CN115992218B

CN115992218B - 用于诊断急性心肌梗死的外泌体环状rna标志物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115992218B
Application number: CN202211216432.7A
Authority: CN
Inventors: 韩东; 曹丰; 马焱; 程芮; 王亚斌; 秦诚; 贺晶; 聂闻博; 王天虎
Original assignee: Second Medical Center of PLA General Hospital
Current assignee: Second Medical Center of PLA General Hospital
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2042-09-30
Also published as: CN115992218A

Abstract

一种检测心肌细胞外泌体环状RNA标志物表达量的物质的应用，包括下述应用中的一种或多种：A1)在用于制备诊断急性心肌梗死产品中的应用；A2)在用于制备筛查急性心肌梗死产品中的应用；A3)在用于制备评估急性心肌梗死风险产品中的应用；A4)在用于制备急性心肌梗死预后评估产品中的应用；A5)在用于制备鉴别区分急性心肌梗死和其他疾病产品中的应用；所述环状RNA标志物为环状RNA标志物hsa_circ_0031446，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。上述应用中，hsa_circ_0031446环状RNA标志物在急性心肌梗死病人的血浆样本中表达显著上调。

Description

用于诊断急性心肌梗死的外泌体环状RNA标志物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种诊断标志物，具体地说是一种用于诊断急性心肌梗死的环状RNA标志物，该环状RNA标志物为心肌细胞外泌体环状RNA标志物，本发明还涉及由该环状RNA标志物制备得到的检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

心肌梗死(myocardial infarction，简写为MI)是缺血性心脏病/冠状动脉疾病的常见表现，是世界范围内的主要死亡原因。全球每年有2000万人死于心血管疾病，其中冠心病(包括急性心肌梗死和心绞痛)是主要的死亡原因，而急性心肌梗死死亡率最高。对于MI的诊断，现今临床常用的诊断预后的血清学生物标记物有肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶等，但有一定的局限性。探索新的生物标志物对急性心肌梗死的诊断和预后有积极的意义。

外泌体是一种膜结合的小泡(30～100nm)，是内吞来源，由大多数细胞类型分泌。它们来自于多泡体的腔膜，并由多泡体与细胞膜融合而构成释放在正常和病理条件下，外泌体可以通过穿梭蛋白质、mRNA和microRNAs(miRNAs)来介导细胞、组织和器官水平的微通信。

环状RNA标志物是一种单链的ncRNA，其结构为一种没有自由末端的共价闭环。基因通过选择性剪接可以产生多种不同的mRNA，与mRNA的标准剪接不同，环状RNA标志物是通过反剪接过程产生的。环状RNA标志物有三种类型，包括仅包含外显子序列的外显子环状RNA标志物、仅包含内含子序列的内含子环状RNA标志物和包含外显子和内含子序列的混合型环状RNA标志物。环状RNA标志物通过多种机制在生物体内的发挥生理功能，其中最典型的调控模式是可以在细胞中起到miRNA海绵的作用，解除miRNA对其靶基因的抑制作用，从而升高靶基因的表达水平。此外，环状RNA标志物可参与大多环状RNA标志物在生物体内是高度保守、种类丰富且较为稳定的，只有少数进化上呈现不保守性。同时，内源性环状RNA标志物的表达水平能反映出真核细胞的细胞类型、发育阶段和特异的表达模式。研究表明环状RNA标志物可以作为心血管疾病的一种潜在的治疗靶点和生物标志物，然而其在急性心肌梗死中的作用机制还有待进一步阐明，所以深入研究环状RNA标志物在急性心肌梗死中的作用机制对该疾病的诊断和预后都具有潜在的巨大意义。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种环状RNA标志物的应用，该环状RNA标志物在制备诊断、筛查、预后评估及区分急性心肌梗死的物质中的新用途。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种用于检测环状RNA标志物的试剂盒，该试剂盒可以用于诊断、筛查、预后评估及区分急性心肌梗死。

