KR102326813B1 - 임신중독증의 예측 또는 진단을 위한 바이오마커로서의 miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p - Google Patents

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Abstract

본 발명은 임신중독증의 예측 또는 진단을 위한 바이오마커로서의 miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p에 관한 것으로, 구체적으로 피검자의 시료에서 miR-214-3p 및 miR-1290-3p 중에서 선택된 하나 이상의 마이크로RNA의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 임신중독증 예측 또는 진단을 위한 정보제공 방법, miR-214-3p 또는 miR-1290-3p의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물, 및 이 조성물을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명을 통해 제공되는 임신중독증 바이오마커, 즉 miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p는 민감도와 특이도가 매우 우수하며, 혈액 또는 혈청에서 측정할 수 있어 안전하고 쉽게 적용할 수 있고, 기존의 바이오마커와 상관성이 있어 병용할 경우 보다 신뢰도를 높일 수 있다는 장점도 있다. 따라서 본 발명의 정보제공 방법, 조성물 또는 키트를 이용하면 여성, 특히 한국 여성의 임신중독증을 매우 효과적으로 예측 또는 진단할 수 있다.

Description

임신중독증의 예측 또는 진단을 위한 바이오마커로서의 miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p{miRNA-214-3p and miRNA-1290-3p as biomarker for predicting or diagnosing pre-eclampsia}
본 발명은 임신중독증의 예측 또는 진단을 위한 바이오마커로서의 miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p에 관한 것으로, 구체적으로 피검자의 시료에서 miR-214-3p 및 miR-1290-3p 중에서 선택된 하나 이상의 마이크로RNA의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 임신중독증 예측 또는 진단을 위한 정보제공 방법, miR-214-3p 또는 miR-1290-3p의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물, 및 이 조성물을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 키트에 관한 것이다.
2005년 미국의 임신성 사망률 조사 분석에 따르면, 100,000명의 출산 태아 당 14.5명이 임신 중 사망하였으며, 이러한 사망률은 매년 조금씩 증가하는 추세를 보이고 있다. 이러한 사망률은 산모의 나이와 관련성이 높으며, 30대 후반이 되면 급격하게 증가되고 있다. 이러한 사망의 원인으로서는 출혈, 감염, 혈전으로 인한 폐색전증, 심근병증, 심혈관질환, 비심혈관질환, 임신성 고혈압 등이 있으며, 이들 각 원인은 태아사망의 10 내지 13%에 해당되고 있다. 이들 원인 중에서도 태아사망에 가장 큰 원인은 임신성 고혈압인 것으로 알려져 있다.
임신성 고혈압은 단백뇨를 동반하는 것으로 알려져 있으며, 일반적으로 임신 20주 이후에 단백뇨(≥300㎎/day)를 동반하는 고혈압(≥140/90mmHg) 질환을 임신중독증으로 정의하고 있다. 이러한 질환은 전 세계적으로 총 임산부 중 2 내지 8% 확률로 발병되며, 산모와 태아 사망률의 주된 기여 인자로 알려져 있다.
임신중독증이 발병되면 뚜렷한 치료제는 없고, 유일한 해결방안은 미성숙한 상태로 자연분만하거나 제왕절개 수술로 출산을 유도하는 것이다. 따라서 임신중독증 유발의 위험인자를 갖고 있는 임산부의 경우에는 식이조절 및 운동 등을 통하여 질환의 발병을 예방하는 것이 최선의 방안으로 알려져 있다. 그러므로 질환의 위험인자를 조기에 진단하는 것이 필수적이다.
임신중독증의 위험인자 및 원인은 명료하게 밝혀진 바는 없으나, 혈관신생을 억제하는 sFlt1(soluble VEGF 수용체-1)과 sEng(soluble TGF-β 수용체)의 생성이 증가하고, 혈관신생을 촉진하는 PlGF(태반성장인자)의 생성이 감소되어 태아에게 산소와 영양분을 공급하는 나선동맥 확장과 혈관생성의 억제가 중요한 원인으로 추정되고 있다. 따라서 이들 인자의 농도변화를 측정하여 임신중독증을 진단하려는 많은 노력이 있었으며, sFlt1/PlGF 비를 이용하면 임신중독증을 진단할 수 있는 확률이 높다고 보고되었다.
