KR20190057529A - 임신중독증 진단을 위한 바이오마커인 miRNA-31-5p 및 이의 이용 - Google Patents

임신중독증 진단을 위한 바이오마커인 miRNA-31-5p 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 임신중독증 진단을 위한 바이오마커인 miR-31-5p 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 miR-31-5p의 농도 측정 물질을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물, 이 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 miR-31-5p를 이용하여 임신중독증 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 miR-31-5p를 바이오마커로 이용하여 임신중독증을 정확하게 진단하거나 예측할 수 있다. 특히 본 발명의 바이오마커는 기존에 알려져 있는 바이오마커인 sEng 및 sFlt-1과도 유의성 있는 상관관계가 있으며, 임신중독증 진단용 바이오마커로서 민감도와 특이도가 매우 우수하다.

Description

임신중독증 진단을 위한 바이오마커인 miRNA-31-5p 및 이의 이용{The biomarker miRNA-31-5p for diagnosis of pre-eclampsia and use thereof}
본 발명은 임신중독증 진단을 위한 바이오마커인 miRNA(miR)-31-5p 및 이의 이용에 관한 것으로, 구체적으로 miR-31-5p의 농도 측정 물질을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물, 이 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 miR-31-5p를 이용하여 임신중독증 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
임신중독증은 임신 20주 이후에 염증, 저산소증, 산화적 스트레스와 같은 다양한 원인에 의해 단백뇨(>300 mg/day)를 동반하는 고혈압(>140/90 mmHg) 질환으로 임산부와 태아의 생명까지 위협한다. 그러나 아직까지 별다른 치료제는 없고 예방이 최선의 방안인 것으로 알려져 있다.
임신중독증과 관련된 연구결과 중 임신중독증 환자의 혈액에서 혈관내피세포의 혈관신생을 억제하는 sFlt1 (soluble VEGF 수용체-1)과 sEng (soluble TGF-β 수용체)의 농도가 증가하고, 혈관신생을 촉진하는 PlGF (태반성장인자)의 농도는 감소된다는 연구결과가 보고된 바 있다. 그리고 sFlt1 : PlGF 비율이 38 이상일 경우 잠재적 임신중독증 유발 가능성이 높을 것이라고 보고된 바 있다. 그러나 이러한 인자들은 혈관신생 억제와 관련된 것이므로 이 인자들만으로는 임신중독증을 정확하게 예측하기는 어렵다는 문제가 있다. 따라서 임신중독증을 보다 정확하게 예측하기 위한 민감도와 특이도가 높은 신규 인자의 발굴과 검증이 필요한 실정이다.
한편, miRNA는 유전자의 전사 후 발현을 조절하는 핵산분자로 다양한 질병의 유발 원인이 되고 있으며, 진단용 바이오마커로 활용하고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 본 발명자는 임신중독증 또한 연관된 miRNA가 있을 가능성이 있다고 판단하였으며, 이에 임신중독증의 바이오마커를 개발하기 위해 miRNA에 주목하였다. 만약 임신중독증 환자에서 특이적으로 낮거나 높은 농도를 나타내고, 임신중독증의 대표적 임상학적 특성인 혈압을 조절하는 표적 유전자의 발현을 조절하는 miRNA를 발굴한다면 임신중독증을 진단할 수 있는 진단용 바이오마커(인자)로 활용이 가능할 수 있을 것으로 기대하였다.
Zeisler H, Llurba E, Chantraine F, Vatish M, Staff AC, Sennstrom M, Olovsson M, Brennecke SP, Stepan H, Allegranza D, Dilba P, Schoedl M, Hund M, Verlohren S. Predictive Value of the sFlt-1:PlGF Ratio in Women with Suspected Preeclampsia. N Engl J Med. 2016, 374:13-22. Bolla D, Papadia A, Raio L. The sFlt-1:PlGF Ratio in Women with Suspected Preeclampsia. N Engl J Med. 2016, 374:1785. Kim J, Lee KS, Kim JH, Lee DK, Park M, Choi S, Park W, Kim S, Choi YK, Hwang JY, Choe J, Won MH, Jeoung D, Lee H, Ryoo S, Ha KS, Kwon YG, Kim YM. Aspirin prevents TNF-α-induced endothelial cell dysfunction by regulating the NF-κB-dependent miR-155/eNOS pathway: Role of a miR-155/eNOS axis in preeclampsia. Free Radic Biol Med. 2017, 104:185-198.