本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种检测环状RNA标志物的引物，该引物可以用于诊断、筛查、预后评估及区分急性心肌梗死。

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种检测心肌细胞外泌体环状RNA标志物表达量的物质的应用，包括下述应用中的一种或多种：

A1)在用于制备诊断急性心肌梗死产品中的应用；

A2)在用于制备筛查急性心肌梗死产品中的应用；

A3)在用于制备评估急性心肌梗死风险产品中的应用；

A4)在用于制备急性心肌梗死预后评估产品中的应用；

A5)在用于制备鉴别区分急性心肌梗死和其他疾病产品中的应用；

所述环状RNA标志物为环状RNA标志物hsa_circ_0031446，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

上述记载的“产品”可以为通过qRT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测RNA hsa_circ_0031446表达水平以诊断急性心肌梗死的产品。

上述应用中，心肌细胞外泌体RNA hsa_circ_0031446环状RNA标志物在急性心肌梗死病人血浆外泌体中表达显著上调。

其中较优地，所述物质为用于检测环状RNA标志物hsa_circ_0031446表达量的试剂，或所述物质为用于检测环状RNA标志物hsa_circ_0031446含量的试剂。

其中较优地，所述物质为用于检测环状RNA标志物hsa_circ_0031446表达量的物质为下述a)、b)或c)

a)用于检测环状RNA标志物hsa_circ_0031446表达量的特异性引物；

b)含有所述a)的试剂组；

c)含有所述a)或所述b)的试剂盒。

d)其中较优地，

所述特异性引物为SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

根据本发明实施例的第二方面，提供一种检测心肌细胞外泌体环状RNA标志物表达量的试剂盒，所述试剂盒包括下述应用中的一种或多种：

A1)在用于制备诊断急性心肌梗死产品中的应用；

A2)在用于制备筛查急性心肌梗死产品中的应用；

A3)在用于制备评估急性心肌梗死风险产品中的应用；

A4)在用于制备急性心肌梗死预后评估产品中的应用；

所述环状RNA标志物为环状RNA标志物hsa_circ_0031446，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述试剂盒包括用于检测环状RNA标志物hsa_circ_0031446表达量的试剂，或用于检测环状RNA标志物hsa_circ_0031446含量的试剂。

其中较优地，所述用于检测环状RNA标志物hsa_circ_0031446表达量的试剂为特异性引物，所述特异性引物为SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

根据本发明实施例的第三方面，提供一种用于检测心肌细胞外泌体环状RNA标志物的引物，所述引物包括下述应用中的一种或多种：

A1)在用于制备诊断急性心肌梗死产品中的应用；

A2)在用于制备筛查急性心肌梗死产品中的应用；

A3)在用于制备评估急性心肌梗死风险产品中的应用；

A4)在用于制备急性心肌梗死预后评估产品中的应用；

所述引物为检测环状RNA标志物hsa_circ_0031446表达量的引物，所述hsa_circ_0031446的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

其中较优地，所述引物为SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

本发明具有以下的技术效果：

(1)本发明提供的心肌细胞外泌体环状RNA标志物hsa_circ_0031446可作为急性心肌梗死诊断的新标志物。经临床验证，hsa_circ_0031446在急性心肌梗死病人血浆外泌体中表达显著上调。

(2)ROC曲线表明hsa_circ_0031446具有良好的诊断急性心肌梗死病人的潜能。表明hsa_circ_0031446作为新型诊断生物标志物具有良好的敏感度和特异性。

(3)在急性心肌梗死的病人中，hsa_circ_0031446的表达水平与CK-MB呈正相关关系，说明hsa_circ_0031446在血浆中的水平可反应疾病的严重程度。

(4)在体外细胞学实验中，人心肌细胞系AC16模拟心梗状态下心肌缺氧的表现中，AC16细胞上清液外泌体中hsa_circ_0031446的表达量显著增加，奠定了hsa_circ_0031446作为患者心梗诊断生物标志物的细胞分子学基础。

