KR101879499B1

KR101879499B1 - 후성유전학적 바이오마커 hyp2 및 이를 포함하는 임신 중 고혈압성 장애 진단용 조성물

Info

Publication number: KR101879499B1
Application number: KR1020160091619A
Authority: KR
Inventors: 류현미; 박소연; 김신영; 김현진
Original assignee: 의료법인 제일의료재단
Priority date: 2016-07-19
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2018-07-18
Also published as: KR20180009863A

Abstract

본 발명은 임신부 혈장 내의 총 세포-유리 DNA의 후성유전학적 마커, HYP2(GenBank Accession No.: NC_00013.11) 유전자의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 임신 중 고혈압성 장애(hypertensive disorders of pregnancy, HDP) 진단용 조성물, 진단용 키트 및 상기 HYP2 유전자를 이용한 임신 중 고혈압성 장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, HYP2 유전자의 농도의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 임신 중 고혈압성 장애 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

후성유전학적 바이오마커 HYP2 및 이를 포함하는 임신 중 고혈압성 장애 진단용 조성물{Epigentic marker HYP2 and compositions for diagnosis of hypertensive disorders of pregnancy comprising the same}

임신 중 고혈압성 장애(hypertensive disorders of pregnancy)는 임신과 합병된 고혈압, 자간전증, 자간증, 임신성 고혈압 등을 포함한다. 모태 및 태아의 주산기 사망의 주요한 원인이 되며, 전체 임산부의 5~8%를 차지할 정도로 큰 비중을 차지하고 있으며, 대표적인 주요 증상으로는 고혈압, 부종 및 임신중독성 요 단백질량의 증가, 심한 두통 및 갑작스런 체중 증가 등이 있다.

이러한 임신 중 고혈압성 장애는 대체로 20주 이후에 발생하고 조산의 주요한 원인이 되기도 한다. 그러나 현재까지 이의 정확한 발병원인과 치료방법은 명확하게 규명되어 있지 않으며, 분만 외에는 뚜렷한 치료 방법이 없다. 그러나 임신 초기에 임신 중 고혈압성 장애가 발생하였을 경우, 이른 분만은 태아의 사망률을 높일 수 있기 때문에 조기에 진단하여 최대한 임신을 유지하면서 환자를 관리하는 것이 최선의 방법이 될 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 질환으로 인해 유발되는 태아의 조산 및 이로 인한 태아의 사망률을 감소시키기 위해 조기 진단이 요구되고 있다.

임신 중 고혈압성 장애를 예측하고 진단하기 위한 바이오마커를 찾기 위한연구가 이루어지고 있으며, 최근까지 몇몇 마커가 제안된 바 있으나, 아직까지 임상적 예측 또는 진단의 유용성이 입증되지 않은 상태로 지속적인 연구가 이루어질 필요가 있다.

대한민국등록특허 제10-1535737호에서는 miRNA 발현을 측정하여 임신 중 고혈압성 장애 중 하나인 자간전증을 진단하는 방법에 대해 개시하고 있고, 대한민국등록특허 제10-1356894호에서는 가용성 엔도글린의 농도 또는 생물학적 활성을 측정하여 임신성 합병증을 진단하는 방법에 대해 개시하고 있으나, 임신 초기에 비침습적인 방법을 이용하여 유전자 수준에서 높은 정확도로 임신 중 고혈압성 장애를 진단해내기 위한 바이오마커가 더욱 개발될 필요가 있다.

본 발명의 목적은 임신부 혈장 내의 총 세포-유리 DNA의 후성유전학적 마커, HYP2(GenBank Accession No.: NC_00013.11) 유전자의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 임신 중 고혈압성 장애(hypertensive disorders of pregnancy, HDP) 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는 임신 중 고혈압성 장애 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 임신 중 고혈압성 장애가 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 HYP2 유전자의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 임신 중 고혈압성 장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 임신 중 고혈압성 장애 치료제 후보물질을 처리하기 전과 후의 HYP2 유전자의 농도 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 임신 중 고혈압성 장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 구현예는 임신부 혈장 내의 총 세포-유리 DNA의 후성유전학적 마커, HYP2(GenBank Accession No.: NC_00013.11) 유전자의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 임신 중 고혈압성 장애(hypertensive disorders of pregnancy, HDP) 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "총 세포-유리 DNA의 후성유전학적 마커"는 임신 중 고혈압성 장애 발병에 따른 임신부 혈장내 태아 DNA 증가뿐 아니라 산모 DNA도 증가하는 특성을 고려하여, 임신부 혈장내 태아 DNA와 산모 DNA를 모두 검출할 수 있는 마커로, 특정 유전자 부위를 의미한다. 총 세포-유리 DNA의 후성유전학적 마커는 비침습적 산전 검사에 유용하게 이용될 수 있다. 총 세포-유리 DNA의 후성유전학적 마커를 이용하여 임신부 혈액 중 태아·산모 DNA를 검출하고 그의 존재량을 측정하는 것에 의해 임신부의 질환 유무를 검사할 수 있다.