최근 연구결과에 따르면 임신중독증을 포함한 다양한 질환의 발병 및 진행과정에 특정한 miRNA가 관련되고 있음이 보고되고 있으며, 이들 miRNA는 혈액을 따라 순환되고 있어 진단용 바이오마커로 활용하고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 선행연구를 기반으로 임신중독증의 효과적인 예측 또는 진단을 위한 miRNA 바이오마커를 개발하고자 하였다.
Berg CJ, Callaghan WM, Syverson C, Henderson Z. Pregnancy-related mortality in the United States, 1998 to 2005. Obstet Gynecol. 2010. 116:1302-1209. English FA, Kenny LC, McCarthy FP. Risk factors and effective management of preeclampsia. Integr Blood Press Control. 2015. 8:7-12. Rana S, Lemoine E, Granger JP, Karumanchi SA. Preeclampsia: Pathophysiology, Challenges, and Perspectives. Circ Res. 2019. 124:1094-1112. Zeisler H, Llurba E, Chantraine F, Vatish M, Staff AC, Sennstrom M, Olovsson M, Brennecke SP, Stepan H, Allegranza D, Dilba P, Schoedl M, Hund M, Verlohren S. Predictive Value of the sFlt-1:PlGF Ratio in Women with Suspected Preeclampsia. N Engl J Med. 2016, 374:13-22. Bolla D, Papadia A, Raio L. The sFlt-1:PlGF ratio in women with suspected preeclampsia. N Engl J Med. 2016, 374:1785. Alhasan AH, Scott AW, Wu JJ, Feng G, Meeks JJ, Thaxton CS, Mirkin CA. Circulating microRNA signature for the diagnosis of very high-risk prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 2016. 113:10655-11660. Fredsøe J, Rasmussen AKI, Thomsen AR, Mouritzen P, Høyer S, Borre M, Ørntoft TF, Sørensen KD. Diagnostic and prognostic microRNA biomarkers for prostate cancer in cell-free urine. Eur Urol Focus. 2018. 4:825-833.
따라서 본 발명의 주된 목적은 임신중독증의 효과적인 예측 또는 진단을 위한 새로운 miRNA 바이오마커를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용한 임신중독증 예측 또는 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용한 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오마커를 이용한 임신중독증 예측 또는 진단용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 피검자의 시료에서 miR-214-3p 및 miR-1290-3p 중에서 선택된 하나 이상의 마이크로RNA의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 임신중독증 예측 또는 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 정보제공 방법에 있어서, 상기 정보제공 방법은 한국 여성을 위한 것임이 바람직하다.
본 발명의 정보제공 방법에 있어서, 상기 시료는 혈액 또는 혈청인 것이 바람직하다.
본 발명의 정보제공 방법에 있어서, 피검자의 시료에서 측정된 상기 마이크로RNA의 농도를 정상 대조구 시료에서 측정된 해당 마이크로RNA의 농도와 비교하는 것이 바람직하다.
본 발명의 정보제공 방법에 있어서, 피검자의 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도가 정상 대조구 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도 보다 높은 경우 또는 피검자의 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도가 정상 대조구 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도 보다 낮은 경우 임신중독증 발병 고위험군 또는 임신중독증 발병군으로 분류하는 것이 바람직하다.
본 발명의 정보제공 방법에 있어서, 피검자의 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도가 정상대조구 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도의 1.250배 이상인 경우 또는 피검자의 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도가 정상 대조구 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도의 0.595배 이하인 경우 임신중독증 발병 고위험군 또는 임신중독증 발병군으로 분류하는 것이 바람직하다.
본 발명의 정보제공 방법에 있어서, 상기 피검자의 시료는 임신 14주 이후의 시기에 채취된 것이 바람직하다.
본 발명의 정보제공 방법에 있어서, 상기 miR-1290-3p의 농도 측정을 필수로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-214-3p 또는 miR-1290-3p의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 한국 여성을 위한 것임이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 농도를 측정하는 수단은 상기 마이크로RNA 또는 이의 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 키트는 한국 여성을 위한 것임이 바람직하다.