(5)敲减了hsa_circ_0031446，心肌细胞的损伤有所逆转，这提示了hsa_circ_0031446可能参与到了缺氧所诱导的心肌细胞损伤的过程中。

附图说明

图1A为由circRNA芯片和qRT-PCR实验筛选出hsa_circ_0031446结构示意图；

图1B为circRNA芯片测定表达差异的circRNA富集火山图；

图2为提取的患者血浆外泌体对外泌体标记蛋白的鉴定；

图3为使用hsa_circ_0031446引物对急性心肌梗死病人和健康体检者血浆外泌体表达量检测的结果图；

图4为评价hsa_circ_0031446诊断急性心肌梗死潜能的ROC曲线图；

图5A为病人血浆CM-MB与hsa_circ_0031446表达量的关系；

图5B为病人血浆hsa_circ_0031446表达量与受累冠脉数量关系；

图6为缺氧处理和正常对照的AC16细胞上清液外泌体中hsa_circ_0031446的表达量；

图7A为AC16转染si-circ_0031446后hsa_circ_0031446小干扰RNA(siRNA)在AC16转染敲降率的表达量图；

图7B为AC16转染si-circ_0031446后对应的mRNA表达量图；

图8为敲降hsa_circ_0031446和对照组AC16经过缺氧诱导后的细胞上清液LDH浓度检测。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术内容进行详细具体的说明。

本发明入组60位急性心梗的患者，对血浆外泌体进行了分离，并用qRT-PCR方法对hsa_circ_0031446进行了测定，研究其在在急性心肌梗死病人血浆外泌体中表达情况。为了进一步验证hsa_circ_0031446在急性心梗患者中的诊断效能，我们将60位入组的病人血浆中分离出外泌体，并用上述qRT-PCR的方法测定了外泌体中hsa_circ_0031446的表达量。本发明还利用患者术前血化验指标CK-MB与血浆中hsa_circ_0031446做比较，以研究hsa_circ_0031446和疾病严重程度的关系。为了在细胞水平验证上述结果的可靠性，本发明还选取了人心肌细胞系AC16模拟心梗状态下心肌缺氧的表现，敲减hsa_circ_0031446，观察心肌细胞的损伤情况，用以验证hsa_circ_0031446与缺氧所诱导的心肌细胞损伤的关系。具体数据如下：

实施例1心肌细胞外泌体环状RNA标志物的筛选及相关性研究1.实验材料与方法

1.1临床样本：

收集解放军总医院2019～2021年因急性心肌梗死住院的60名患者术前血。根据受累血管数量，将其分为3组，分别为1支血管病变、2支血管病变与3支病变，经提取外泌体后，用基因芯片测定血浆外泌体中差异表达的circRNA(见方法部分)。且将2支血管病变组单独选出对照化验单的CK-MB含量与hsa_circ_0031446进行比较，详见图5A和图5B。

1.2外泌体提取及鉴定：

使用EDTA抗凝采血管采集人外周血，以2500g离心15min，取上层血浆至2m1无菌管，置于-80℃冰箱中冻存。从冰箱取出血浆后于25C水浴中进行解冻，然后转移至离心管于4C以3000g离心10min，去除样品中的细胞碎片；去除细胞碎片的离心上清液转移至新离心管后，于4℃以10000g离心20min，去除样品中杂质。取1.6m1上清液，加入0.4m1Exoquick试剂(System Biosciences)4C静置30分钟。离心(3000g×30分钟)后弃上清，再次离心(3000g×5分钟)后弃上清，所得沉淀物即为外泌体。将所得的外泌悬液加到Formvar-carbon载样铜网上，使用PBS液清洗铜网后放在50u11％戊二醛液固定5min，然后放在100u1去离子水洗涤2分钟。用草酸双氧铀液和甲基纤维素液染色，滤纸上吸去多余液体后，空气中干燥5min，使用JEOL-1230透射电子显微镜对所得外泌体形态进行鉴定。并采用ZetaView PMx 110粒子追踪器和蛋白质印迹对所得外泌体粒径和特异性标志物进行分析和鉴定。

