KR101519416B1 - 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법 - Google Patents

태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101519416B1
KR101519416B1 KR1020130112065A KR20130112065A KR101519416B1 KR 101519416 B1 KR101519416 B1 KR 101519416B1 KR 1020130112065 A KR1020130112065 A KR 1020130112065A KR 20130112065 A KR20130112065 A KR 20130112065A KR 101519416 B1 KR101519416 B1 KR 101519416B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fetal
marker
dna
specific
methylation
Prior art date
Application number
KR1020130112065A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150032062A (ko
Inventor
류현미
박소연
이다은
임지혜
Original Assignee
의료법인 제일의료재단
가톨릭관동대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 의료법인 제일의료재단, 가톨릭관동대학교산학협력단 filed Critical 의료법인 제일의료재단
Priority to KR1020130112065A priority Critical patent/KR101519416B1/ko
Publication of KR20150032062A publication Critical patent/KR20150032062A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101519416B1 publication Critical patent/KR101519416B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커를 증폭하기 위한 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법으로서, 상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커는 임산부 DNA에서는 비메틸화상태이고 태아 DNA에서는 메틸화상태로 존재하는 태아 특이적인 메틸화 마커인 것을 특징으로 하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물과 그 검출방법을 제공한다.

Description

태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법{Composition for detecing fetal epigenetic markers and detecting method thereof}
본 발명은 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 그 검출방법에 관한 것이다.
임산부의 혈액 내에 존재하는 태아 DNA는 태아 유래 조직인 태반에서 기원하며, 임신 중 일어나는 태반세포(trophoblast)의 자발적인 세포 사멸 과정을 통한 고사 시에 발생하여 임산부의 혈액 내로 방출된다고 알려져 있다(Prenat Diagn 2007;27:415-8, Am J Pathol 2006;169:400-4).
태아 DNA가 임산부의 혈액 중에 존재한다는 사실은 남자 태아(male fetus)를 임신한 임산부의 혈액에서 Y 염색체의 특이적인 DNA를 검출함으로써 최초로 보고되어(Lancet 1997; 350:485-487), 임신 관련 질환과 태아의 유전 질환에 관한 비침습적 산전 진단의 새로운 재원으로 연구되고 있다.
임산부의 혈액에 존재하는 태아 DNA는 자간전증과 태아 성장 발육 장애 등과 같은 비정상적인 태반 상태에 의한 임신 관련 질환에서 증가되는 것으로 알려져 있으며(Am J Pathol 2006;169:400-4; Prenat Diagn 2007;27:415-8; Genes Dev 2000;14:3191-203; Am J Obstet Gynecol 2009;200:98.e1-6; Human Reproduction 2003;18(8):1733-736), 다운증후군과 같은 태아의 유전질환에서도 증가되는 것으로 보고되고 있다(Am J Obstet Gynecol. 2002 Nov;187(5):1217-21. Clin Chem. 2003;49:239-242. Clin Chem 1999; 45:1747-51).
기존 임산부의 혈액에 존재하는 태아 DNA의 검출은 모체 여성에는 존재하지 않는 남아 유래의 Y 염색체 내 특이적인 DNA 서열을 이용하여 이루어졌다. 하지만 이 경우 태아가 여아인 경우 적용할 수 없는 제한점을 가지고 있다. 따라서 태아의 성별에 관계없이 임산부 혈액에 존재하는 태아 DNA를 보다 정확하게 측정하기 위해 조직의 발생단계와 종류에 따라 특이적인 양상을 나타내는 DNA 메틸화와 같은 유전자의 후성학적 특성 (epigenetic characteristics)이 주목을 받고 있다.
최근 임산부의 DNA와 태아의 DNA 사이의 후성학적 차이 (epigenetic difference)를 이용한 태아 DNA 확인자(identifier)를 찾으려는 연구가 진행되고 있다. 예를 들어 PDE9A, SERPINB5, RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2, PYCARD 등은 태아의 성별과 무관하게 존재하며 임산부의 혈액과 태반에서 메틸화 수준이 달라지므로 임산부의 혈액 내에 순환 태아 DNA가 존재하는지를 확인하는데 사용되고 있다. PDE9A 및 SERPINB5는 임산부의 혈액세포 중에는 주로 메틸화 상태로 존재하며 태반에서는 주로 비메틸화 상태로 존재한다고 보고되었다(Biol Reprod. 82(4):745-50, 2010). 반면, RASSF1A, APC, CASP8, RARB, SCGB3A1, DAB2IP, PTPN6, THY1, TMEFF2, 및 PYCARD는 임산부의 혈액세포 중에는 비메틸화 상태, 태반에서는 메틸화 상태로 존재한다고 알려져 있다(미국등록특허 제7754428호).