본 발명의 키트에 있어서, 정상대조구 시료를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명을 통해 제공되는 임신중독증 바이오마커, 즉 miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p는 민감도와 특이도가 매우 우수하며, 혈액 또는 혈청에서 측정할 수 있어 안전하고 쉽게 적용할 수 있고, 기존의 바이오마커와 상관성이 있어 병용할 경우 보다 신뢰도를 높일 수 있다는 장점도 있다. 따라서 본 발명의 정보제공 방법, 조성물 또는 키트를 이용하면 여성, 특히 한국 여성의 임신중독증을 매우 효과적으로 예측 또는 진단할 수 있다.
도 1은 정산 임산부(HP)와 임신중독증 환자(PE)의 혈청에서 sFlt-1, sEng 및 PlGF의 농도, 및 sFlt1/PlGF 비율을 분석한 결과이다.
도 2는 정산 임산부(HP)와 임신중독증 환자(PE)의 혈청에서 miR-214-3p 및 miR-1290-3p의 농도를 분석한 결과이다.
도 3은 임신중독증 환자의 혈중 sFlt1/PlGF 비율과 miR-214-3p 및 miR-1290-3p의 농도변화의 상관성을 분석한 결과이다.
도 4는 miR-214-3p 및 miR-1290-3p의 바이오마커로서의 민감도 및 특이도를 분석한 결과이다.
도 5는 임신중독증 환자의 임신 기간별 miR-214-3p 또는 miR-1290-3p의 발현을 분석한 결과이다.
본 발명은 본 발명자에 의해 새롭게 밝혀진 연구결과를 바탕으로 안출된 것으로, 임신중독증의 예측 또는 진단 바이오마커로 miR-214-3p 또는 miR-1290-3p를 이용하는 것을 특징으로 한다.
연구결과를 정리하면 다음과 같다.
1. 임신중독증 환자의 혈액 내 miRNA-214-3p의 농도는 정상 임산부와 비교하여 유의성 있게 증가되어 있다.
2. 임신중독증 환자의 혈액 내 miRNA-1290-3p의 농도는 정상 임산부와 비교하여 유의성 있게 감소되어 있다.
3. miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p의 농도는 기존에 알려진 바이오마커인 sFlt-1와 PlGF의 농도비(sFlt-1/PlGF)와 각각 양 및 음의 상관성이 있다.
4. ROC 곡선 분석에 의하면 이들 miRNA는 임신중독증의 예측 또는 진단을 위한 바이오마커로서 민감도와 특이도가 매우 우수하다.
5. 따라서 임산부의 혈중 miRNA-214-3p 또는 miRNA-1290-3p의 농도 변화를 이용하면, 임신중독증 발병 및 진행 정도를 진단하거나 예측할 수 있다.
상기와 같은 연구결과를 바탕으로 본 발명은 피검자의 시료에서 miR-214-3p 및 miR-1290-3p 중에서 선택된 하나 이상의 마이크로RNA의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 임신중독증 예측 또는 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p에 관한 정보는 마이크로 RNA 데이터베이스인 miRBase(http://www.mirbase.org) 등을 통해 잘 알려져 있다. miRNA-214-3p는 miRNA-214의 성숙형(mature) miRNA 중 하나로 대표적으로 인간(Homo sapiens)의 miRNA-214-3p 서열은 서열번호 1과 같다. miRNA-1290-3p 또한 miRNA-1290의 성숙형(mature) miRNA로 대표적으로 인간(Homo sapiens)의 miRNA-1290-3p 서열은 서열번호 2와 같다.
본 발명의 정보제공 방법에서 상기 마이크로RNA의 농도는 기존에 알려진 통상적인 miRNA의 농도 측정방법을 통해 확인할 수 있다. 예를 들어, miRNA-214-3p 또는 miRNA-1290-3p에 대한 정량적 실시간 PCR, 마이크로어레이 발현 프로파일링(microarray expression profiling), 노던블롯(northern blot) 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 정보제공 방법은 여성, 바람직하게는 한국 여성, 바람직하게는 임산 여성의 임신중독증을 예측 또는 진단하기 위한 것이다. 따라서 본 발명의 정보제공 방법에서 피검자는 여성, 바람직하게는 한국 여성, 바람직하게는 임신 여성이다.
본 발명의 정보제공 방법은 시료로 혈액 또는 혈청을 사용할 수 있어 채취가 어려운 시료, 예를 들어 태아 유래의 시료 또는 태반 조직 등의 시료를 사용하는 기존의 방법에 비해 안전하고 쉽게 수행할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 정보제공 방법에서 시료는 바람직하게는 혈액 또는 혈청이다.
