TWI738089B

TWI738089B - 判定發生子癇前症之風險之方法

Info

Publication number: TWI738089B
Application number: TW108137569A
Authority: TW
Inventors: 宣昶有; 林衛理; 簡佳雯; 張文茵; 冠達盧
Original assignee: 宣捷幹細胞生技股份有限公司
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-09-01
Also published as: TW202117328A

Abstract

本發明係提供一種判定發生子癇前症之風險之方法，包含：偵測一懷孕女性個體之體液樣本之miRNA181a-5p和miRNA210-3p之水平；以及分別比較該miRNA181a-5p和miRNA210-3p之水平與一正常標準值並判定發生子癇前症之風險。

Description

判定發生子癇前症之風險之方法

本發明係關於一種判定懷孕女性發生子癇前症之風險之方法。

子癇前症係一種妊娠疾病，始於懷孕後20周，並具有高血壓以及尿液蛋白濃度升高2倍或於24小時內累積5克(蛋白尿)、全身水腫、噁心、嘔吐、視線模糊、體重突增等特徵。若無及時診斷及治療，可造成胎盤早破並導致胎兒死亡或發育不良。

近年來，並無單一檢測方法可預測或診斷子癇前症，或預期其發展之嚴重度。具體而言，子癇前症係診斷孕婦是否具有高血壓(至少間隔4小時測量，140/90毫米汞柱以上)、以及24小時尿液樣本中高於300毫克之蛋白質(蛋白尿)。腫脹或水腫(特別是位於臉和手)長期以來亦被認為是診斷子癇前症之重要病徵。因此子癇前症之推定診斷係依據一致性的子癇前症特徵，但在觀察到分娩後的症狀消退之前，通常不可能進行確定性診斷。

因此，為預防疾病發展以及減小子癇前症對於胎兒和母體之傷害，亟需研發精準偵測和診斷子癇前症之方法。

為解決上述問題，本發明之目的係提供判定懷孕女性發生子癇前症風險之方法，其特徵在使用miRNA181a-5p為標誌。

一方面，本發明提供一種體外檢測一懷孕女性個體之體液樣本判定發生子癇前症之風險之方法，包括以下步驟：偵測該體液樣本之miRNA181a-5p之水平；以及比較該miRNA181a-5p之水平與一正常標準值並判定發生子癇前症之風險。

根據本發明實施例，其中該體液係選自母乳、血液、血清、血漿、腹水、囊液、胸膜液、腹膜液、腦脊液、淚液、尿液、唾液、痰液、及其組合所構成之群組。

根據本發明實施例，其中該體液樣本係採集自第一或第三孕期之懷孕女性個體。

根據本發明之一實施例，其中若第一孕期之懷孕女性個體之體液樣本之miRNA181a-5p水平低於該正常標準值，表示該懷孕女性個體具有發生子癇前症之風險。

根據本發明之另一實施例，其中若第三孕期之懷孕女性個體之體液樣本之miRNA181a-5p水平高於該正常標準值，表示該懷孕女性個體具有發生子癇前症之風險。

根據本發明之一實施例，該體外檢測一懷孕女性個體之體液樣本判定發生子癇前症之風險之方法，另包含以下步驟：偵測該體液樣本之miRNA210-3p之水平；以及比較該miRNA210-3p之水平與一正常標準值並判定發生子癇前症之風險。

根據本發明一實施例，其中若第一孕期之懷孕女性個體之體液樣本之miRNA210-3p水平低於該正常標準值，表示該懷孕女性個體具有發生子癇前症之風險。

根據本發明另一實施例，其中若第三孕期之懷孕女性個體之體液樣本之miRNA210-3p水平高於該正常標準值，表示該懷孕女性個體具有發生子癇前症之風險。

以下參照圖式說明本發明的實施方式，以明確闡釋前述和其他技術內容、特徵、和功效。藉由特定實施例的說明，習知技術者可進一步明瞭本發明採取的技術手段和功效，以達成前述發明目的。另，本說明書所公開的技術可為習知技術者理解並且實施，在不悖離本發明概念的前提下，任何變更或改良均可被權利要求所涵蓋。