현재 시행되는 산전 선별 검사의 주된 목적은 21번 염색체가 정상인보다 1개 더 많은 3개가 존재하여 나타나는 염색체 질환인 다운증후군의 검출이다. 다운증후군은 정신 지체, 신체 기형, 전신 기능 이상, 성장 장애 등 신체 전반에 걸쳐 이상을 나타내며, 신생아 800명당 1명의 높은 발생빈도를 보이는 질환이다.
현재 다운증후군의 산전 진단은 태아 목 투명대 초음파 검사법(nuchal translucency ultrasound scan of the fetus)과 혈청 표지 물질(pregnancy-associated plasma protein A, human chorionic gonadotrophin, alpha fetoprotein, unconjugated estriol, and inhibin-A)의 조합 검사법을 병행하고 있다. 그러나, 이러한 선별 방법에 의한 검출 정확성은 5%의 위양성율 하에서 대략 84%인 것으로 보고되고 있다(Obstet Gynecol. 2006;107:167-173, N Engl J Med. 2005;353:2001-11). 일반적으로 다운증후군의 정확한 진단은 양수천자(amniocentesis)나 융모생검(chorionic villus sampling)을 통한 염색체 분석을 실시하여 이루어지고 있으나, 이러한 양수천자나 융모생검은 침습적 방법으로서 대략 1% 유산율의 위험성을 지니고 있다. 따라서 다운증후군에 대한 정확성이 높은 비침습적 선별, 진단 기술은 현재의 침습적 진단 방법의 필요성 감소와 선별 방법의 대체를 위해 여전히 요구되고 있다.
현재까지 염색체 21번에 존재하는 임산부의 DNA와 태아의 DNA 사이의 후성학적 차이를 보이는 다양한 태아 DNA 확인자들이 보고되었다(Clin Chem 2008;54:500-11, Clin Chem 2010;56:90-8, Am J Pathol. 2009 May;174(5):1609-18). 하지만 보고된 태아 DNA 확인자는 비침습적인 태아 DNA의 검출을 위해 임산부의 혈액 세포와 태반 조직 사이의 조직 특이적인 후성학적 특성에 기반하여 동정되었으므로 질환 특이적인 후성학적 특성이 고려되지 않아 질환의 검출을 위한 마커로서의 이용에는 한계가 있다. 따라서, 임산부의 혈액 중 태아 DNA의 검출을 포함한 비침습적 산전 진단에 보다 효과적으로 이용될 수 있는 마커에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명자들은 비침습적 산전 진단에 이용될 수 있는 태아 조직에 특이적인 후성학적 특징을 갖는 마커를 발굴하기 위한 연구를 수행하여 21번 염색체에 존재하는 서열번호 2의 마커 X2가 태아 DNA와 임산부 DNA를 구별하여, 다운증후군과 같은 염색체 이상을 갖는 태아의 구별에 이용될 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 21번 염색체에 존재하는 조직 특이적인 후성학적 특징을 보이는 새로운 태아 DNA 특이적인 후성학적 마커를 검출하기 위한 조성물을 개발하여 임산부 혈액 내 태아 DNA 검출을 위한 신뢰할 수 있는 태아 DNA 특이적 마커를 발굴하고 이를 통해 다운증후군의 검출에 있어서 효과적인 새로운 DNA 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 태아 특이적 후성학적 마커를 이용하여 비침습적으로 임산부 혈액 중 태아 DNA의 존재 여부를 확인하고 정량화함으로써 산전 진단에 필요한 정보를 수득하는 방법을 제공하는 것이다.
삭제
삭제
본 발명의 일 양태는 태아 특이적 후성학적 마커 X2 마커를 포함하는, 태아 DNA 검출용 조성물을 제공하는 것으로 본 발명의 일 양태에 의하면 서열번호 2의염기서열로 이루어진 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커를 증폭하기 위한 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물로서, 상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커는 임산부 DNA에서는 비메틸화상태이고 태아 DNA에서는 메틸화상태로 존재하는 태아 특이적인 메틸화 마커인 것을 특징으로 하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물을 제공한다.
상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물은 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 상기 메틸화 마커를 검출하기 위한 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브; 를 포함한다.