본 발명의 정보제공 방법에서 피검자의 시료와 정상대조구의 시료에서 상기 마이크로RNA 농도를 측정하고 각 농도를 비교하는 방법으로 임신중독증의 발병 위험도 또는 임신중독증 발명 여부에 관한 정보를 제공할 수 있다. 보다 구체적으로 피검자의 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도가 정상 대조구 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도 보다 높은 경우 또는 피검자의 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도가 정상 대조구 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도 보다 낮은 경우 임신중독증 발병 고위험군 또는 임신중독증 발병군으로 분류할 수 있다. 바람직하게는 피검자의 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도가 정상 대조구 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도의 1.250배 이상인 경우, 예를 들어 정상 대조구 시료의 miR-214-3p 농도를 1로 환산했을 때 피검자 시료의 miR-214-3p 농도가 1.250 이상인 경우, 또는 피검자의 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도가 정상 대조구 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도의 0.595배 이하인 경우, 예를 들어 정상 대조구 시료의 miR-1290-3p 농도를 1로 환산했을 때 피검자 시료의 miR-1290-3p 농도가 0.595 이하인 경우를 임신중독증 발병 고위험군 또는 임신중독증 발병군으로 분류한다.
본 발명의 연구결과에 따르면, 임신 중기(2nd trimester, 임신 14 내지 26주)부터 피검자와 정상대조구의 상기 마이크로RNA 농도 차이가 보다 명확하게 나타난다. 따라서 보다 신뢰도 높은 정보제공을 위해 피검자의 시료는 바람직하게는 임신 14주 이후, 즉 14주를 포함한 그 후에 채취된 것이다.
또한, 본 발명의 연구결과에 따르면, miR-214-3p 보다는 miR-1290-3p의 민감도와 특이도가 높다. 따라서 보다 신뢰도 높은 정보제공을 위해 바람직하게는 miR-1290-3p의 농도 측정을 필수로 한다.
상기와 같은 연구결과를 바탕으로 본 발명은 또한 miR-214-3p 또는 miR-1290-3p의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물 또한 상기 정보제공 방법에서와 마찬가지로 여성, 바람직하게는 한국 여성, 바람직하게는 임신 여성의 임신중독증을 예측 또는 진단하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물에서 상기 농도를 측정하는 수단은 상기 마이크로RNA의 농도를 측정하기 위한 기존의 방법에 필요한 상기 각 마이크로RNA 특이적 물질일 수 있으며, 바람직하게는 상기 마이크로RNA 또는 이의 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이다. 예를 들어, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 통해 miR-214-3p 또는 miR-1290-3p의 농도를 확인하기 위한 용도의 상업적 프라이머를 이용할 수 있다. 이 밖에 상기 마이크로RNA의 서열을 기반으로 하는 칩(chip) 등과 같은 상기 마이크로RNA의 검출 수단 또한 여기에 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물에는 상기와 같은 miR-214-3p 또는 miR-1290-3p의 농도를 측정하는 수단 이 외에도 이 수단을 사용하여 농도 측정을 수행하는데 필요한 시약이 더 포함될 수 있다. 예를 들어 qRT-PCR을 수행하는데 필요한 시약, 마이크로어레이 칩 분석을 수행하는데 필요한 시약, 노던블롯을 수행하는데 필요한 시약 등이 더 포함될 수 있다.
상기와 같은 연구결과를 바탕으로 본 발명은 또한 상기와 같은 조성물을 포함하는 임신중독증 예측 또는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트 또한 마찬가지로 여성, 바람직하게는 한국 여성, 바람직하게는 임신 여성의 임신중독증을 예측 또는 진단하기 위한 것이다.
본 발명의 키트에는 본 발명의 조성물 이외에도 상기와 같은 농도 측정에 필요한 시약, 기구 또는 장치가 더 포함될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. 실험방법
1-1. 실험재료 및 동물 윤리
실험에 사용된 사람의 혈액 및 조직 검체는 강원대학교병원 생명의학윤리위원회의 가이드라인에 따라 확보하였다. 정상 임산부와 임신중독증 환자 각각 92명으로부터 채혈을 통해 혈액 검체를 확보하였다. 임산부의 혈액은 항응고제가 포함된 진공 튜브에 채취하였다. 임신중독증 환자의 임상학적 기준은 단백뇨가 ≥300㎎/day, 혈압이 ≥140/90mmHg이다.