1.3外泌体Western blot：

单层贴壁细胞总蛋白的提取：每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然后将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。于4℃下12000rpm离心5min。经BCA法定量后。转膜：6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜，用60V转移2h或40V转移3h。将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。将一抗用TBST稀释至适当浓度(在1.5ml离心管中)；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。化学发光，显影，定影：在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)，浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

1.4RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：

使用RNA simple Total RNA Kit(DP419，TIANGEN，Beijing，China)从AC16中提取总RNA。如前所述，1μg总RNA用于cDNA合成反应。

1.4.1RNA提取

按照血管狭窄数量分组分为3组，按照TRIZOLB Reagent(Invitrogen)说明书提取组织RNA。向血浆中加入1ml TRIZOLp Reagent(Invitrogen)并加入三氣甲烧20041，涡旋剧烈振荡20s，室温静置10min：13000rpm，4℃离心15min。小心仔细吸取上清，加入异丙醇800u1，上下颠倒轻柔混匀，-20℃静置1h，13000rpm，4℃离心15min，弃除上清。加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃离心13000rpm5min后去除上清，吹干。加入适量无酶水，65℃促溶10min检测RNA的OD值及浓度，-80℃保存备用。

1.4.2RNA逆转录合成cDNA

使用逆转录试剂盒(Takara RR037A)，将500ng的RNA逆转录为CDNA。

1.4.3circRNA的逆转录：

冰上操作，每个反应体系10u1，如下表：

表1

1.4.4mRNA的逆转录：

冰上操作，每个反应体系10u1，如下表：

表2

反应程序为：37℃45min，85℃5min，4℃维持。

1.4.5qRT-PCR

根据circRNAs引物设计原则设计circRNAs引物序列。

将逆转录反应得到的cDNA，按照1:10稀释，进行如下qRT-PCR反应

(1)冰上操作，每个反应体系10u1，如下表：

表3

(2)反应液混匀Real-time PCR仪反应程序如下：

Stage 1:95℃2min；

Stage 2:Cycle 35，94℃5s，60℃1min；

Stage 3:95℃15s，60℃1min，95℃15s。

用GAPDH定量各mRNA的相对水平，并以相对比率表达。

1.5circRNA芯片分析：

使用SBC公司的SurePrint G3 Human circRNA Array检测急性心梗患者血清和相应正常对照者的血清中circRNA表达谱的差异,并使用利用Agilent Gene Spring软件对芯片结果进行分析,筛选表达量具有显著性差异(Fold chang≥2.0,P值<0.05)的circRNA，再利用qRT-PCR测定患者血浆中该circRNA芯片结果表达显著升高的前10位circRNA的含量，挑选出显著升高的第一位circRNA进行后续实验。

表4前10位circRNA

1.6统计分析：

对正态变量采用t检验和方差分析，对非正态变量采用Mann Whitney U检验和Kruskal Wallis检验。采用R软件(v 3.4.2)和GraphPad Prism软件(v 8.00)进行统计分析。生物学复制(单个小鼠)显示为单个数据点叠加在柱状图上。P<0.05认为有显著性差异。

2.实验结果：

如图1所示，由circRNA芯片和qRT-PCR筛选出hsa_circ_0031446由(STRN3)基因第(2到7)号外显子反向剪接所形成。结合表4及图1B显示，图1B为circRNA芯片测定表达差异的circRNA富集火山图。提示了病理状态下患者血清circRNA发生了显著性变化，发生显著性上调或下调的circRNA可能与疾病的发生发展有关，其中发生显著性上调的circRNA有望进一步研究作为疾病诊断生物标志物。