본 발명에서, "HYP2"는 총 세포-유리 DNA(cell-free total DNA, cfDNA)를 확인하는 유전자로써 13번 염색체 상의 20719831-20719952 영역에 위치하며, GenBank Accession No.: NC_00013.11로 표시된다. 모체 혈액 뿐 아니라 태반에서도 과메틸화(hypermethylated)되어 있으나, 임신에 따른 부작용을 진단하기 위해 활용될 수 있는지에 대해서는 보고된 바 없다.

또한, 임신중독증에 용혈(hemolysis, H), 간기능장애(elevated liver enzymes, EL), 혈소판 감소(low platelets, LP)가 합병된 질환을 각 증상의 머리문자를 따서 통칭한 헬프증후군(HELLP syndrome) 환자군에서 총 세포-유리 DNA(cell-free total DNA, cfDNA)의 수준이 정상 대조군에 비해 증가되어 있는 것이 보고된 바 있으나, 구체적으로 HYP2 유전자가 임신 관련 질환과 어떠한 관계가 있는지는 밝혀진 바 없다.

본 발명 일 실시예에서는 임신부 혈장 내에서 HYP2 유전자를 검출하는 방법을 이용하여 정상 대조군에 비해 임신 중 고혈압성 장애 환자군의 경우 임신 초기부터 HYP2 유전자의 농도가 증가되어 있는 것을 확인하여, 상기 질환에 대한 진단 마커로서 사용될 수 있음을 확인하였다(표 4). 특히, 자간전증 및/또는 임신성 고혈압 환자군의 경우, 임신 6-14주 및 15-23주에서 정상 대조군에 비해 HYP2 유전자의 농도가 현저히 높게 나타남을 확인하였다. 이에 따라, HYP2 유전자가 상기 자간전증 및/또는 임신성 고혈압을 포함하는 임신 중 고혈압성 장애를 진단해낼 수 있는 바이오마커로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서, "유전자 농도"란, 특정 유전자가 그 자체로 존재하는 정도를 말한다. 본 발명에서는 총 세포-유리 DNA의 후성유전학적 마커, HYP2 유전자의 농도를 관찰함으로써 임신 중 고혈압성 장애의 진단이 조기에 비침습적인 방법으로 용이하게 이루어질 수 있도록 하였다.

HYP2 유전자의 농도는 임신 중 고혈압성 장애가 의심되는 환자의 태반 또는 모체 혈액 시료로부터 측정할 수 있으나, 세포-유리 DNA(cell-free DNA, cfDNA)를 검출해낼 수 있는 시료이면 충분하고, 상기 시료에 한정되는 것은 아니다. 상기 임신 중 고혈압성 장애는 자간전증 또는 임신성 고혈압일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, "임신 중 고혈압성 장애(hypertensive disorders of pregnancy, HDP)"란, 임신 중 나타나는 임신부 및 태아의 건강과 관계가 있는 합병증으로 자간전증(preeclampsia, PE), 임신성 고혈압(gestational hypertension, GH) 등을 포함한다.

본 발명에서, "자간전증(preeclampsia, PE)"이란, 임신 20주 이후에 고혈압(140/90mmHg 이상)과 단백뇨(1일 뇨증 0.3g 이상 및/또는 dipstick testing 1+ 이상)가 발생한 것을 의미한다. 자간전증은 임신성 고혈압(gestational hypertension)과 달리 많은 융합영양막결절(syncytial knots), 높은 비율의 탈락막 맥관장애(decidual vasculopathy) 및 융모경색(villus infarction)을 나타낸다. 태반 허혈(ischemia) 역시 자간전증과 관련이 있다. 나아가, 자간전증의 경우, 내피기능이상(endothelial dysfunction) 및 혈관형성 촉진 요소(pro-angiogenic factor) 또는 항-혈관신생요소(anti-angiogenic factor)간의 불균형이 나타나, 태아 사망까지도 유도될 수 있는 위험성이 큰 질환이다.

본 발명에서, "임신성 고혈압(gestational hypertension, GH)"이란, 임신 20주 이후 단백뇨 없이, 임신 기간 중에 수축기 혈압이 140mmHg 이상 또는 확장기 혈압이 90mmHg 이상이고 단백뇨를 동반하지 않는 경우로, 분만 후 12주 이내에 정상 혈압이 되는 경우를 말한다. 임신성 고혈압의 약 15~25%에서 단백뇨가 발생하여 자간전증으로 이행된다. 또한, 조기에 발병하거나 이전에 유산 경험이 있는 임신성 고혈압의 경우 자간전증으로의 이행이 비교적 높은 것으로 알려져 있다.