1-2. 혈중 sEng, sFlt-1 및 PlGF의 농도 측정
혈액 내 sEng(Cat.# DNDG00), sFlt-1(Cat.# DVR100B) 및 PlGF(Cat.# DPG00)의 농도 ELISA 키트(R&D systems)를 이용하여 측정하였다. 정상 임산부와 임신중독증 환자로부터 확보한 혈액을 냉장 마이크로원심분리기에서 3,000rpm으로 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하고, Calibrator Diluent 용액으로 10배 희석하였다. 표준용액은 키트의 제조회사에서 제공된 프로토콜에 따라 준비하였다. 혈액시료 내 sEng, sFlt-1 및 PlGF의 농도는 제조회사에서 제공된 프로토콜에 따라 측정하였다.
1-3. 혈중 miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p의 측정
정상 임산부와 임신중독증 환자로부터 확보한 혈액의 혈청을 냉장 마이크로원심분리기에서 3,000rpm으로 15분간 원심분리하여 불순물을 없애고, miRNeasy Serum/Plasma kit(Qiagen, Cat.#: 217184)를 사용하여 전체 miRNA를 분리하였다. 혈청(200㎕)에 5배 부피의 Qiazol을 넣고 잘 혼합한 후, 동량의 클로로포름을 넣어 1분간 강하게 혼합하고 3분간 상온에 보관하고, 냉장 마이크로원심분리기에서 13,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. RNA가 존재하는 수용액 층을 취하고, 1.5배 양의 100% EtOH을 넣어 천천히 혼합한 후, 700㎕를 취하여 RNeasy MinElute spin column에 로딩하고 13,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 컬럼에 RWT 완충용액 700㎕, RPE 완충용액 700㎕, 80% EtOH 500㎕를 순차적으로 넣고 원심분리하여 막(membrane)을 씻었다. 막을 말리기 위해 한 번 더 원심분리한 후 14㎕의 RNase free water를 컬럼에 넣고 원심 분리하여 miRNA를 녹여내었다. HiSpec 완충용액을 사용하여 분리한 miRNA의 3' 말단을 폴리아데닐화(polyadenylation)시킨 후 oligo-dT와 역전사효소를 사용하여 cDNA를 합성(Qiagen, Cat.#: 218161)하여 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR: qRT-PCR)에 사용하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하고 miScript SYBR Green PCR kit(Qiagen, Cat.#: 218073), miRNA-214-3p 또는 miRNA-1290-3p에 특이적인 프라이머(Qiagen, Cat.#: MS00031605, MS00014518)를 사용한 qRT-PCR을 통해 각 miRNA의 농도를 측정하였다.
1-4. 통계분석
정상 임산부와 임신중독증 환자 혈액으로부터 얻은 모든 결과의 통계분석은 Prism 6(Graphpad Software, Inc.)을 활용하여 수행하였다. 통계적 유의성 검사는 Two-tailed Student's t test로 분석하였고, P<0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 고려하였다. 한편, 혈중 miRNA의 농도를 활용한 진단검사의 정확도(민감도 및 특이도) 및 특성 평가는 receiver operating characteristic(ROC) 커브 분석법을 활용하여 하였다.