若無特別定義，本說明書全部技術和科學用語均與本發明所屬技術領域具有通常知識者所理解具有相同意義。本說明書揭示例示性之實施例，但任何與本發明實施例相同或相似之方法、設備、和材料，均可應用於本發明並實施。

本說明書用語「一」、「一種」、和「該」，於實施例及請求項均指涉「一或多」。因此，以此類推，例如「一種微小RNA」可指涉複數個該微小RNA。

本說明書用語「約」指涉包含使用之設備或方法判斷某數值所產生之標準差之數值。

本說明書用語「診斷」係指涉習知技術者評估和判斷一個體是否罹患特定疾病或病理狀況的方法。習知技術者可依據一或多診斷指標進行診斷，例如生物標記(如微小RNA表現量)，其存在與水平可指示該疾病或病理狀況之存在與否或其嚴重度。

微小RNA(MicroRNA)為自然產生、短片段之非編碼RNA，約17至25個核苷酸所組成並形成具有生物活性之型態。藉由抑制目標mRNA的轉譯，微小RNA可轉錄後(post-transcriptionally)調控基因表現。因此微小RNA通常為負調控；即，較多的微小RNA水平導致較低之目標基因表現量。

於本說明書，特定微小RNA可以其字首(mir-)及其編號而辨識，例如miRNA181。微小RNA之目標可能為特定轉錄RNA的任何位置。但，序列之3端非轉譯區最為常見。特定微小RNA之命名包含三字母之字首(mir-)，而後為特定指示該微小RNA的序號。

特定微小RNA之縮寫可包含辨識其所屬物種之字首，例如hsa代表人類(homo sapiens )。於本說明書，若無特別指示，微小RNA均指涉人類之微小RNA。

本說明書用語「子癇前症」係依據已建立之判準所定義，包含但不限於：血壓至少140/90毫米汞柱、和24小時內尿液蛋白量超過0.3克(g)，分別相隔4-6小時測量。

根據本發明，該體外檢測一懷孕女性個體之體液樣本判定發生子癇前症之風險之方法，包含以下步驟：偵測一懷孕女性個體之體液樣本之miRNA181a-5p之水平；以及比較該miRNA181a-5p之水平與一正常標準值並判定發生子癇前症之風險。

根據本發明，其中使用於本發明方法之體液樣本可選自由下列組成之群組之體液：母乳、血液、血清、血漿、腹水、囊液、胸膜液、腹膜液、腦脊液、淚液、尿液、唾液、痰液、及其組合。

如圖1所示，依據本發明方法偵測，於第一孕期之懷孕女性個體之體液樣本之miRNA181a-5p水平低於該正常標準值，表示該懷孕女性個體具有發生子癇前症之風險，具差異顯著性 (p > 0.05 )。

如圖1所示，若第三孕期之懷孕女性個體之體液樣本之miRNA181a-5p水平高於該正常標準值，表示該懷孕女性個體具有發生子癇前症之風險，具差異顯著性(p > 0.01 )。