또한 구체적으로, 본 발명에서 유전자의 농도를 측정하는 제제는 HYP2에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

더욱 구체적으로 상기 프라이머는 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍일 수 있으며, 상기 프로브는 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 HYP2의 농도를 측정하였으며, 본 발명의 임신 중 고혈압성 장애 진단용 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응 수행을 위한 완충액, dNTP 혼합물, 및 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 실시간 중합효소연쇄반응은 표적 핵산의 증폭과 측정을 동시에 진행한다. 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 산물로부터 발생하는 신호, 예를 들면, 형광의 강도를 실시간으로 측정하므로, 전통적인 중합효소연쇄반응에 비해 신속하고 민감하게 결과를 확인할 수 있다. 또한, 증폭 산물의 분석을 위한 전기영동이나 서열결정과 같은 추가적인 단계를 필요로 하지 않는다. 상기 임신 중 고혈압성 장애는 자간전증 또는 임신성 고혈압일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 상기 HYP2에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 qPCR 증폭을 실시하여 농도를 확인함으로써 자간전증 및/또는 임신성 고혈압의 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서, "프로브(probe)"는 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)이 프로브의 말단에 부착될 수 있다. 본 발명 일 실시예에서, 프로브는 5' 말단에는 형광물질이 부착되고, 3' 말단에는 소광물질이 부착되어 있다.

상기 형광물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 소광물질은 6-TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ(Black Hole Quencher)-1, BHQ-2, BH3-3, 및 ROX(carboxy-X-rhodamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또 다른 본 발명의 일 구현예는 상기 임신 중 고혈압성 장애 진단용 조성물을 포함하는 임신 중 고혈압성 장애 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 환자 시료 내 HYP2 유전자의 농도를 측정할 수 있는 제제 뿐 아니라, 농도 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 유전자의 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 프로브, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 임신 중 고혈압성 장애는 자간전증 또는 임신성 고혈압일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 본 발명의 일 구현예는 a) 임신 중 고혈압성 장애가 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 HYP2 유전자의 농도를 측정하는 단계; b) 상기 HYP2 유전자의 농도를 정상 대조군의 시료와 비교하는 단계; 및 c) 측정된 HYP2 유전자의 농도가 정상 대조군 보다 높은 경우 임신 중 고혈압성 장애로 진단하는 단계를 포함하는, 임신 중 고혈압성 장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 임신 중 고혈압성 장애는 자간전증 또는 임신성 고혈압일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 임신 중 고혈압성 장애가 의심되는 환자의 생물학적 시료는 환자의 태반 또는 모체 혈액 시료로부터 측정할 수 있으나, 세포-유리 DNA(cell-free DNA, cfDNA)를 검출해낼 수 있는 시료이면 충분하고, 상기 시료에 한정되는 것은 아니다.

본 발명 일 실시예에서는 HYP2 유전자를 이용한 임신 초기 검출 비율을 관찰하였으며, 자간전증에 대해서는 0.682 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.557-0.790), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 32.8% 및 45.2%를 나타내었다. 또한, 임신성 고혈압에 대해서는 0.675 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.557-0.778), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 25.8% 및 36.3%를 나타내었다. 이로부터 HYP2 유전자가 임신 초기인 임신 1분기에 임신 중 고혈압성 장애를 진단하기 위한 후성유전학적 바이오마커로 활용될 수 있음을 확인하였으며, 특히 구체적으로 자간전증 및/또는 임신성 고혈압을 진단해낼 수 있음을 확인하였다(표 5).

또 다른 본 발명의 일 구현예는 a) 임신 중 고혈압성 장애 환자의 생물학적 시료에 임신 중 고혈압성 장애 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 b) 상기 시료에서 상기 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 HYP2 유전자의 농도 변화를 측정하는 단계를 포함하는, 임신 중 고혈압성 장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 임신 중 고혈압성 장애는 자간전증 또는 임신성 고혈압일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명 일 실시예에서는 자간전증 또는 임신성 고혈압을 포함하는 임신 중 고혈압성 장애 환자의 경우, 정상 대조군에 비해 HYP2 유전자의 농도가 현저히 증가되어 있음을 확인하였다(표 4). 이에 따라, 상기 질환의 치료 후보물질을 처리한 후 증가되어 있던 HYP2 유전자의 농도가 감소된 경우 자간전증 또는 임신성 고혈압을 포함하는 임신 중 고혈압성 장애를 치료할 수 있는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명은 임신부 혈액 시료에서 추출한 세포-유리 DNA로부터 후성유전학적 마커인 HYP2 유전자의 농도를 측정함으로써 비침습적인 방법을 통해 자간전증 또는 임신성 고혈압 등을 포함하는 임신 중 고혈압성 장애를 진단하는데 활용될 수 있다. 특히, 자간전증 또는 임신성 고혈압의 증상이 나타나기 이전인 초기 단계에서 상기 질환을 진단해냄으로써 조기에 임신중독증의 위험으로부터 벗어날 수 있도록 한다.