태아 DNA와 임산부 DNA는 메틸화 상태가 상이할 수 있으며, 그에 의해 구별이 가능하다는 것이 알려져 있다. DNA의 메틸화는 후성학적 현상이고, 태아 특이적 후성학적 마커 X2는 임산부 DNA와 비교하여 상이한 메틸화 상태를 가지므로, 그 메틸화 상태에 의해 태아 DNA를 임산부 DNA로부터 구별할 수 있다. 태아 특이적 후성학적 마커 X2는 21번 염색체에 존재하며, 임산부 DNA에서는 완전한 비메틸화 상태이나, 태아 DNA에서는 완전한 메틸화 또는 과메틸화 상태이며, 카피수 변이(Copy Number Variant, CNV)를 갖지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "태아 특이적 후성학적 마커"는 메틸화와 같은 후성학적 특징에 의해 태아 유래 DNA를 모체 유래 DNA로부터 특이적으로 구별하기 위해 이용될 수 있는, 염색체 상의 특정 부위를 의미한다. 태아 특이적 후성학적 마커는 비침습적 산전 진단에 유용하게 이용될 수 있다. 태아 특이적 후성학적 마커를 이용하여 임산부 혈액 중 태아 DNA를 검출하고 그의 존재 여부를 판단하는 것은 물론, 임신부 혈장내 존재량을 측정하는 것에 의해 태아의 염색체 이상을 검사할 수 있다.
본 발명에서 태아 특이적 후성학적 마커 X2는 21번 염색체 상의 43482782번에서 43482891번까지의 영역(GeneBank accession no. AP001745; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh37/hg19)이고, 서열번호 2로 표시된다.
삭제
태아 특이적 후성학적 마커 X2의 CpG 부위는 태아 DNA에서는 완전한 메틸화 또는 과메틸화 상태이고, 임산부 DNA에서는 완전한 비메틸화 상태이므로, 메틸화 여부에 의해 태아 및 임산부 유래의 DNA를 구별할 수 있고, 21번 염색체의 메틸화된 DNA에 대한 양적 평가를 통해 태아 다운증후군 여부를 검사할 수 있다. 또한, 이들 마커는 비침습적 산전 진단에서 태아 DNA의 존재에 대한 양성 대조군으로 이용될 수 있다.
삭제
본 발명의 일 구체예에서, 상기 마커는 실시간 중합효소연쇄 반응을 포함한 중합효소연쇄 반응에서 태아 DNA의 존재 여부를 검출하기 위해 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 또 다른 양태에서는 태아 DNA의 존재 여부를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 수행 전에 메틸화된 DNA를 비메틸화된 DNA로부터 화학적 변형 없이 물리적으로 분리하는 단계를 수행할 수 있다.
메틸화된 DNA를 비메틸화된 DNA로부터 물리적으로 분리하는 단계는 DNA 자체를 화학적으로 변형시키거나 절단하지 않고, 메틸화 여부에 의해 분리하는 것을 의미한다. 메틸화된 DNA의 물리적 분리는 메틸화 특이적 항체를 이용한 면역침전이나 메틸화 부위를 인식하는 메틸-CpG 결합 도메인 단백질(methyl-CpG binding domain capture, MBD)을 이용하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 마커 X2의 증폭을 위한 서열번호 7과 8로 이루어진 프라이머쌍, 마커 X2의 검출을 위한 서열번호 9의 프로브 검출을 더 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응 수행을 위한 완충액, dNTP 혼합물, 및 DNA 중합효소를 더 포함한다.
실시간 중합효소연쇄반응은 표적 핵산의 증폭과 측정을 동시에 진행한다. 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 산물로부터 발생하는 신호, 예를 들면, 형광의 강도를 실시간으로 측정하므로, 전통적인 중합효소연쇄반응에 비해 신속하고 민감하게 결과를 확인할 수 있다. 또한, 증폭 산물의 분석을 위한 전기영동이나 서열결정과 같은 추가적인 단계를 필요로 하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로브(probe)"는 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)이 프로브의 말단에 부착될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용하기 위한 프로브는 5' 말단에는 형광물질이 부착되고, 3' 말단에는 소광물질이 부착되어 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 형광물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), Cy5, 및 VIC로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 소광물질은 6-TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ(Black Hole Quencher)-1, BHQ-2, BH3-3, 및 ROX(carboxy-X-rhodamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 프로브의 3'-말단에 MGB(minor groove binder)가 부착될 수 있다. MGB는 형성된 이중쇄의 안정성을 증가시켜 분석의 정확도에 기여한다.
본 발명의 일 구체예에서, 단일 또는 다중 실시간 중합효소연쇄반응은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 통상적인 조건에서 수행되거나, 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 실시간 중합효소연쇄반응의 진행 중 어닐링 및 연장 단계에서 형광물질이 부착된 프로브로부터의 형광을 측정한다.