於一較佳實施例，本發明之體外檢測一懷孕女性個體之體液樣本判定發生子癇前症之風險之方法包括：檢測miRNA181a或miRNA210。

於一更佳實施例，本發明之體外檢測一懷孕女性個體之體液樣本判定發生子癇前症之風險之方法包括：檢測miRNA181a和miRNA210。

於一更佳實施例，本發明之體外檢測一懷孕女性個體之體液樣本判定發生子癇前症之風險之方法包括：檢測miRNA181a和miRNA210；以及測量受試者之BMI。

本說明書用語「低於…」係指涉低於正常值之至少5%、10%、15%、20%、25%、或30%之水平。於一較佳實施例，「低於…」係指涉低於正常值之至少5%之水平。

本說明書用語「高於…」係指涉高於正常值之至少5%、10%、15%、20%、25%、或30%之水平。於一較佳實施例，「高於…」係指涉高於正常值之至少5%之水平。

於本發明之一實施例，取自懷孕女性個體之診斷樣本之微小RNA水平係與一正常標準值比較，其中該正常標準值係定義為：取自健康懷孕女性個體(並無發生子癇前症)之樣本之微小RNA之平均水平。該正常標準值可能依據多種因素而不同，包含但不限於人種、年齡、孕期、或其他生理因子。例如，亞洲人之正常標準值和歐洲人之正常標準值相異；第一孕期之孕婦之正常標準值和第二、第三孕期之孕婦之正常標準值相異。

於實施本發明之方法之診斷套組，該正常標準值係藉由一控制組所提供。

實施例1 檢測miRNA181a-5p並判定發生子癇前症之風險

取自正常和子癇前症前期之女性之血液樣本係於台灣三軍總醫院，藉由第一、第二、和第三孕期之產前檢查收集獲得。將血清自血液以離心(4°C、500 g、20分鐘)分離，並立即儲存於-20°C，以待下次實驗使用。子癇前症前期係定義為：新及持續的舒張壓高於90毫米汞柱，以及尿液樣本中新及持續的蛋白尿高於500 mg/24小時(無尿道感染)。

成熟的hsa-miRNA181a-5p微小RNA寡聚物由Genedragon公司依據微小RNA資料庫(miRBase)所合成： MIMAT0000256 (Accession number) 5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’ (23 bp)(SEQ ID NO: 1)

依據上開序列，使用微小RNA 設計軟體(miRNA Design Tool software)設計用於定量PCR(qPCR)的引子寡聚物，並自Genedragon公司取得PAGE等級之粉末形式寡聚物。使用0.1%之TE緩衝液回溶引子，濃度為10µM。引子序列揭示於表1。

表1

名稱	序列(5’-3’)	長度	SEQ ID No:
hsa-miRNA181a-5p Stem Loop	GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACACTCAC	50	SEQ ID NO: 2
hsa-miRNA181a-5p正向引子	GGAACATTCAACGCTGTCG	19	SEQ ID NO: 3
泛用反向引子	GTGCAGGGTCCGAGGT	16	SEQ ID NO: 4

自血清樣本萃取微小RNA之方法包含下列步驟。

將200微升(μl)之血清樣本混合60μl之RPL緩衝液，再加入控制組(Spike-in control (Cel-mir-39))，以及加入20μl之RPP緩衝液，並劇烈震盪。將上述混合物以12,000g於室溫離心3分鐘。取230μl之上清液，混合等量之異丙醇，再放入離心管柱(spin column)中離心。而後分離析出液並加入700μl之RWT緩衝液。重複以500μl之RPE緩衝液和500μl 80% 之乙醇離心，再於清洗後在管柱中央加入14μl之無RNA分解酶(RNase)水，以及將血清離心以析出微小RNA。最終產物可立即使用或長期儲存於-80°C。

取10μl微小RNA萃取產物用於反轉錄反應。於200μl微離心管混合以下試劑：10μl miRNA、4μl反轉錄酶反應緩衝液、0.5μl RNase抑制劑、1μl 無RNase水、2μl 去氧核苷酸混合物、0.5μl 反轉錄酶、hsa-miRNA181a-5p引子各10μl，總反應體積為20μl。反應混合物進行PCR之條件如下：55°C 30分鐘，再85°C 5分鐘，最後停留於4°C。反轉錄產物可長期儲存於-20°C。

qPCR之反應包含：5μl之cDNA模板、10μl SYBR Green I反應混合、1μl泛用反向引子、1μl正向引子、和3μl ddH₂ O，總反應體積為20μl。反應混合物使用儀器QuantStudio5 Real-time PCR System Instrument分析，反應條件設定為：50 °C 2分鐘，再95°C 10分鐘，循環1次。而後，95°C 15秒，再60°C 1分鐘，重複45循環。最後步驟之熔化曲線(melting curve)則為：每秒0.15°C升溫至95°C。