도 1은 임신 1분기 및 임신 3분기 시기의 정상 대조군 및 자간전증 환자군(PE)의 DSCR3 내의 각 CpG 부위에서의 DNA 메틸화 수준을 나타낸 것이다. 역삼각형 표시는 CpG 부위를 나타낸 것이며, 붉은색 피크는 염기 T, 푸른색 피크는 염기 C를 나타낸 것이다. qPCR 반응이 일어난 부위는 밑줄로 표시하였으며, 메틸화 된 CpG 부위는 서열 내에 노란 음영의 붉은 글씨로 표시하였다.
도 2는 임신 1분기 및 임신 3분기 시기의 정상 대조군 및 자간전증 환자군(PE)의 HYP2 내의 각 CpG 부위에서의 DNA 메틸화 수준을 나타낸 것이다. 역삼각형 표시는 CpG 부위를 나타낸 것이며, 붉은색 피크는 염기 T, 푸른색 피크는 염기 C를 나타낸 것이다. qPCR 반응이 일어난 부위는 밑줄로 표시하였으며, 메틸화 된 CpG 부위는 서열 내에 노란 음영의 붉은 글씨로 표시하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 연구 대상의 선정

본 연구는 제일병원 의학연구심의위원회(IRB)의 승인을 받아 진행하였으며(#CGH-IRB-2013-54), 2010년 8월부터 2014년 8월까지 제일병원 산부인과를 내원한 임신부를 대상으로 본 연구의 목적을 설명하고 동의를 얻어 환자-대조군 연구(nested case-control study)를 수행하였다. 스크리닝의 일부로서 11-13주 임신부 혈청 내의 PAPP-A(pregnancy-associated plasma protein A) 수준 및 15-20주 임신부 혈청 내의 4가지 마커인 AFP, uE3, β-hCG, 및 InhA를 통상자동분석기(routine automated analyzer)를 이용하여 측정하였다. 임신 주수 및 모체 체질량지수(body mass index, BMI)를 조정한 후 상기 측정값을 중앙값(multiples of median, MoM)으로 조정하였다.

임신성 고혈압(Gestational hypertension, GH) 17명, 자간전증(Preeclampsia, PE) 34명 및 정상 임신부 84명, 총 135명을 대상으로 하였다. 6-14주 및 15-23주의 임신부를 대상으로부터 혈액을 채취하였으며, 임신 1분기 및 임신 3분기의 태반 시료를 혈액 시료와 쌍으로 채취하였다. 임신 1분기 태반 시료는 융모막 융모 생검법(chorionic villus sampling)을 이용하여 채취하였으며, 임신 3분기 태반 시료는 분만 후 태반 조직을 이용하였다. 임신 중 고혈압성 장애(hypertensive disorders of pregnancy, HDP)는 자간전증 및 임신성 고혈압인 모든 환자군을 총칭하며, 임신성 고혈압 17명 및 자간전증 34명 총 51명의 환자가 임신 중 고혈압성 장애에 해당된다.

자간전증(Preeclampsia,PE)은 임신 20주 이후에 고혈압(140/90mmHg 이상)과 단백뇨(1일 뇨증 0.3g 이상 및/또는 dipstick testing 1+ 이상)가 발생한 경우로 정의하였다. 임신 20주 이후 단백뇨 없이 고혈압 증상을 가지는 임신부는 임신성 고혈압(Gestational hypertension, GH)으로 진단하였다. 또한, 정상 임신부는 의학적 또는 산과적 합병증이 없는 만삭 임산부(37주 이상)로 정의하였다. 만성 고혈압, 당뇨병, 자간전증, 간질환, 만성 신장 질환의 기왕력(history)이 있는 경우 연구 대상에서 제외하였다.

각 연구 그룹(정상 대조군, 임신성 고혈압(GH), 자간전증(PE) 임신 중 고혈압성 장애(HDP))의 특징은 하기 표 1에 나타내었다. 각 그룹 간의 임신부 나이, 초산(nulliparity), 시료 채취 시의 임신 주기, 태아 성별, 음주 및 흡연에 대해서는 통계적 차이가 없었다. 그러나, 모든 환자군의 경우, 임신 전 체질량지수가 정상 대조군에 비해 높았다.

또한, 예상한 바와 같이, 정상 대조군에 비해 환자군의 경우 높은 수축기 혈압(systolic blood pressure, SBP) 및 확장기 혈압(diastolic blood pressures, DBP)을 나타냈다. 반면, 분만시 임신 주수 및 신생아 체중이 현저히 낮게 나타났다.

생화학적 마커의 중앙값을 관찰하였을 때, GH 환자군에서는 정상 대조군보다 uE3의 수치는 현저히 낮았으며, InhA 수치는 현저히 높았다. 또한, PE 환자군의 경우, 정상 대조군 보다 PAPP-A 수치가 현저히 낮게 나타났으며, HDP 환자군의 경우 정상 대조군에 비해 PAPP-A 수치가 현저히 낮고 InhA 수치는 현저히 높았다.

실시예 2. DNA 추출 및 메틸화 DNA의 농축(Enrichment)

모체 혈액 10ml를 채취한 후 EDTA 튜브에 넣고 4℃ 1,600 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후 상층액을 4℃ 16,000 g에서 10분 동안 재원심분리한 후 DNA 추출을 위해 1 mL씩 분주(aliquot)하였다. 모체 혈액 및 태반 조직으로부터 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 세포-유리 DNA(cell-free DNA)는 상기 분주된 1 mL 시료로부터 QIAamp DSP Virus Kit(Qiagen)를 이용하여 추출하였다.