따라서 본 발명의 주된 목적은 임신중독증을 정확하게 진단하거나 예측하기 위한 민감도와 특이도가 높은 신규 바이오마커를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용한 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용한 임신중독증 예측 또는 진단에 필요한 정보제공방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 miR-31-5p의 농도 측정 물질을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 농도 측정 물질은 상기 miR-31-5p의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 피검자의 생물학적 시료에서 miR-31-5p 농도를 측정하는 단계; 및 상기 miR-31-5p 농도를 정상 대조구 시료의 miR-31-5p 농도와 비교하는 단계;를 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단에 필요한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 소변 시료인 것이 바람직하다.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 상기 miR-31-5p 농도의 측정은 miR-31-5p의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 사용한 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, 노던블롯, 마이크로어레이, 형광공명에너지전이 또는 제한효소 특이적 절단 분석을 수행하여 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면 miR-31-5p를 바이오마커로 이용하여 임신중독증을 정확하게 진단하거나 예측할 수 있다. 특히 본 발명의 바이오마커는 기존에 알려져 있는 바이오마커인 sEng 및 sFlt-1과도 유의성 있는 상관관계가 있으며, 임신중독증 진단용 바이오마커로서 민감도와 특이도가 매우 우수하다.
도 1 : 정상 임산부와 임신중독증 환자의 혈청에서 soluble endoglin(sEng)(A), soluble Flt-1(sFlt-1)(B) 및 placenta growth factor(PlGF)(C)의 농도를 분석한 결과.
도 2 : 정상 임산부와 임신중독증 환자의 혈청에서 miR-31-5p와 miR-155-5p의 농도를 분석한 결과. A: 정상 임산부와 임신중독증 환자 혈청에서 miR-31-5p의 농도 분석 결과. B: 정상 임산부와 임신중독증 환자 혈청에서 miR-155-5p의 농도 분석 결과.
도 3 : 임신중독증 환자의 혈청에서 sEng의 농도에 따른 miR-31-5p와 miR-155-5p의 변화를 분석한 결과. A: 임신중독증 환자 혈청에서 sEng의 농도에 따른 miR-31-5p의 농도 변화를 분석한 결과. B: 임신중독증 환자 혈청에서 sEng의 농도에 따른 miR-155-5p의 농도 변화를 분석한 결과.
도 4 : 임신중독증 환자의 혈청에서 sFlt-1의 농도에 따른 miR-31-5p와 miR-155-5p의 변화를 분석한 결과. A: 임신중독증 환자 혈청에서 sFlt-1의 농도에 따른 miR-31-5p의 농도 변화를 분석한 결과. B: 임신중독증 환자 혈청에서 sFlt-1의 농도에 따른 miR-155-5p의 농도 변화를 분석한 결과.
도 5 : 임신중독증 환자의 혈중 miR-31-5p와 miR-155-5p의 농도 간 상관성을 분석한 결과.
도 6 : 정산 임산부와 임신중독증 환자의 혈중 miR-31-5p와 miR-155-5p 농도를 기반으로 receiver operating characteristic(ROC, 수신자 작용 특성) 곡선 분석을 통해 진단용 바이오마커로서 정확도, 민감도 및 특이도를 분석한 결과. A: 혈중 miR-31-5p의 농도를 기반으로 ROC 곡선을 분석한 결과. B: 혈중 miR-155-5p의 농도를 기반으로 ROC 곡선을 분석한 결과. C: 혈중 miR-31-5p와 miR-155-5p의 다중 분석법을 기반으로 ROC 곡선을 분석한 결과.