使用曼-惠特妮U檢定(Mann-Whitney U test)進行統計和分析，並比較分別相同孕期之控制組和實驗組之懷孕母體。

實驗結果揭示於圖1。

微小RNA取自72名懷孕女性之血清，各於第一孕期至第三孕期連續追蹤：其中68名血壓正常、無其他症狀(正常組別)，以及其中4名發生子癇前症(PE組別)，PE組別其中一者於第一孕期後即中斷。另取137名第三孕期孕婦之血清，包含122名正常組別和15名PE組別(包含於樣本中)。而後使用qPCR定量和分析hsa-miRNA181a-5p水平。結果揭示PE組別於第一孕期，hsa-miRNA181a-5p之水平顯著地低於正常組別；而PE組別於第三孕期，hsa-miRNA181a-5p之水平顯著地高於正常組別(P值分別為P>0.05、P>0.01)。於第二孕期並無顯著差異。P值依據曼-惠特妮U檢定計算。

實施例2 檢測miRNA210-3p並判定發生子癇前症之風險

成熟的hsa-miRNA210-3p微小RNA寡聚物由Genedragon公司依據微小RNA資料庫(miRBase)所合成： MIMAT0000267 (Accession number) 5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’ (23 bp)(SEQ ID NO: 5)

依據上開序列，使用微小RNA 設計軟體(miRNA Design Tool software)設計用於定量PCR(qPCR)的引子寡聚物，並自Genedragon公司取得PAGE等級之粉末形式寡聚物。使用0.1%之TE緩衝液回溶引子，濃度為10µM。引子序列揭示於表2。

表2

名稱	序列(5’-3’)	長度	Seq ID No:
hsa-miRNA210-3p Stem Loop	GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACTCAGCC	50	SEQ ID NO: 6
hsa-miRNA210-3p 正向引子	GTTTCTGTGCGTGTGACAG	19	SEQ ID NO: 7
泛用反向引子	GTGCAGGGTCCGAGGT	16	SEQ ID NO: 4

自血清樣本萃取微小RNA之方法與實施例1相同，於此不再贅述。

取10μl微小RNA萃取產物用於反轉錄反應。於200μl微離心管混合以下試劑：10μl miRNA、4μl反轉錄酶反應緩衝液、0.5μl RNase抑制劑、1μl 無RNase水、2μl 去氧核苷酸混合物、0.5μl 反轉錄酶、hsa-miRNA210-3p引子各10μl，總反應體積為20μl。反應混合物進行PCR之條件如下：55°C 30分鐘，再85°C 5分鐘，最後停留於4°C。反轉錄產物可長期儲存於-20°C。

實驗結果揭示於圖2。

微小RNA取自72名懷孕女性之血清，各於第一孕期至第三孕期連續追蹤：其中68名血壓正常、無其他症狀(正常組別)，以及其中4名發生子癇前症(PE組別)，PE組別其中一者於第一孕期後即中斷。另取137名第三孕期孕婦之血清，包含122名正常組別和15名PE組別(包含於樣本中)。而後使用qPCR定量和分析hsa-miRNA210-3p水平。結果揭示PE組別於第一孕期，hsa-miRNA210-3p之水平顯著地低於正常組別；而PE組別於第三孕期，hsa-miRNA210-3p之水平顯著地高於正常組別(P值分別為P>0.05、P>0.001)。於第二孕期並無顯著差異。P值依據曼-惠特妮U檢定計算。

實施例3

分別統計受試者處於第一孕期時，miRNA181a和miRNA210之檢測結果和發生子癇前症之關聯。另針對相同受試者，統計BMI和發生子癇前症之關聯。結果揭露於表3。