본 발명의 또 다른 양태는 임산부 혈액 중 태아 DNA를 검출하는 방법으로서,
임산부 혈액 시료에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계,
분리된 메틸화된 DNA에 대해 태아 특이적 후성학적 마커 X2(서열번호 2)의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
태아 특이적 후성학적 마커 X2는 태아 DNA, 즉, 태반으로부터 유래된 DNA에서는 완전한 메틸화 또는 과메틸화 상태이나, 임산부 DNA에서는 비메틸화 상태이다. 따라서, 임산부 혈액 시료 중 메틸화된 DNA를 비메틸화 DNA로부터 물리적으로 분리하고 그로부터 마커 X2를 검출하는 것에 의해 태아 DNA의 존재 여부를 확인할 수 있다. 또한, 마커 X2의 임신부 혈장내 존재량은 다운증후군 태아의 산전 검사에 필요한 정보로 활용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 임산부 혈액에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계는 메틸화 DNA 특이적 면역 침강 또는 메틸화 부위를 인식하는 메틸-CpG 결합 도메인 단백질(methyl-CpG binding domain capture, MBD)에 의해 수행된다.
메틸화된 DNA를 비메틸화된 DNA로부터 물리적으로 분리하는 단계는 메틸화 DNA 특이적 항체를 이용하여 메틸화 DNA를 항체에 결합시킨 후 침강된 항체 복합체로부터 메틸화 DNA를 방출시키거나 또는 메틸화 CpG 결합 도메인 단백질(methyl-CpG binding domain capture, MBD)과 추출된 DNA를 혼성화 후, 메틸화 DNA를 방출시키는 것에 의해 수행된다.
메틸화된 DNA를 화학적으로 변형시키거나 절단하지 않으면서 물리적으로 비메틸화된 DNA로부터 분리하고, 이로부터 태아 특이적 후성학적 마커의 존재를 검출하거나 또는 그 존재량을 측정한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 태아 특이적 후성학적 마커 X2의 존재 여부를 검출하는 단계는 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 실시간 중합효소연쇄반응은 마커 X2의 증폭을 위한 서열번호 7과 8로 이루어진 프라이머쌍, 마커 X2의 검출을 위한 서열번호 9의 프로브를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 임산부 혈액 중 태아 DNA를 검출하는 방법은 분리된 메틸화된 DNA에 대해 태아 특이적 후성학적 마커 X2의 존재량을 측정하는 단계, 및 상기 측정된 마커의 존재량을 상기 태아 특이적 후성학적 마커에 대한 표준화된 기준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
삭제
삭제
상기 태아 특이적 후성학적 마커에 대한 표준화된 기준 대비 상기 측정된 마커의 존재량은 다운증후군 태아의 진단에 필요한 정보를 제공한다.
시료 중 마커의 존재량은 시료 중에 존재하는 마커의 양을 의미하며, 이는 시료 중 해당 마커의 카피수(copy number)등 다양한 정량적 단위로 표현될 수 있다.
상기 태아 특이적 후성학적 마커에 대한 표준화된 기준은 정상 태아를 임신한 여성의 혈액으로부터 측정된 마커의 존재량이거나, 다운증후군 태아를 임신한 여성의 혈액으로부터 측정된 마커의 존재량일 수 있다.
삭제
삭제
삭제
삭제
본 명세서에서 마커의 존재량과 관련하여 사용된 용어 "표준화된 기준"은 시료 중 마커의 존재량 또는 양과 비교하기 위한 값을 의미하며, 측정 대상 시료의 기준이 될 수 있는 집단으로부터 수득된 평균값일 수 있다. 예를 들면, 다운증후군 여부를 판단하기 위한 측정에서 표준화된 기준은 정상 태아를 임신한 임산부들로 측정된 값의 평균이거나 또는 다운증후군 태아를 임신한 임산부들로부터 측정된 값의 평균일 수 있다.
삭제
이하에서 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
삭제
본 발명의 일 구체예에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 비침습적으로 산모 혈액 시료 중 태아 DNA의 존재 여부를 검출하고, 다운증후군의 산전 진단에 필요한 정보를 수득할 수 있다.
도 1은 태아 특이적 후성학적 마커 X2(7개의 CpG 부위) 의 비술피트 서열결정 데이터를 보여준다. 선택된 마커는 모두 태아 유래의 태반 조직에서는 과메틸화 또는 완전한 메틸화를 보였으나, 모체 유래의 말초 혈액에서는 완전한 비메틸화를 보였다.
도 2는 모체 혈액 시료에 대해 수행된 태아 특이적 후성학적 마커 X2(서열번호 2) 에 대한 qPCR의 결과를 보여준다.
도 3은 태아 특이적 후성학적 마커 X2와 기준 마커 RASSF1A의 다중 실시간 qPCR 결과를 보여준다.