도 7 : miR-31-5p와 miR-155-5p에 의해 eNOS/soluble guanylyl cyclase-1β(sGC1β)/cGMP-dependent protein kinase G1(PKG1)의 발현이 억제되는 결과. A: 사람의 탯줄정맥 혈관내피세포(HUVEC)에서 miR-31-5p와 miR-155-5p에 의해 eNOS 단백질과 sGC1β의 mRNA의 발현이 억제된 결과. B: 인간 동맥 혈관내피세포(HASMC)에서 miR-31-5p와 miR-155-5p에 의해 sGC1β와 PKG1의 mRNA와 단백질의 발현이 억제된 결과.
도 8 : 정상 임산부와 임신중독증 환자의 탯줄혈관에서 eNOS와 sGC1β의 발현 양상을 분석한 결과. A: eNOS와 sGC1β mRNA의 발현 양상을 RT-PCR로 분석한 결과. B: eNOS mRNA의 발현 양상을 qRT-PCR로 분석한 결과. C: sGC1β mRNA의 발현 양상을 qRT-PCR로 분석한 결과.
도 9 : 사람의 태반동맥에서 miR-31-5p와 miR-155-5p에 의해 혈관이완이 억제되는 결과. A: miR-31-5p에 의해 인간 태반동맥의 이완이 억제된 결과. B: miR-155-5p에 의한 인간 태반동맥의 이완이 억제된 결과.
본 발명은 다음과 같은 연구결과를 바탕으로 안출되었다.
(1) 임신중독증 환자 혈액의 miR-31-5p 및 miR-155-5p의 농도는 정상 임산부와 비교하여 유의성 있게 증가되어 있음
(2) 이들 miRNA의 농도는 기존에 알려져 있는 진단용 생체 바이오마커인 sEng와 sFlt-1의 농도와 유의성 있는 양의 상관성이 있음
(3) ROC 곡선 분석에 의하면 이들 miRNA는 임신중독증 진단용 바이오마커로서 정확도, 민감도 그리고 특이도가 매우 우수함
(4) 이들 miRNA는 혈관내피세포와 평활근세포에서 혈압을 조절하는 유전자인 eNOS, sGC1β 및 PKG1의 발현을 억제할 뿐만 아니라, 임신중독증 환자의 혈관 조직에서도 eNOS와 sGC1β의 발현이 억제되어 있음
(5) 이들 miRNA는 태반동맥 혈관의 이완을 억제하는 효과가 있음
(6) miR-31-5p 및 miR-155-5p는 임신중독 환자에서 발현이 증가되고, 혈압조절에 관련된 eNOS/sGC/PKG 경로를 억제하여 고혈압을 유발함
(7) 특히, miR-31-5p를 이용하여 진단할 경우, miR-155-5p를 단독으로 또는 함께 이용하는 경우 보다 정확도가 높음
본 발명에서 바이오마커로 사용되는 miR-31-5p 및 miR-155-5p에 관한 정보는 miRNA 데이터베이스인 miRBase(http://www.mirbase.org) 등을 통해 잘 알려져 있다. miR-31의 스템-루프 서열(stem-loop sequence)은 서열번호 1과 같으며, 성숙한 형태인 miR-31-5p는 서열번호 2, 또 다른 성숙한 형태인 miR-31-3p는 서열번호 3의 서열로 이루어진다. miR-155의 스템-루프 서열(stem-loop sequence)은 서열번호 4와 같으며, 성숙한 형태인 miR-155-5p는 서열번호 5, 또 다른 성숙한 형태인 miR-155-3p는 서열번호 6의 서열로 이루어진다.
본 발명에서 바이오마커의 농도 측정 물질은 상기 바이오마커의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 시료에서 본 발명 바이오마커의 농도를 측정할 수 있는 것이라면 어떠한 것이든 사용할 수 있다.
본 발명에서 바이오마커의 농도 측정은 상기와 같은 프라이머 또는 프로브를 사용한 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, 노던블롯, 마이크로어레이, 형광공명에너지전이, 제한효소 특이적 절단 분석 등을 통해 수행할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 이 밖에 상기 프라이머 또는 프로브를 사용한 바이오마커의 농도 측정 방법에 필요한 시약이 더 포함될 수 있다. 예를 들어 RT-PCR을 수행하는데 필요한 시약, 노던블롯(northern blot)을 수행하는데 필요한 시약, 상보적 염기쌍 형성에 의한 형광의 생성 및 억제, 상보결합에 의한 구조변화 및 효소-특이적 절단 등에 필요한 시약이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 키트에는 본 발명의 조성물 이외에도 상기와 같은 농도 측정 방법에 필요한 시약, 기구 또는 장치가 더 포함될 수 있다. 예를 들어 RT-PCR, 노던블롯(northern blot) 또는 웨스턴블롯(western blot)을 수행하는데 필요한 시약, 기구 또는 장치가 더 포함될 수 있다.