MethylMiner^TM 메틸화 DNA 추출 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여, 임신부 혈장으로부터 추출된 세포-유리 DNA(cell-free DNA, cfDNA)에서 메틸화된 세포-유리 DNA를 추출하였다. MBD(methyl-CpG binding domain)-비오틴 단백질(3.5 ㎍)을 10 ㎕ Dynabeads M-280 Streptavidin에 상온에서 1시간 동안 결합시킨 후, MBD-자성 비드 컨쥬게이트를 3회 세척하고 1 부피(volume)의 1X Bind/Wash 완충액에 재현탁시켰다. 회전 믹서 상에서 30 ㎕의 추출된 순환(circulating) DNA를 MBD-자성 비드에 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 포획(capture) 반응을 수행하였다. 그 후, 비드를 1X Bind/Wash 완충액으로 3회 세척하고, 결합된 메틸화 DNA를 용리 완충액 중 증가되는 NaCl 농도[600 mM, 1,000 mM, and 2,000 mM NaCl]를 이용하여 메틸화 DNA를 단계적으로 추출하였다. 추출된 메틸화 DNA는 DNA 농축키트(Zymo research corp., Irvine, Ca, USA)를 이용하여 농축시키고, 30 ㎕의 최종 부피로 용해시켰다. 키트에 포함된 대조군 DNA(메틸화 DNA 및 비메틸화 DNA)를 이용하여 메틸화 DNA의 추출을 확인하였다.

실시예 3. 바이설파이트 직접 염기서열결정( Bisulfite direct sequencing)

논문,「Quantification and Application of Potential Epigenetic Markers in Maternal Plasma of Pregnancies with Hypertensive Disorders.」(Kim HJ et al., Int J Mol Sci. 2015 Dec 15;16(12):29875-88)에 기재된 방법으로 타일링 어레이를 수행하여 확인된 태아 특이적 후성유전학적 마커인 세포-유리 태아 DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA) DSCR3 및 총 세포-유리 DNA(cell-free total DNA, cfDNA)의 후성학적 마커인 HYP2의 메틸화 패턴을 확인하기 위하여, 바이설파이트 직접 염기서열 시퀀싱을 진행하였다.

임신 1분기(n=3) 및 임신 3분기(n=3) 시기에 있는 정상 임신부(n=6) 및 임신 1분기(n=3) 및 임신 3분기(n=3) 시기에 있는 자간전증이 있는 임신부(n=6) 각각의 그룹으로부터 채취된 태아 태반 및 모체 혈액 각 3쌍의 시료에서 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 Genomic DNA를 추출하였다.

추출한 Genomic DNA 1 ug을 EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)를 이용하여 바이설파이트-전환시켰다. 그 후 바이설파이트-전환된 DNA를 PCR 증폭시켰다. PCR 반응을 위한 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타난 바와 같다.

PCR 반응 용액은 20 ㎕의 총 반응 부피당 10 ng 게놈 DNA, 10 pM 프라이머, 0.25 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1 X 완충액, 및 0.25 U Taq 폴리머라아제를 포함하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분 동안의 예비변성, 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서의 40초로 이루어진 사이클 35회, 및 72℃에서 10분의 최종 연장을 포함하였다. PCR 증폭 후에, 제조사의 설명서에 따라 PCR 정제 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR 산물을 정제하고, PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 서열을 결정하였다.

서열결정 산물은 ABI 3130XL Genetic Analyzer(Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 분석하고, Genescan 소프트웨어 버전 5.3(Applied Biosystems, Inc.)을 이용하여 전기영동도 기록(electropherogram trace)을 해석하였다.

타겟 부위 [GenBank ID]	서열		서열번호
DSCR3 [NC_000021.9] chr21: 37257167-37257536; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh38.p2)	정방향 프라이머	5'- GTAAATATATGTAAAAATAGGAAGTG -3'	1
	역방향 프라이머	5'- CTTTTACTACATATAACTACACCCCC -3'	2

DSCR3 에 있는 모든 CpG 부위가 모체 혈액 세포에서는 전혀 메틸화되어 있지 않은 반면, 태반 조직에서 뚜렷하게 메틸화되어 있음을 확인함에 따라, 태아-특이적인 후성유전학적 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다(도 1).

HYP2의 경우, 모체 혈액 세포 및 태반 조직에서 모든 CpG 부위가 메틸화 되어 있는 것을 확인함에 따라, 태아 DNA와 산모 DNA의 총량을 모두 확인할 수 있는 총 세포-유리 DNA의 후성유전학적 마커로 사용 할 수 있음을 확인하였다(도 2).