於本實施例，BMI若大於24.9視為子癇前症陽性；BMI若小於24.9視為子癇前症陰性。但本發明不限於此，習知技術者可自行調整依據BMI判斷子癇前症陽性或陰性之臨界值。

表3

檢測方法	第一孕期AUC(Area Under Curve)
miRNA181a	0.749
miRNA210	0.719
BMI	0.875
miRNA181a和miRNA210	0.750
miRNA181a、miRNA210、和BMI	0.911

相較於單一標的檢測，若將miRNA181a、miRNA210、和BMI均納入檢測標的，可獲得較精確之結果(AUC較高)。

具體而言，若將miRNA181a、miRNA210、和BMI均納入檢測標的，其AUC可達0.911。檢測miRNA181a、miRNA210、和BMI與發生子癇前症之關聯之結果揭露於表3和表4。可自結果得知，若miRNA181a、miRNA210、和BMI三者均為陽性，即miRNA181a和miRNA210之水平低於該正常標準值(第一孕期)或高於該正常標準值(第三孕期)且BMI，有極高之可能將罹患子癇前症。反之，若三者均為陰性，則罹患子癇前症之風險較低。

表4

miRNA181a、miRNA210、和BMI組合之參數
AUC	臨界值	敏感性	特異性
0.911	≧0.0496	100%	78%
≧0.0709	83%	88%
≧0.1318	50%	94%
≧0.1783	33%	97%

於本說明書較佳實施例揭示之內容，本發明所屬領域具有通常知識者可明顯得知前述實施例僅為例示；具本發明所屬技術領域通常知識者可藉由諸多變換、替換而實施，而不與本發明之技術特徵有所差異。依據說明書實施例，本發明可有多種變換仍無礙於實施。本說明書提供之請求項界定本發明之範圍，該範圍涵蓋前述方法與結構及與其相等之發明。

茲配合圖示，習知技術者可更佳地理解前述發明內容以及下文之本發明實施方式。本發明之較佳實施例係揭示於圖式，使本發明得以被說明。

圖1揭示依據量化PCR之結果，比較正常以及罹患子癇前症之母體，於第一、第二、和第三孕期之miRNA-181-5p水平(曼-惠特妮U檢定(Mann-Whitney U test))(PE：子癇前症；1st、2nd、3rd：第一、第二、第三孕期)。

圖2揭示依據量化PCR之結果，比較正常以及罹患子癇前症之母體，於第一、第二、和第三孕期之miRNA-210-3p水平(曼-惠特妮U檢定(Mann-Whitney U test))(PE：子癇前症；1st、2nd、3rd：第一、第二、第三孕期)。

Claims

一種體外檢測一懷孕女性個體之第一孕期之體液樣本判定發生子癇前症之風險之方法，包含以下步驟：偵測該體液樣本之miRNA181a-5p之水平；以及比較該miRNA181a-5p之水平與一正常標準值並判定發生子癇前症之風險，若該miRNA181a-5p之水平低於該正常標準值，表示該懷孕女性個體具有發生子癇前症之風險；其中該正常標準值係定義為取自健康懷孕女性個體之體液樣本之miRNA181a-5p之平均水平。
如請求項1所述之方法，其中該體液係血液、血清、或血漿。
如請求項1所述之方法，另包含以下步驟：偵測該體液樣本之miRNA210-3p之水平；以及比較該miRNA210-3p之水平與一正常標準值並判定發生子癇前症之風險，若該miRNA210-3p之水平低於該正常標準值，表示該懷孕女性個體具有發生子癇前症之風險；其中該正常標準值係定義為取自健康懷孕女性個體之樣本之miRNA210-3p之平均水平。
如請求項3所述之方法，另包含以下步驟：測量該懷孕女性個體之身高體重指數(BMI)；以及依據BMI判定發生子癇前症之風險，其中若BMI大於24.9視為子癇前症陽性。