본 발명의 정보제공방법은 상기와 같은 본 발명 바이오마커의 특징을 이용하여 임신중독증의 예측 또는 진단에 필요한 정확한 정보를 제공하는 방법으로, 피검자의 생물학적 시료에서 바이오마커의 농도를 측정하고 이를 정상 대조군과 비교하는 방법을 사용한다. 이때 생물학적 시료는 혈액 또는 소변 시료인 것이 바람직하다. 피검자 시료의 바이오마커 농도가 정상 대조군에 비교하여 높을 경우 임신중독증이 발생할 가능성이 높다고 예측할 수 있다. 특히 바이오마커 농도가 높을수록 더 발생위험이 높다고 예측할 수 있으며, 정상 대조군에 비교하여 1.8배 이상 농도가 높을 경우 임신중독증이 발생한 것으로 진단할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. 실험방법
1-1. 실험재료 및 동물 윤리
실험에 사용된 사람의 혈액 및 조직 검체는 강원대학교병원 생명의학윤리위원회의 가이드라인에 따라 확보하였다. 정상 임산부와 임신중독증 환자 각각 39명으로부터 채혈을 통해 혈액 검체를 확보하였다. 정상 임산부의 검체는 출산 후 30분 이내에 확보하여 얼음 상자에 보관하였다. 임신중독증 환자의 임상학적 기준은 단백뇨가 300mg/day, 혈압이 140/90mmHg이다.
1-2. 혈중 sEng, sFlt-1 그리고 PlGF의 농도 측정
혈액 내 sEng(Cat.# DNDG00), sFlt-1(Cat.# DVR100B) 그리고 PlGF(Cat.# DPG00)의 농도를 ELISA 키트(R&D systems)를 이용하여 측정하였다. 정상 임산부와 임신중독증 환자로부터 확보한 혈액으로부터의 혈청을 냉장 마이크로원심분리기에서 3,000pm으로 15분간 원심분리하여 불순물을 없애고, Calibrator Diluent 용액으로 10배 희석하였다. 표준용액은 키트의 제조회사에서 제공된 프로토콜에 따라 준비하였다. 혈액시료 내 sEng, sFlt-1 그리고 PlGF의 농도는 제조회사에서 제공된 프로토콜에 따라 측정하였다.
1-3. 혈중 miR-31-5p와 miR-155-5p의 측정
정상 임산부와 임신중독증 환자로부터 확보한 혈액으로부터의 혈청을 냉장 마이크로원심분리기에서 3,000rpm으로 15분간 원심 분리하여 불순물을 없애고, miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen, Cat. #: 217184)를 사용하여 전체 miRNA를 분리하였다. 혈청(200㎕)에 5배 부피의 Qiazol을 넣고 잘 혼합한 후, 동량의 클로로포름을 넣어 1분간 강하게 혼합하여 3분간 상온에 보관하고, 냉장 마이크로원심분리기에서 13,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. RNA가 존재하고 있는 수용액 층을 취하고, 1.5배 양의 100% EtOH을 넣어 천천히 혼합한 후, 700㎕를 취하여 RNeasy MinElute spin column으로 로딩하고 13,000rpm에서 1분간 원심 분리하였다. Column에 RWT 완충용액 700㎕, RPE 완충용액 700㎕, 80% EtOH 500㎕를 순차적으로 넣고 원심 분리하여 membrane을 씻었다. Membrane을 말리기 위해 한 번 더 원심분리한 후 14㎕의 RNase free water를 column에 넣고 원심 분리하여 miRNA를 녹여내었다. 분리한 microRNA에 Hispec 완충용액을 사용하여 3'말단을 polyadenylation 시킨 후 oligo-dT와 역전사효소를 사용해 cDNA를 합성(Qiagen, Cat. #: 218161)하여 quantitative real-time PCR(qRT-PCR)에 사용하였다. 합성된 cDNA는 miScript SYBR Green PCR kit(Qiagen, Cat. #: 218073), miR-31-5p(Qiagen, Cat. #: MS00003290)과 miR-155-5p(Qiagen, Cat. #: MS00031486)에 특이적 primer를 사용하여 qRT-PCR을 통해 각 miRNA의 농도를 측정하였다.
