游引物、10μM U6 qPCR上游引物、10μM U6 qPCR下游引物、2×Ultr动脉粥样硬化YBR Mixture、双蒸水的体积比为1:1:1:5:5。
5.权利要求1所述一种miRNA检测试剂盒在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用，其特征在于，通过miRNA检测试剂盒检测血清中miR-155的表达水平，作为识别冠脉狭窄程度76-100％的独立危险因素。
6.根据权利要求5所述一种miRNA检测试剂盒在诊断冠脉管腔狭窄程度中的应用，其特征在于：判断依据为，当血清中miR-155的相对表达水平大于77.80，可以诊断为76-100％冠脉狭窄。
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