실시예 7. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응 (Quantitative Real-time PCR , qPCR)

모체 혈장 내의 cffDNA 및 cfDNA의 수준을 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)을 이용하여 분석하였다.

cffDNA 마커인 DSCR3 및 RASSF1A 유전자의 양을 cfDNA 마커인 HYP2 와 함께 듀플렉스(duplex) 반응을 수행하여 확인하였다.

qPCR 은 ABI 7500 system(Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA)을 이용하여 수행하였다. 5 ㎕의 4X NEXpro^TM Dia PCR Master Mix(Geneslabs, Seongnam, Korea), 6 ㎕의 MBD에 의해 포획된 메틸화 혈장 DNA를 포함하는 20㎕ 부피의 반응액을 통해 듀플렉스(duplex) PCR 반응을 수행하였다. DSCR3 , RASSF1A및 HYP2의 프라이머 및 가수분해 프로브는 각각 최종 250nM 의 농도로 사용되었다.

DSCR3 , RASSF1A 및 HYP2에 특이적인 앰플리콘(Bioneer, Daejeon, Korea)를 연속 희석하여 표준 곡선(standard curve)을 작성하였다. 모든 시료는 3회 증폭시키고 최종 결과는 평균을 반영하였다. 상기 사용한 프라이머, 가수분해 프로브, 및 표적 영역의 앰플리콘의 서열은 하기 표 3에 나타난 바와 같다.

타겟 부위 [GenBank ID]	서열		서열번호
DSCR3 [NC_000021.9] chr21: 37257167-37257536; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh38.p2)	정방향 프라이머	5'- CGTAGCGGCTTCTCGTG -3'	3
	역방향 프라이머	5'- GTTAGCCATCGGCTAGGTGG -3'	4
	프로브	5'- FAM-CCGAAGCGTCTGGCCTGTGTGCTCT-BHQ1 -3'	5
	앰플리콘(125bp)	5'- CGTAGCGGCTTCTCGTGGGCGAGTCCCTGTTCGCAGGTGACGTGTGGACCACGCTCTTCCGAAGCGTCTGGCCTGTGTGCTCTCGGGGAGGGGACGCAGGTCAGCCCACCTAGCCGATGGCTAAC -3'	6
RASSF1A [NC_000003.12] chr3: 50340666-50340796; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh38.p2	정방향 프라이머	5'- GAGCCTGAGCTCATTGAGCTG -3'	7
	역방향 프라이머	5'- ACCAGCTGCCGTGTGG -3'	8
	프로브	5'- FAM -CACCCGCTGGGCGCGC-BHQ1 -3'	9
	앰플리콘	5'-GAGCCTGAGCTCATTGAGCTGCGGGAGCTGGCACCCGCTGGGCGCGCTGGGAAGGGCCGCACCCGGCTGGAGCGTGCCAACGCGCTGCGCATCGCGCGGGGCACCGCGTGCAACCCCACACGGCAGCTGGT -3'	10
HYP2 [NC_00013.11] chr13: 20719831-20719952; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh38.p2	정방향 프라이머	5'- AATGATTGTGCAGGTGGTGA -3'	11
	역방향 프라이머	5'- GAGCGCCTTGAGTAGAGGAA-3'	12
	프로브	5'- HEX-CTTCATGTCACTGCGCCAGGACG-BHQ1 -3'	13
	앰플리콘	5'-AATGATTGTGCAGGTGGTGATACTGGGAGTGGAAGTGGCTGGCTTCATGTCACTGCGCCAGGACGGCAGGTGTGGGCCCAGCCAGGACACCCCCGGCTTGTGTTCCTCTACTCAAGGCGCTC- 3'	14

**FAM: 6-carboxyfluorescein, BHQ1: Black Hole Quencher-1, HEX: hexacholoro-6-carboxyfluorescein

모든 결과는 평균값(copies/mL) 및 중앙값(MoM)으로 나타내었다(표 4). 임신 6-14주인 임신부의 경우, PE 및 HDP 환자군 모두에서 HYP2 농도의 평균값 및 중앙값 모두 정상 대조군과 현저히 차이나는 것을 알 수 있었다. 또한, 15-23주의 경우, PE 및 HDP 환자군 모두에서 HYP2 농도의 평균값 및 중앙값 모두 정상 대조군에 비해 현저히 높은 것을 알 수 있었다.

특히, HYP2 유전자의 경우 PE 및 HDP 환자군 모두에서 정상 대조군에 비해 농도가 임신 1분기부터 현저한 증가가 나타나며, 2분기 및 3분기에서는 더욱 증가되어 있는 것을 확인하였다.

또한, DSCR3 유전자 역시 PE 및 HDP 환자군 모두에서 정상 대조군에 비해 농도가 증가되어 있었다. 특히 임신 중 고혈압성 장애(HDP) 중 하나인 PE의 경우, 임신 2분기부터 정상 대조군에 비해 현저하게 증가되어 있음을 확인하였다.