1-4. miR-31-5p와 miR-155-5p에 의한 유전자 발현 조절 분석
혈관내피세포(HUVEC)는 정상 산모의 탯줄로부터 분리하였고, 20% 소태아혈청(fetal bovine serum)을 포함한 M199 배지에서 배양하였으며, passage 2-7에 있는 세포를 실험에 사용하였다. 사람의 동맥 평활근세포(HASMC, Cat. #: 6110, ScienCell Research laboratories, USA)를 구입하여 20% 소태아혈청을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였으며, passage 3-5에 있는 세포를 실험에 사용하였다. 각각의 세포를 무혈청 배지에 3시간 배양하고, Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogene)를 사용하여 10nM의 control miRNA, miR-31-5p 혹은 miR-155-5p(Qiagen)를 세포 내로 4시간 동안 도입시켰다. 형질 도입된 혈관내피세포와 혈관평활근세포를 각각 24시간 혹은 48시간 배양한 후 RNA와 단백질을 분리하여 RT-PCR과 western blot을 이용하여 유전자 발현을 검증하였다. Western blot을 통한 단백질 발현 분석을 위하여 eNOS(Cat. #: 610297, BD science), sGC1β(Cat. #: 160897, Cayman chemical), 그리고 PKG(Cat. #: ADI-KAP-PK005-F, Enzo Life Sciences) 등에 대한 항체를 사용하였다. mRNA 발현 분석을 위한 PCR primer는 Bioneer (대전, 대한민국)에서 구입하였고, 핵산 서열은 다음과 같다. eNOS: GCACGAGGAACCTGTGTGAC(forward)와 TTGTCTTTCCACAGGGACGA(reverse); sGC1β: GGACCATTCTAGGGATAGA(forward)와 CCAGTCAGGAGTTCATACAT(reverse); PKG1: TTCGCCAACCTGAAGCTGTCTGA(forward)와 GCCCCCTGCATGATCTGCTTCTC(reverse).
1-5. 사람의 태반동맥 분리 및 장력 측정
정상 임산부의 출산 후 확보한 태반으로부터 탯줄과 태반에 경계에서 4cm 정도 부근에 있는 동맥을 분리하여 사용하였다. 동맥조직을 Krebs-Ringer bicarbonate 용액(118mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.2mM MgSO4, 1.2mM KH2PO4, 25mM NaHCO3, 2.5mM CaCl2, 11.1mM glucose, pH 7.4)으로 옮기고, 동맥주위에는 Warton's jelly를 조심스럽게 제거하였다. 혈관을 2mm 정도 크기로 절단하여 DMEM (1% FBS)에 24시간 안정화시키고, Lipofectamine RNAiMAX를 사용하여 80nM의 control miRNA, miR-31-5p 혹은 miR-155-5p를 4시간 동안 도입시켰다. 잔여 miRNA를 DMEM 배지로 제거하고 추가로 24시간 더 안정화시켰다. 혈관조직을 혈관장력 측정 장치의 wire stirrups(150㎛)에 걸고, organ bath에서 최적의 수축을 효과를 위하여 100mg의 장력을 주었고, KCl(100mM) 반응으로 혈관의 기능이 정상임을 확인한 뒤에 phenylephrine으로 수축반응을 일으키고 혈관이완 펩타이드인 calcitonin gene-related peptide-α(CGRP-α, Anygen Co., 광주, 대한민국)의 농도-의존적(109-105mol/L) 이완반응을 확인하였다. 최종 농도의 CGRP-α의 이완반응을 확인한 후, 혈관조직을 완충용액으로 세척하고 eNOS 저해제인 L-NAME (104mol/L, Molecular Probes, USA)을 처리하여 혈관수축이 일어남을 검증하여 혈관내피세포 의존적인 수축반응임을 재확인하였다. 모든 실험은 3반복씩 6회 수행하였다.