如图2所示，血浆外泌体的电镜、粒径和Wersten blot鉴定结果。实验结果表明本发明成功的分离了患者血浆中的外泌体，后续实验结果均在此技术上完成。

如图3所示，从60位急性心梗的患者中随机选取了5个急性心梗病人和5个正常对照者，对血浆外泌体进行了分离，并用上述方法中的qRT-PCR方法对hsa_circ_0031446进行了测定，结果表明，与正常组织相比，hsa_circ_0031446在急性心肌梗死病人血浆外泌体中表达显著上调。这些结果表明了hsa_circ_0031446有可能作为急性心肌梗死的诊断生物标志物。

如图4所示，为了进一步验证hsa_circ_0031446在急性心梗患者中的诊断效能，我们将60位入组的病人血浆中分离出外泌体，并用上述qRT-PCR的方法测定了外泌体中hsa_circ_0031446的表达量，并结合60位正常对照组病人的外泌体hsa_circ_0031446水平作出ROC曲线下面积(AUC)为0.8722，表明hsa_circ_0031446具有良好的诊断急性心肌梗死病人的潜能。

如图5所示，本发明用患者术前血化验指标CK-MB与血浆中hsa_circ_0031446做比较，在急性心肌梗死的病人中，hsa_circ_0031446的表达水平与CK-MB呈正相关关系，且受累血管越多，hsa_circ_0031446的表达水平越高。CK-MB是心肌细胞受损的标志性蛋白，hsa_circ_0031446与CK-MB水平呈正相关。这些结果表，hsa_circ_0031446在血浆中的水平可反应疾病的严重程度。

实施例2体外实验细胞水平验证hsa_circ_0031446与急性心肌梗死之间的关系

1.材料与方法：

1.1细胞培养：

人心肌细胞系(AC16)购自武汉普诺赛，细胞培养在RPMI-1640培养基+10％胎牛血清中，培养在37度5％二氧化碳敷箱中。

1.2缺氧处理：

将培养的心肌细胞暴露于95％N2/5％CO2混合气体培养室进行缺氧处理,缺氧24h后,与对照组常氧95％O2/5％CO2的心肌细胞比较细胞上清液外泌体中的hsa_circ_0008618含量(见图6)

1.3siRNA敲减：

siRNA订购自Thermo Fisher公司，根据说明书，在细胞汇合度达70％加入，诱导24h。

1.4LDH浓度检测：

采用LDH释放检测试剂盒(C0016，Beyotime，Shanghai，China)，按说明书检测细胞的细胞毒性。每孔加入60微升LDH检测工作液。样品在室温(约25℃)黑暗中孵育30分钟。然后在490nm处测定吸光度。

2.实验结果：

如图6所示，为了在细胞水平验证上述结果的可靠性，我们选取了人心肌细胞系AC16模拟心梗状态下心肌缺氧的表现(方法详见材料与方法部分)，结果显示，缺氧处理组和对照组相比，AC16细胞上清液外泌体中hsa_circ_0031446的表达量显著增加。这表明了，在心肌细胞缺氧的条件下，释放在细胞上清液外泌体中的hsa_circ_0031446水平升高，这可能是hsa_circ_0031446作为患者心梗诊断生物标志物的细胞分子学基础。

如图7A和图7B所示，AC16转染si-circ_0031446后，hsa_circ_0031446表达量显著下调，而其对应的mRNA表达量则无明显变化。表明转染成功，后续实验在此基础上完成。

如图8所示，转染si-circ-0031446后，缺氧诱导的AC16细胞上清液LDH浓度显著增加。LDH浓度是心肌细胞损伤的标志性蛋白，而在敲减了hsa_circ_0031446，心肌细胞的损伤有所逆转，这提示了hsa_circ_0031446可能参与到了缺氧所诱导的心肌细胞损伤的过程中，此机制有待进一步探索。