실시예 8. 통계적 분석( Stastical Analysis)

범주형 변수(categorical variables)에 대한 카이제곱검정(chi-square test) 또는 피셔의 정확도 검정(Fisher's exact test)을 이용하여 분석하였고, 연속 변수(continuous variables)에 대한 비모수검정의 사후검정(post-hoc Bonferroni correction)을 포함하는 만-위트니 유 검증(Mann-Whitney U test)을 이용하여 분석하였다. 모든 대상 시료의 cffDNA 및 cfDNA 결과는 중앙값으로 환산하였다. 체질량지수(BMI)로 조정한 후 다중 회귀 분석(multiple regression) 으로부터 ROC(Receiver operating characteristic) 곡선을 그렸다. DSCR3 , RASSF1A , HYP2 및 PAPP-A 각각 또는 조합의 중간값을 ROC 곡선의 아래 면적(the area under the ROC curve, AUC)를 가지고 평가하였다

모든 데이터 분석은 SPSS software 12.0(SPSS Inc., Chicago., IL, USA)을 이용하였으며, 통계적 유의성은 모든 검사에서 P<0.05로 설정하였다.

6-14주, 임신 1분기의 임신부를 대상으로 하여 단일 마커 및 여러 마커의 조합에 대해 위양성율(false positive rate)을 5% 및 10%로 고정하고 AUC 및 검출율을 확인하였다(표 5).

상기와 같은 통계적 분석 결과, cffDNA 마커인 DSCR3 유전자의 경우, 자간전증에 대해서는 0.563 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.435-0.685), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 16.2% 및 23.0%을 나타내었다. 또한, 임신 중 고혈압성 장애(HDP)에 대해서는 0.561 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.442-0.675), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 19.6% 및 23.5%를 나타내었다.

또 다른 cffDNA 마커인 RASSF1A 유전자의 경우, 자간전증에 대해서는 0.617 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.489-0.734), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 15.0% 및 30.1%를 나타내었다. 또한, 임신 중 고혈압성 장애에 대해서는 0.617 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.489-0.734), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 15.0% 및 30.1%를 나타내었다.

상기와 같은 결과로부터 cffDNA 마커인 DSCR3 및 RASSF1A 유전자 모두 임신 초기인 임신 1분기에 자간전증 및 임신 중 고혈압성 장애를 진단하기 위한 태아 특이적 후성유전학적 바이오마커로 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, cfDNA 마커인 HYP2 유전자의 경우, 자간전증에 대해서는 0.682 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.557-0.790), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 32.8% 및 45.2%를 나타내었다. 또한, 임신 중 고혈압성 장애에 대해서는 0.675 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.557-0.778), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 25.8% 및 36.3%를 나타내었다. 이로부터 cfDNA 마커인 HYP2 유전자 역시 임신 초기인 임신 1분기에 자간전증 및 임신 중 고혈압성 장애를 진단하기 위한 후성유전학적 바이오마커로 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

특히, cffDNA 마커인 DSCR3 또는 RASSF1A 와 cfDNA인 HYP2 유전자를 조합할 경우, 자간전증 및 임신 중 고혈압성 장애에 대한 검출 능력이 크게 증가하는 것을 확인하였다.

구체적으로, DSCR3 와 HYP2 유전자를 조합하였을 때, 자간전증에 대해서는 0.687 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.561-0.795), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 36.0% 및 45.0%를 나타내었다. 또한, 임신 중 고혈압성 장애에 대해서는 0.684 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.568-0.786), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 34.0% 및 42.4%를 나타내었다. 이는 DSCR3 유전자 단독의 검출 비율에 비해 약 2배 이상 증가한 것이다.

또한, RASSF1A 와 HYP2 유전자를 조합하였을 때, 자간전증에 대해서는 0.680 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.554-0.789), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 27.0% 및 45.0%를 나타내었다. 또한, 임신 중 고혈압성 장애에 대해서는 0.684 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.568-0.786), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 34.0% 및 42.4%를 나타내었다. 이는 임신 중 고혈압성 장애진단에 있어서 DSCR3 유전자 단독의 검출 비율에 비해 약 2배 이상 증가하였으며, HYP2 유전자의 단독 검출 비율에 비해서도 증가한 것이다.

나아가, 임신 1분기에서 DSCR3 , RASSF1A 또는 HYP2 중 하나 이상의 유전자와 생화학적 마커인 PAPP-A 조합을 바이오마커로서 사용하였을 때, 검출 비율이 현저히 증가함을 확인하였다(표 5).

구체적으로, DSCR3 유전자 및 PAPP-A를 조합한 경우, 자간전증에 대해서는 0.814 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.670-0.914), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 44.7% 및 65.1%를 나타내었다. 또한, 임신 중 고혈압성 장애에 대해서는 0.735 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.591-0.850), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 34.0% 및 40.7%를 나타내었다.

또한, RASSF1A 유전자 및 PAPP-A를 조합한 경우, 자간전증에 대해서는 0.803 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.659-0.905), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 42.8% 및 62.3%를 나타내었다. 또한, 임신 중 고혈압성 장애에 대해서는 0.730 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.587-0.844), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 39.2% 및 39.3%를 나타내었다.