도 4는 태아 특이적 후성학적 마커 X2와 기준 마커 RASSF1A의 다중 실시간 qPCR로부터 수득된 ROC 곡선의 분석 결과를 보여준다. 도면 중 UMO는 마커 X2를 나타내고, RATIO는 마커 X2의 임산부 혈액 중 존재량/RASSF1A의 임산부 혈액 중 존내량의 비율로 계산된 비율값을 의미한다.
실시예 1. 태아 특이적 후성학적 마커의 스크리닝
21번 염색체를 대상으로 임산부 혈액 중 태아 DNA를 검출하기 위해 이용될 수 있는 태아 특이적 후성학적 마커를 스크리닝했다. 임산부와 태아에서 각각 상이한 메틸화 양상을 보이는 마커를 선별하여 태아 특이적 후성학적 마커로서의 적용 가능성을 확인했다.
(1) 대상
2011년 3월부터 12월 사이에 제일병원 산부인과에 내원한, 정상 태아 또는 다운증후군(T21) 태아를 가진 임신 여성과 임신하지 않은 여성을 대상으로 모집했다. 제일병원 윤리위원회로부터 본 연구에 대한 허가(#CGH-IRB-2011-85)를 얻었다. 모든 환자는 시료 수집 및 후속 연구에 대해 서면 동의했다.
(2) 시료 처리
메틸-CpG 결합 도메인 단백질 포획 (MBD)-마이크로어레이 분석을 위해, 모체 말초혈액 시료를 제1 삼분기에 융모막 융모 샘플링 시술 직전에 EDTA를 함유한 튜브에 채취했다. 모든 태반 시료는 융모막 융모 샘플링에서 수득했다. 말초 혈액 시료를 1,600 g에서 10분 동안 원심분리하고 수득된 말초 혈액 세포 부분을 2,500 g에서 10분 동안 재-원심분리한 후, 잔류 혈장을 제거하여 말초 혈액 세포를 수득했다. 각각 QIAamp Blood Kit (Qiagen) 및 QIAamp Tissue Kit (Qiagen)를 이용하여, 말초 혈액 세포 및 태반 조직으로부터 DNA를 추출했다.
(3) 어레이 혼성화(Array Hybridization)
21번 염색체의 타일링 올리고뉴클레오티드 어레이(tiling oligonucleotide array)를 위해, 정상 비임신 여성 (n=2)으로부터의 전혈 시료, 정상 태아를 임신한 여성(n=5)으로부터의 전혈 시료와 태아 태반 시료 (n=4), 및 다운증후군 태아를 임신한 정상 여성의 태아 태반 시료 (n=5)를 이용했다.
태반 조직 및 혈액 세포로부터 추출된 각 DNA 시료를 초음파 처리(sonication)한 후, 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 특이적으로 인식하는 MBD를 사용하여 메틸화된 DNA만 선택적으로 결합시키고, 결합된 MBD-DNA를 특이적으로 결합할 수 있는 마그네틱비드를 이용하여 메틸화된 DNA만 선택적으로 추출하여 마이크로어레이에 적용했다(Invitrogen, MethylMinerTM Methylated DNA enrichment kit). MBD를 통해 수득된 산물을 전체 유전체를 증폭할 수 있는 Whole Genome Amplification Kit(Sigma)를 사용하여 증폭하고, 각각의 증폭된 DNA는 Genomic DNA Enzymatic Labeling Kit (Agilent)를 이용하여 표지하고, 21번 염색체에 대해 특이적으로 맞춤화된 칩에 혼성화시켰다. 어레이 플랫폼은 21번 염색체에 특이적인 고-해상도 타일링 올리고뉴클레오티드 어레이를 위해 제작된 것이었다(Agilent technologies, Design_ID038569). 이 어레이는 60 bp 당 1개의 중간 프로브 밀도(median probe density)로 21번 염색체 전체를 포괄하는 40만개의 50량체 또는 60량체(60-mer) 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 표지화, 혼성화, 및 혼성화-후 세척 절차를 포함한, 마이크로어레이 프로토콜이 제조사에 의해 제안되었으며, http://www.agilent.com에서 확인할 수 있다.