上述实施例1和实施例2结果表明，hsa_circ_0031446在急性心肌梗死病人血浆外泌体中表达上调；ROC曲线显示hsa_circ_0031446具备良好的诊断能力；体外实验显示hsa_circ_0031446的敲减缺氧对心肌细胞的损伤，表明hsa_circ_0031446可能在缺血性心肌病中发挥对心肌细胞的保护作用。综上所述，hsa_circ_0031446有望成为一种新的急性心肌梗死诊断生物标志物和治疗靶点。

实施例4本发明涉及到的序列、引物及试剂盒组成

本发明所述急性心肌梗死的标志物—心肌细胞外泌体环状标志物hsa_circ_0031446核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，

SEQ ID No.1：其由STRN3的第2到第7个外显子方向剪接形成

GCCCGGATTGCATTTCTACAAGGCGAAAGAAAAGGTCAAGAGAACCTGAAGAAGGACTTAGTAAGAAGAATAAAGATGTTAGAGTATGCATTAAAACAAGAAAGGGCAAAATATCACAAATTAAAATATGGCACGGAACTGAACCAAGGTGACTTGAAAATGCCAACCTTTGAGTCAGAAGAAACCAAAGACACAGAGGCTCCCACAGCACCTCAGAATAGCCAGTTAACGTGGAAGCAAGGCAGACAGCTTTTAAGACAGTATCTTCAGGAAGTAGGTTATACAGATACAATATTAGATGTACGGTCTCAGCGGGTAAGGTCATTACTTGGACTATCTAATTCAGAACCAAATGGATCAGTAGAAACAAAGAATTTAGAACAGATCCTGAATGGAGGTGAATCTCCTAAGCAAAAGGGACAAGAAATAAAAAGGTCCTCTGGTGATGTTCTTGAGACGTTCAATTTCTTAGAAAATGCCGATGACAGTGATGAAGATGAGGAAAATGACATGATCGAAGGCATCCCAGAAGGAAAAGACAAACATCGGATGAATAAACATAAAATAGGTAATGAAGGTTTAGCTGCTGACCTAACTGACGATCCTGATACTGAGGAAGCACTGAAAGAATTTGATTTTTTAGTGACTGCTGAAGATGGTGAAGGAGCTGGAGAAGCACGGAGTTCGGGGGATGGCACAGAATGGG

本发明提供的特异性识别hsa_circ_0031446的引物对，包括上游引物为SEQ IDNo.2所示，下游引物为SEQ ID No.3所示：

SEQ ID No.2：ACTGAGGAAGCACTGAAAGAA

SEQ ID No.3：CCTTGTAGAAATGCAATCCGGG

本发明所提供的试剂盒的具体组成：

5xPrimeScript Buffer、PrimeScriptRT Enzyme Mix I、Random 6mers、Oligo dTPrimer、RNase-free H20、SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2x)、PCR Primer(F+R)(10uM)、ROX Reference Dye(50x)。

Claims

1.一种检测心肌细胞外泌体环状RNA标志物表达量的物质的应用，其特征在于包括下述应用中的一种或多种：

A1）在用于制备诊断急性心肌梗死产品中的应用；

A2）在用于制备筛查急性心肌梗死产品中的应用；

A3）在用于制备评估急性心肌梗死风险产品中的应用；

A4）在用于制备急性心肌梗死预后评估产品中的应用；

A5）在用于制备鉴别区分急性心肌梗死和其他疾病产品中的应用；

所述环状RNA标志物为环状RNA hsa_circ_0031446，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述物质为用于检测环状RNA hsa_circ_0031446表达量的试剂，或所述物质为用于检测环状RNA hsa_circ_0031446含量的试剂。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述物质为用于检测环状RNA hsa_circ_0031446表达量的物质，所述物质为下述a）、b）或c）

a）用于检测环状RNA hsa_circ_0031446表达量的特异性引物；

b）含有所述a）的试剂组；

c）含有所述a）或所述b）的试剂盒。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述特异性引物为SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。