2. 실험결과
2-1. 임신중독증 환자 혈청의 특성 검증
본 실험을 위하여 정상 임산부와 임신중독증 환자 각각 92명으로부터 혈액을 확보한 후, 혈액으로부터 분리한 혈청을 확보하였다. 환자의 혈청학적 특성을 확인하기 위하여 임신중독증의 혈청 바이오마커로 알려진 soluble Flt-1(sFlt-1), soluble endoglin(sEng) 그리고 placental growth factor(PlGF)의 농도를 측정하였다. 그 결과 도 1에서와 같이 임신중독증 환자 혈청에서 sFlt1의 농도는 정상 임산부와 비교하여 약 2.7배(2.56±0.06ng/㎖, vs. 0.95±0.05ng/㎖, P<0.0001) 증가하였으며(도 1 A), sEng의 경우에는 임신중독증 환자의 혈청에서(67.62±3.43ng/㎖ vs. 15.58±1.03ng/㎖, P<0.0001) 4.3배 증가하였다(도 1 B). 한편, 임신중독증 환자 혈청에서 PlGF의 농도는 정상임산부와 비교하여 약 5.5배(81.42±4.07pg/㎖ vs. 452.40±20.94pg/㎖, P<0.0001) 감소함을 보였다(도 1 C). 임신중독증 진단 및 예측 가능성이 높은 것으로 보고되고 있는 sFlt1/PlGF 비율을 비교한 결과 환자의 경우 정상 임산부와 비교하여 4.6배(38.39±1.93 vs. 2.71±0.26, P<0.0001) 높았다(도 1 D). 이러한 결과는 본 실험을 위하여 정상 임산부와 임신중독증 환자로부터 확보한 혈청을 새로운 바이오마커 발굴에 활용할 수 있음을 제시한다.
2-2. 임신중독증 환자 혈청에서 miR-214-3p 및 miR-1290-3p의 농도 확인
정상 임산부와 임신중독증 환자의 혈청에서 miR-214-3p 및 miR-1290-3p의 농도를 qRT-PCR 기법으로 측정하고, 통계적으로 비교 분석하였다. 임신중독증 환자의 혈청 내 miRNA-214-3p의 농도는 정상 임산부와 비교하여 2.8배(2.60±0.12fold vs. 0.92±0.06fold, P<0.0001) 증가하였다(도 2 A). miR-1290-3p의 경우에는 환자 혈청에서 3.9배(0.36±0.02fold vs. 1.01±0.05fold, P<0.0001) 감소하였다(도 2 B). 이러한 결과는 임신중독증 환자 혈청에서 miRNA-214-3p는 유의하게 증가하고, miRNA-1290-3p는 유의하게 감소함을 제시한다.
2-3. 임신중독증 환자의 혈청 내 miR-214-3p 및 miR-1290-3p의 농도와 sFlt1/PlGF 비율과의 상관성 조사
임신중독증 환자의 혈중 sFlt1와 PlGF의 농도비(sFlt1/PlGF 비율값)는 질환의 발병 예측 및 진단 수단으로 활용성이 높음이 보고되고 있다. 따라서 환자의 혈중 sFlt1/PlGF 비율과 miR-214-3p 및 miR-1290-3p의 농도변화의 상관성을 분석하였다. 그 결과 sFlt1/PlGF 비율값과 miR-214-3p 간에는 양의 상관성(r=0.471, P<0.0001)이 있고(도 3 A), miR-1290-3p 농도 간에는 음의 상관성(r=-0.324, P=0.0016)이 있음을 확인하였다(도 3 B). 이러한 결과는 임산부의 혈중 miRNA-214-3p와 miRNA-1290-3p의 농도변화를 추적하면 임신중독증 유발 가능성을 예측할 수 있고, 따라서 이들을 양과 음의 진단용 바이오마커로 활용할 수 있음을 제시한다.
2-4. 임신중독증 진단용 바이오마커로서 miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p의 활용 가능성 검증
임신중독증 환자의 혈액에서 농도가 높은 miR-214-3p와 농도가 낮은 miR-1290-3p를 질병의 유발과 진행을 예측하기 위한 바이오마커로 활용할 수 있는지 검증하기 위해, ROC 곡선과 이를 이용한 통계분석을 수행하였다. 곡선 아래의 면적인 AUC(area under the ROC curve) 값이 1.0에 가까울수록 진단용 바이오마커로 활용가능성이 높고, AUC 값이 0.5 이하이면 바이오마커로서의 활용 가치가 낮다고 볼 수 있다. miRNA-214-3p와 miRNA-1290-3p의 AUC 값은 0.924(95% 신뢰 구간: 0.887-0.962, P<0.0001)와 0.957(95% 신뢰 구간: 0.931-0.984, P<0.0001)로 각각 확인되었다. 따라서 이들 miRNA는 임신중독증을 진단하거나 예측할 수 있는 바이오마커로 활용 가치가 매우 높다고 판단된다. 양의 진단용 바이오마커로 활용 가능성이 높은 miR-214-3p의 민감도는 90.22%, 특이도는 79.35%이였고, 음의 진단용 바이오마커로 활용이 가능한 miR-1290-3p의 민감도는 94.57%, 특이도는 84.78%이였다. 이러한 결과는 miR-214-3p와 miR-1290-3p가 임신중독증의 예방 또는 진단을 위한 바이오마커로 활용 가능성이 높고, 이 중에서도 음의 바이오마커인 miR-1290-3p가 miR-214-3p 보다 우수한 바이오마커임을 제시한다.