요약하면, 표지된 MBD (Cyanine 5-dUTP) DNA 및 기준(reference) DNA (Cyanine 3-dUTP)를 Amicon 필터(Millipore)를 이용하여 세척했다. 그 후, 제조사의 설명서에 따라, 회전하는 SureHyb 챔버에서 67℃에서 40시간 동안 Methylation Hybridization Kit (Agilent)를 이용하여, 상기 마이크로어레이로의 경쟁적 혼성화를 진행시켰다. 그 후, 세척된 슬라이드를 High-Resolution C Scanner (Agilent)를 이용하여 스캔하고, Feature Extraction 소프트웨어(Agilent Technologies)를 이용하여 형광을 평가했다. 수득된 형광 수치를 이용하여 Intensity Lowess 정규화를 통해 값을 보정하고, 보정된 값들은 BATMAN(Bayesian tool for methylation analysis) 알고리즘을 통하여 메틸화 여부를 평가하였다. BATMAN 알고리즘에 따라 평가된 값에서 로그값이 1 이상이며, BATMAN 콜(call)이 1인 값들을 메틸화된 것으로 평가하였다.
타일링 올리고뉴클레오티드 어레이의 데이터 분석
백그라운드 보정을 이용하여 두 개의 신호 값을 정규화시키고, Agilent Genomic Workbench 소프트웨어 (Agilent)를 이용하여, 신호 비(MBD/인풋), 신호 로그 비 [log2(MBD/input)], P[X], 및 P를 수득했다. log2 값은 log2 스케일로 변환된, 각 프로브에 대한 Cy5:Cy3 형광 비(MBD에 의해 회수된 메틸화 DNA:총 인풋 DNA)이고, 각 좌(locus)에서 메틸화 DNA 양의 상대적 척도를 나타낸다. 본 발명자들은 미가공 데이터(raw data)에 중앙값 및 Lowess 정규화를 적용하고, 불량(low-quality) 데이터 포인트를 제거하기 위해 가외치 프로브(outlier probe)를 필터링했다. MBD 어레이 분석에서 binding call을 수득하기 위해 이용되는 P[X] 및 P 값은 X 값이 시료의 전체 지놈의 X 값의 가우스 분포로부터 벗어날 확률로 정의하였다. 이때, 프로브에 대한 X 값은 분포의 대칭에 대해 보정된 MBD 신호와 인풋 신호 간의 차이를 의미한다. 프로브에 대한 값은 인접 프로브(해당 프로브의 1 kb 내에 있는 프로브)의 신호를 고려하여, 평균 X로 계산하였다. 최종적으로, 본 발명자들은 완전한 메틸화를 정규화 log2 비 > 1로 정의하고, 완전한 비메틸화를 정규화 log2 비 = 0으로 정의하였다.
타일링 올리고뉴클레오티드 어레이 분석에서 혈액과 태반 조직에서 차등적으로 메틸화된 영역을 확인하여 태아 특이적 후성학적 마커의 후보를 선택했다. 질환의 유무에 관계없이, 태반 시료(n=9)에서 1보다 큰 정규화된 log2 비로 정의된 완전한 메틸화 및 혈액시료(n=7)에서 0인 정규화된 log2 비로 정의된 비메틸화에 근거하여 총 3개의 영역을 마커 후보로 선택했다. 하기 표 1은 그 결과를 보여준다.
Figure 112015004875958-pat00011
태아 유래 태반 시료에서 완전한 메틸화를 나타내고, 임신의 유무에 관계없이, 모든 혈액 시료에서 완전한 비메틸화를 나타내는 것으로 확인된 Index 243799로 표시된 프로브에 의해 동정된 영역을 태아 특이적 마커 X2로 명명했다.

(4) 표적 영역 내 카피수 변이(Copy Number Variation) 확인
삭제
태아 특이적 후성학적 마커 X2의 DNA 서열을 DGV(Database of Genomic Variants)(http://projects.tcag.ca/variation/) 검색에 의해 카피수 변이(copy number variant, CNV)의 존재 여부에 대해 확인하였다. CNV가 없는 표적 영역을 모체 혈장의 검출을 통한 비침습적 태아 마커로서의 이용 가능성을 검증하기 위해 이용했다. 하기의 표 2는 CNV가 없는 것으로 최종적으로 확인된 영역을 나타낸다. 붉은 색 서열은 마이크로어레이에 의해 선정된 프로브 서열을 나타내며, 밑줄친 영역은 선택된 프로브의 주변 프로브 서열이다.