또한, HYP2 유전자 및 PAPP-A 를 조합한 경우, 자간전증에 대해서는 0.820 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.677-0.918), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 47.2% 및 65.4%를 나타내었다. 또한, 임신 중 고혈압성 장애에 대해서는 0.739 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.596-0.853), 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 43.5% 및 50.8%를 나타내었다.

특히 DSCR3 , HYP2 유전자 및 PAPP-A를 조합한 경우, 자간전증에 대해서는 0.852 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.689-0.928), 임신 중 고혈압성 장애에 대해서는 0.751 AUC(95% 신뢰구간(CI): 0.607-0.863)을 나타내어 예측도가 매우 높음을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 마커들의 조합의 경우, 자간전증 검출 비율은 위양성율 5% 및 10% 일 때 각각에서 54% 및 67%에 달하였으며, 임신 중 고혈압성 장애 검출 비율은 47.0% 및 58.0%에 달하였다.

이러한 결과는, 상기 cffDNA 마커인 DSCR3 및/또는 RASSF1A 와 cfDNA 마커인 HYP2 유전자를 조합하여 자간전증 및/또는 임신성 고혈압이 포함된 임신 중 고혈압성 장애를 임신 초기인 임신 1분기에 비침습적인 방법으로 진단해 낼 수 있도록 하여 초기에 치료받을 수 있도록 할 수 있음을 시사한다. 특히, 생화학적 마커인 PAPP-A 를 추가로 조합할 경우, 높은 정확도로 조기에 진단할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> CHEIL GENERAL HOSPITAL & WOMEN'S HEALTHCARE CENTER <120> Epigenetic marker HYP2 and Compositions for diagnosis of hypertensive disorders of pregnancy comprising the same <130> KPN-16196 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 forward primer(Bisulfite direct sequencing) <400> 1 gtaaatatat gtaaaaatag gaagtg 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 reverse primer(Bisulfite direct sequencing) <400> 2 cttttactac atataactac accccc 26 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 forward primer(qPCR) <400> 3 cgtagcggct tctcgtg 17 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 reverse primer(qPCR) <400> 4 gttagccatc ggctaggtgg 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 probe <400> 5 ccgaagcgtc tggcctgtgt gctct 25 <210> 6 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR3 amplicon <400> 6 cgtagcggct tctcgtgggc gagtccctgt tcgcaggtga cgtgtggacc acgctcttcc 60 gaagcgtctg gcctgtgtgc tctcggggag gggacgcagg tcagcccacc tagccgatgg 120 ctaac 125 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RASSF1A forward primer(qPCR) <400> 7 gagcctgagc tcattgagct g 21 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RASSF1A reverse primer(qPCR) <400> 8 accagctgcc gtgtgg 16 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RASSF1A probe <400> 9 cacccgctgg gcgcgc 16 <210> 10 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RASSF1A amplicon <400> 10 gagcctgagc tcattgagct gcgggagctg gcacccgctg ggcgcgctgg gaagggccgc 60 acccggctgg agcgtgccaa cgcgctgcgc atcgcgcggg gcaccgcgtg caaccccaca 120 cggcagctgg t 131 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HYP2 forward primer(qPCR) <400> 11 aatgattgtg caggtggtga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HYP2 reverse primer(qPCR) <400> 12 gagcgccttg agtagaggaa 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HYP2 probe <400> 13 cttcatgtca ctgcgccagg acg 23 <210> 14 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HYP2 amplicon <400> 14 aatgattgtg caggtggtga tactgggagt ggaagtggct ggcttcatgt cactgcgcca 60 ggacggcagg tgtgggccca gccaggacac ccccggcttg tgttcctcta ctcaaggcgc 120 tc 122

Claims

임신부 혈장 내의 총 세포-유리 DNA의 후성유전학적 마커, HYP2(GenBank Accession No.: NC_00013.11) 유전자의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 임신 중 고혈압성 장애(hypertensive disorders of pregnancy, HDP) 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 임신 중 고혈압성 장애는 자간전증(Preeclampsia, PE) 또는 임신성 고혈압(Gestational hypertension, GH)인, 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 HYP2 유전자의 농도는 임신 중 고혈압성 장애가 의심되는 환자의 태반 또는 모체 혈액 시료로부터 측정하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 유전자의 농도를 측정하는 제제는 HYP2에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머쌍인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 임신 중 고혈압성 장애 진단용 키트.
제7항에 있어서, 상기 임신 중 고혈압성 장애는 자간전증 또는 임신성 고혈압인, 진단용 키트.
a) 임신 중 고혈압성 장애가 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 HYP2 유전자의 농도를 측정하는 단계;
b) 상기 HYP2 유전자의 농도를 정상 대조군의 시료와 비교하는 단계; 및
c) 측정된 HYP2 유전자의 농도가 정상 대조군 보다 높은 경우 임신 중 고혈압성 장애로 확인하는 단계를 포함하는, 임신 중 고혈압성 장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 임신 중 고혈압성 장애는 자간전증 또는 임신성 고혈압인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 임신 중 고혈압성 장애가 의심되는 환자의 생물학적 시료는 태반 또는 모체 혈액 시료인 것인, 방법.
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