1-6. 통계분석
정상 임산부와 임신중독증 환자 혈액으로부터 얻은 모든 결과의 통계분석은 Prism 6(Graphpad Software, Inc.)을 활용하여 수행하였다. 통계적 유의성 검사는 Mann-Witney U-test로 분석하였고, 진단용 생체인자로서의 활용 가능성은 receiver operating characteristic (ROC) 커브 분석으로 판단하였다. P<0.05을 통계적 유의성이 있는 것으로 고려하였다.
2. 실험결과
2-1. 임신중독증 환자 혈청의 특성 검증
정상 임산부와 임신중독증 환자 각각 39명으로부터 혈액을 확보한 후, 혈액으로부터 분리한 혈청을 확보하였다. 환자의 혈청학적 특성을 확인하기 위하여 임신중독증의 혈청 바이오마커로 알려진 soluble endoglin(sEng), soluble Flt-1(sFlt-1) 그리고 placenta growth factor(PlGF)의 농도를 분석하였다. 그 결과 도 1에서와 같이 임신중독증 환자 혈청에서 sEng의 농도는 정상 임산부와 비교하여 약 3.99배(16.67ng/ml, vs. 66.56ng/ml, p<0.0001) 증가하였으며(도 1의 A), sFlt-1의 경우에는 임신중독증 환자의 혈청에서(1.41ng/ml vs. 2.47ng/ml, p<0.0001) 1.75배 증가하였다(도 1의 B). 한편, 임신중독증 환자 혈청에서 PlGF의 농도는 정상임산부와 비교하여 약 4.48배(349.10pg/ml vs. 77.97pg/ml, p<0.0001) 감소함을 보였다(도 1의 C). 이러한 결과는 본 실험을 위하여 확보한 정상 임산부와 임신중독증 환자로부터 확보한 혈청을 새로운 바이오마커 발굴에 활용할 수 있는 표준시료임을 제시하고 있다.
2-2. 임신중독증 환자 혈청에서 miR-31-5p와 miR-155-5p의 농도가 유의적으로 높음
정상 임산부와 임신중독 환자의 혈청에서 miR-31-5p와 miR-155-5p의 농도를 qRT-PCR 기법으로 측정하고, 통계적으로 비교 분석하였다. 임신중독증 환자의 혈청 내 miR-31-5p의 농도는 정상 임산부와 비교하여 2.90배(1.04 fold vs. 3.02 fold, p<0.0001) 증가하였다(도 2의 A). miR-155-5p의 경우에는 환자 혈청에서 2.48배(1.20 fold vs. 2.98 fold, p<0.0001) 증가함을 확인하였다(도 2의 B). 이러한 결과는 miR-31-5p와 miR-155-5p는 임신중독증 환자 혈청에서 유의성 있게 증가되어 있음을 제시하고 있다.
2-3. 임신중독증 환자의 혈청에서 sEng과 miR-31-5p 및 miR-155-5p의 농도 변화에는 양의 상관성이 있음
임신중독증의 혈액 단백질 중에 혈관신생 억제 인자인 sEng의 농도와 miR-31-5p와 miR-155-5p의 농도 간에 어떠한 상관성이 있는가를 검증하기 위해 통계학적 유의성을 검증하였다. 환자의 혈중 sEng과 miR-31-5p의 농도를 비교한 결과 유의성이 높은 양의 상관성(r=0.38, p<0.0001)이 있음을 확인하였다(도 3의 A). 임신중독증 환자 혈액 내 miR-155-5p의 경우에도 sEng의 농도와 유의성이 높은 양의 상관성(r=0.41, p<0.0001)을 보여 주고 있다(도 3의 B). 이러한 결과는 임산부의 혈중 miR-31-5p와 miR-155-5p의 농도변화를 추적하면 임신중독증 유발 가능성을 예측할 수 있는 진단용 바이오마커로 활용할 수 있음을 제시하고 있다.