Figure 112015004875958-pat00012
(5) 비술피트 직접 서열결정(Bisulfite direct sequencing )
타일링 올리고뉴클레오티드 어레이 분석에 의해 선별된 마커에 대해 비술피트 직접 서열결정을 이용하여 어레이 분석 데이터의 정확성을 확인하였다. DNA 시료 (1 ㎍)를 제조사의 설명서에 따라 EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen)를 이용하여 비술피트-전환시켰다. 비술피트-전환 DNA를 메틸화 CpG 부위 및 비메틸화 CpG 부위의 구별을 위한 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 사용된 PCR 프라이머는 하기와 같았다:
Index ID: 243799: 정방향 프라이머: 5'-GATGCGTTAGATTTAAGGGAGG-3'
삭제
삭제
역방향 프라이머: 5'-CTCACTCTCACGAAACCCCTC-3'

PCR 반응 용액은 20 ㎕의 총 반응 부피당 10 ng 지놈 DNA, 10 pM 프라이머, 0.25 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1 X 완충액, 및 0.25 U Taq 폴리머라아제를 포함했다. PCR 조건은 95℃에서 10분 동안의 예비변성, 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서의 40초로 이루어진 사이클 35회, 및 72℃에서 10분의 최종 연장을 포함했다. PCR 증폭 후에, 제조사의 설명서에 따라 PCR 정제 키트 (Bioneer)를 이용하여 PCR 산물을 정제하고, PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 서열을 결정하였다. 서열결정 산물은 PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 분석하고, Genescan 소프트웨어 버전 3.7 (Applied Biosystems, Inc.)을 이용하여 전기영동도 기록(electropherogram trace)을 해석했다. Genotyper 소프트웨어 버전 3.7 (Applied Biosystems, Inc.)을 이용하여 상응하는 유전형을 배치했다. 도 1은 마커 X2에 대한 비술피트 서열결정 데이터를 보여준다. 선별된 태아 특이적 후성학적 마커 X2는 서열번호 2로 확인되었다. 마커 X2는 모두 태아 유래의 태반 조직에서는 과메틸화 또는 완전한 메틸화를 보였으나, 임산부 유래의 말초 혈액에서는 완전한 비메틸화를 보였다.
삭제
삭제
실시예 2. 태아 DNA 의 검출
실시예 1에서 선별된 태아 특이적 후성학적 마커 X2를 이용하여 임산부 혈액으로부터 수득된 시료에서 태아 DNA의 검출을 수행했다.
(1) 모체 혈장으로부터 세포-유리 DNA의 단리
각 임산부 참가자(n=6)로부터의 말초 혈액을 EDTA 튜브에 수집했다. 채취 직후, 모체 말초 혈액 시료를 4℃에서 1,600 g로 10분 동안 원심분리했다. 혈장 부분을 16,000g로 10분 동안 재원심분리하여 모체 DNA의 추가적인 방출을 최소화하고, 검사할 때까지 -80℃ 초저온 냉동고(deep freezer) 보관했다. 제조사의 설명서에 따라, QIAamp DSP Virus Kit (Qiagen)를 이용하여 1 mL 모체 혈장으로부터 세포-유리 DNA를 추출하였다. 각 DNA 시료를 30 ㎕의 멸균 DNase-불포함 물로 용리시키고, 후속 맹검 분석(blinded analysis)을 위해 표시했다.
(2) 메틸화 DNA의 농축(Enrichment)
MethylMinerTM 메틸화 DNA 농축 키트 (Invitrogen)를 이용하여, 모체 혈장으로부터 추출된 순환하는 DNA로부터 메틸화 DNA를 단리했다. MBD-비오틴 단백질(3.5 ㎍)을 10 ㎕ Dynabeads M-280 Streptavidin에 결합(coupling)시킨 후, MBD-자성 비드 컨쥬게이트를 3회 세척하고 1 부피(volume)의 1X Bind/Wash 완충액에 재현탁시켰다. 회전 믹서 상에서 30 ㎕의 추출된 순환 DNA를 MBD-자성 비드에 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 포획(capture) 반응을 수행했다. 그 후, 비드를 1X Bind/Wash 완충액으로 3회 세척하고, 결합된 메틸화 DNA를 용리 완충액 중 증가되는 NaCl 농도 [450 mM, 600 mM, 1,000 mM, and 2,000 mM NaCl]를 이용하여 단계적 용리에 의해 용리시켰다. 용리된 DNA를 DNA 농축기 (Zymo research corp.)를 이용하여 농축시키고, 30 ㎕의 최종 부피로 용리시켰다. 키트에 포함된 대조군 DNA(메틸화 DNA 및 비메틸화 DNA)를 이용하여 메틸화 DNA의 단리를 확인하였다.