한편, 개별 바이오마커에 대한 컷-오프(cut-off, 절단값 혹은 역치값) 값을 확인한 결과, miR-214-3p의 경우 1.250이었고 miR-1290-3p의 경우에는 0.595였다. 그러므로 임산부의 혈액에서 miR-214-3p의 농도가 1.250배 이상이거나, miR-1290-3p의 농도가 0.595배 이하이면 임신중독증 발병의 신뢰성 구간에 해당된다고 판단할 수 있다. 반대로 miR-214-3p의 농도가 1.250배 미만이거나, miR-1290-3p의 농도가 0.595배 초과면 임신중독증 발병 위험의 신뢰성이 룰아웃(rule-out)될 수 있다.
2-5. 임신중독증 조기진단 및 예측용 바이오마커로서 miRNA-214-3p 및 miRNA-1290-3p의 활용 가능성 검증
임신 기간별 miRNA의 발현 양상을 분석하기 위하여 8명의 환자 혈액을 분석하였다. 예상된 바와 같이 miRNA-214-3p의 발현은 임신 2기에 유의성 있게 증가하였으며, 임신 2기와 3기에서는 큰 차이를 보이지 않았다(도 5 A). 이와 반대로 miR-1290-3p의 경우에는 임신 2기에 발현이 감소하였으며, 임신 2기에서 보다 3기에서는 감소되는 정도가 다소 커지는 것으로 나타났다(도 5 B). 따라서 이들 miRNA는 임신중독증의 증상이 유발되는 시기와 매우 유사한 발현 양상을 보이고 있다. 임신중독증은 임신 2기 이후에 발병하는 질환임으로, 확보된 miRNA는 조기진단 및 예측용 표적 분자로 활용할 수 있는 가능성이 있음을 제시하고 있다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> miRNA-214-3p and miRNA-1290-3p as biomarker for predicting or diagnosing pre-eclampsia <130> ALP20013 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 acagcaggca cagacaggca gu 22 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 uggauuuuug gaucaggga 19

Claims (14)

  1. 피검자의 혈액 또는 혈청 시료에서 miR-214-3p 및 miR-1290-3p 중에서 선택된 하나 이상의 마이크로RNA의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 한국 여성의 임신중독증 예측 또는 진단을 위한 정보제공 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    피검자의 시료에서 측정된 상기 마이크로RNA의 농도를 정상 대조구 시료에서 측정된 해당 마이크로RNA의 농도와 비교하는 것을 특징으로 하는 정보제공 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 피검자의 시료는 임신 14주 이후의 시기에 채취된 것이며,
    피검자의 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도가 정상 대조구 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도 보다 높은 경우 또는 피검자의 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도가 정상 대조구 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도 보다 낮은 경우 임신중독증 발병 고위험군 또는 임신중독증 발병군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 정보제공 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    피검자의 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도가 정상 대조구 시료에서 측정된 miR-214-3p의 농도의 1.250배 이상인 경우 또는 피검자의 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도가 정상대조구 시료에서 측정된 miR-1290-3p의 농도의 0.595배 이하인 경우 임신중독증 발병 고위험군 또는 임신중독증 발병군으로 분류하는 것을 특징으로 하는 정보제공 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 miR-1290-3p의 농도 측정을 필수로 하는 것을 특징으로 하는 정보제공 방법.
  9. miR-214-3p 또는 miR-1290-3p의 농도를 측정하는 수단을 포함하는 혈액 또는 혈청 시료를 사용하는 한국 여성의 임신중독증 예측 또는 진단용 조성물.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    상기 농도를 측정하는 수단은 상기 마이크로RNA 또는 이의 cDNA의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제9항 또는 제11항의 조성물을 포함하는 혈액 또는 혈청 시료를 사용하는 한국 여성의 임신중독증 예측 또는 진단용 키트.
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서,
    정상 대조구 시료를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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