2-4. 임신중독증 환자의 혈청에서 sFlt-1과 miR-31-5p 및 miR-155-5p의 농도 변화에는 양의 상관성이 있음
임신중독증의 혈액 단백질 중에 혈관신생 억제 인자인 sFlt-1도 중요한 바이오마커로 알려져 있다. 환자의 혈청에서 sFlt-1와 miR-31-5p 및 miR-155-5p 농도 간의 어떠한 상관성이 있는가를 검증하기 통계학적 유의성을 검증하였다. 환자의 혈중 sFlt-1과 miR-31-5p의 농도 간에는 통계학적으로 유의성이 높은 양의 상관성(r=0.30, p<0.001)이 있음을 확인하였다(도 4의 A). 뿐만 아니라 miR-155-5p의 경우에도 sFlt-1의 농도와 유의성이 높은 양의 상관성(r=0.37, p<0.0001)을 보여 주고 있다(도 4의 B). 이러한 결과는 임산부의 혈중 miR-31-5p와 miR-155-5p의 농도변화를 추적하면 임신중독증 유발 가능성을 효과적으로 예측할 수 있는 진단용 바이오마커로 활용할 수 있음을 추가적으로 제시해 주고 있다.
2-5. 임신중독증 환자의 혈중 miR-31-5p와 miR-155-5p 농도 간에도 양의 상관성이 있음
상기 결과는 miR-31-5p와 miR-155-5p를 임신중독증 진단용 바이오마커로 활용할 수 있는 가능성을 제시하고 있다. 따라서 임신중독증 환자 혈액에서 이들 두 miRNA 농도 간에 상관성이 있는가에 대한 통계학적 유의성 분석을 수행하였다. 그 결과 두 miRNA 농도 간에 양의 상관성(r=0.23, p=0.002) 있음을 확인 할 수 있었다(도 5). 이러한 결과는 이들 miRNA는 임신중독증을 진단하는 바이오마커로 활용할 수 있는 가능성이 있음을 제시하고 있다.
2-6. 임신중독증 진단용 바이오마커로서 miR-31-5p와 miR-155-5p의 활용 가능성 검증
임신중독증의 예측용 바이오마커로서의 miR-31-5p와 miR-155-5p의 활용 가능성을 검증하기 위하여 receiver operating characteristic (ROC) 곡선 분석을 수행하였다. 임산부 혈중 miR-31-5p의 농도 변화가 임신중독증 예측용 바이오마커로서의 신뢰도를 검증한 결과, 95% 신뢰구간(0.94-1.00)에서 ROC 곡선 아래의 면적(AUC)이 0.98(p<0.001)이었다(도 6의 A)(만약 면적이 1이라면 정확도가 높은 완벽한 진단용 바이오마커를 의미하고, 0.5라면 쓸모없는 바이오마커이다). miR-31-5p의 특이도와 민감도는 각각 94.87%와 92.32%이었고, 절단 값(cut-off value)는 1.81배 이었다. 한편, miR-155-5p의 혈중농도를 분석한 결과, 95% 신뢰구간(0.91-0.99)에서 AUC는 0.96(P<0.001)로 진단용 마이오마커로서의 정확도가 높음을 확인하였다(도 6의 B). miR-155-5p의 특이도와 민감도는 각각 89.74%와 92.30%이었고, 절단 값(cut-off value)는 1.64배 이었다. 이러한 분석결과는 임산부의 혈중 miR-31-5p와 miR-155-5p는 임신중독증을 예측할 수 있는 진단용 바이오마커로서 민감도와 특이도가 매우 우수하다는 것을 제시하고 있다.
또한, miR-31-5p와 miR-155-5p를 동시에 활용하는 다중 진단법의 정확도를 확인하기 위하여 ROC 커브 분석을 수행하였다. miR-31-5p와 miR-155-5p를 이용한 다중 진법법의 경우 95% 신뢰구간(0.91-0.99)에서 AUC는 0.97(P<0.001)로 진단법의 정확도가 높음을 확인하였다(도 6의 C). 특이도와 민감도는 각각 91.0%와 92.3%이었고, 절단 값(cut-off value)는 1.80배 이었다. 따라서 miR-31-5p와 miR-155-5p를 이용한 다중 분석법은 miR-155-5p 단독 진단법과 비교하여 정확도가 유사하거나 약간 우수하였으나, miR-31-5p 단독 진단법 보다는 우수하지 못하였다.
2-7. miR-31-5p와 miR-155-5p는 endothelial niric oxide synthase(eNOS)/soluble guanylyl cyclase-1β(sGC1β)/cGMP-dependent protein kinase G1(PKG1)의 발현을 억제함
혈관계에서 eNOS/sGC/PKG 경로는 혈압 조절에 핵심적인 역할을 한다. 따라서 miR-31-5p와 miR-155-5p가 혈압조절 경로의 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하였다. miR-31-5p를 혈관내피세포 내로 도입하였을 때 eNOS의 발현이 현저하게 감소하였으며, 이종 이량체로 알려진 sGC의 소단위체인 sGC1α와 sGC1β의 발현은 억제하지 못하였다(도 7의 A). 한편, miR-155-5p를 세포 내로 도입한 혈관내피세포에서는 eNOS와 sGC1β의 발현을 효과적으로 억제하였다(도 7의 A). 혈관, miR-155-5p는 혈관평활근세포에서 sGC1β와 PKG1의 발현을 효과적으로 억제하였으나, miR-155-5p는 이들 유전자의 발현에 아무런 영향을 주지 못하였다(도 7의 B). 이러한 결과는 miR-31-5p와 miR-155-5p는 혈관이완을 조절하는 유전자의 발현을 억제하여 고혈압을 유발할 수 있음을 제시하고 있다.
2-8. 임신중독 환자의 혈관 조직에서 eNOS와 cGC1β의 발현이 감소됨
정상 임산부와 임신중독증 환자로부터 확보한 탯줄 조직에서 eNOS와 sGC1β의 발현 양상을 분석하기 위하여 RT-PCR과 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 환자의 혈관조직에서 eNOS mRNA 발현은 정상 임산부 조직에 비해 38%(P<0.0001) 감소하였다(도 8의 A 및 B). 한편, sGC1β의 발현은 환자 조직에서 29%(P<0.0001) 감소되어 있었다(도 8의 A 및 C). 이러한 결과는 임신중독증 환자의 고혈압은 eNOS/sGC의 경로의 이상과 상관성이 높다는 것을 제시하고 있다.
2-9. miR-31-5p와 miR-155-5p에 의한 혈관이완 억제
miR-31-5p와 miR-155-5p가 혈관이완을 억제하여 고혈압을 유발할 수 있는 가능성을 연구하기 위하여 사람의 태반동맥을 분리하여, 이들 miRNA을 도입하고 혈관의 장력을 측정하였다. 대조군의 경우 혈관이완 펩타이드인 CGRP-α의 농도에 의존적으로 혈관이완이 유도되었고, 이러한 이완 효과는 miR-31-5p의 도입에 의해 유의성 있게 감소되었다(도 9의 A). 이와 유사하게, miR-155-5p에 의해서 혈관이완이 유의성 있게 감소되었다(도 9의 B). 이러한 결과는 임신중독증 환자의 혈중에 증가된 miR-31-5p와 miR-155-5p는 혈관이완을 억제하여 고혈압을 유발할 수 있음을 제시하고 있다.
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Claims (6)

  1. miR-31-5p의 농도 측정 물질을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 농도 측정 물질은 상기 miR-31-5p의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 조성물을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 키트.
  4. 피검자의 생물학적 시료에서 miR-31-5p 농도를 측정하는 단계; 및
    상기 miR-31-5p 농도를 정상 대조구 시료의 miR-31-5p 농도와 비교하는 단계;를 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단에 필요한 정보제공방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액 또는 소변 시료인 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 miR-31-5p 농도의 측정은 miR-31-5p의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 사용한 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, 노던블롯, 마이크로어레이, 형광공명에너지전이 또는 제한효소 특이적 절단 분석을 수행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
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