(3) 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(q-RT PCR)
임산부 혈장 중 태아 특이적 후성학적 마커의 검출 가능성을 확인하기 위해 q-RT PCR을 수행했다. q-RT PCR은 ABI 7500 system (ABI)을 이용하여 수행했다. 2X Master Mix II (Kogene biotech) 10 ㎕ 및 MBD에 의해 포획된 메틸화 혈장 DNA 5 ㎕를 이용하여 20 ㎕ 부피로 반응액을 준비했다. 프라이머 및 가수분해 프로브(hydrolysis probe)는 각각 200 nmol/L 및 100 nmol/L의 최종 농도로 사용했다. 프라이머, 가수분해 프로브, 및 표적 영역의 앰플리콘의 서열이 하기 표 3에 표시된다. 초기 PCR 반응 조건은 50℃에서의 2분 및 95℃에서의 10분, 및 뒤이은 95℃에서의 15초 및 60℃에서의 1분으로 이루어진 사이클 50회였다. 앰플리콘의 연속 희석에 의해 각 분석에 대한 보정 곡선(calibration curver)을 작성했다. 모든 시료는 3회 증폭시키고 최종 결과는 평균을 반영했다. 농축 계수(factor concentration)는 카피/mL로 표현하고, 전술된 바와 같이, 데이터를 카피수로 전환시키기 위해, 6.6 pg의 표준 계수(standard factor)를 사용했다(Am J Hum Genet 1998; 62:768-75).
마커 서열
X2 서열번호 14: 앰플리콘
5'-CCACGTGCACTGAGCGTCTCTTGTTGTTCACCCCAAATAAACTCTGCCGGAACTGGGGCGGGACTCGCAGGGGCGGAGAAGGGGGGAGACGGGCAGAGGGCAGAA-3'
X2 서열번호 7: 정방향 프라이머 5'-CCACGTGCACTGAGCGTCTC-3'
서열번호 8: 역방향 프라이머 5'-TTCTGCCCTCTGCCCGTCTC-3'
서열번호 9: 가수분해 프로브 5'-(FAM) CCCAAATAAACTCTGCCGGA (MGBNFQ)-3'
도 2는 태아 특이적 후성학적 마커 X2에 대한 qPCR에 의해 임산부 혈장 중에 존재하는 태아 DNA를 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 3. 태아 특이적 후성학적 마커를 이용한 다운증후군 태아 진단의 정확성 확인
다운증후군 태아와 정상 태아를 임신한 임산부 혈액으로부터 수득된 시료에서 실시예 1에서 선별된 태아 특이적 후성학적 마커 중 X2를 이용하여 다운증후군 태아의 진단 정확성을 확인했다. 21번 염색체의 수적 증가에 의한 다운증후군 태아를 X2와 같은 21번 염색체에 존재하는 태아 특이적 후성학적 마커를 이용하여 정확히 검출하기 위해, 정상 염색체 수를 갖는 기준(reference) 염색체의 태아 특이적으로 메틸화되어 존재하는 후성학적 마커와 비교하여 21번 염색체에 존재하는 태아 특이적인 후성학적 마커의 비율적 증가를 확인하는 것이 요구된다. 따라서 본 실시예서는 3번 염색체상의 50378107번에서 50378202번까지의 영역(GeneBank accession no. AP001745; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh37/hg19)에 해당하는 태아 특이적인 메틸화 마커인 RASSF1A를 기준 염색체의 DNA 메틸화 마커로 이용하였다. RASSF1A는 임산부 유래 DNA에서는 비메틸화 상태이고, 태반 유래 DNA에서는 메틸화 상태로 존재하는 태아 특이적인 메틸화 마커이며(미국특허 제7754428호), 모체 혈액 내 태아 DNA를 이용한 단일 유전자 질환의 진단에 관한 영국 RAPID (Reliable Accurate Prenatal non-Invasive Diagnosis) 연구 프로젝트에서 모체 혈액 내 태아 DNA의 존재 유무를 확인하는 후성학적 마커로서 RASSF1A의 이용을 권고하고 있다.
(1) 모체 혈장으로부터 세포-유리 DNA의 단리
다운증후군 태아를 임신한 임산부 참가자(n=10)와 정상 태아를 임신한 임산부 참가자(n=20)로부터의 말초 혈액을 EDTA 튜브에 수집하고, 실시예 2에서와 동일한 방법으로 모체 혈장으로부터 세포-유리 DNA를 단리했다.
(2) 메틸화 DNA의 농축(Enrichment)
실시예 2에서와 동일한 방법으로, MethylMinerTM 메틸화 DNA 농축 키트 (Invitrogen)를 이용하여, 모체 혈장으로부터 추출된 순환하는 DNA로부터 메틸화 DNA를 단리했다.
(3) 다중 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(multiplex q-RT PCR)
태아 특이적 후성학적 마커를 이용한 다운증후군 진단의 정확성을 확인하기 위해 다중 q-RT PCR을 수행했다. 2X Master Mix II (Kogene biotech) 15 ㎕ 및 MBD에 의해 포획된 메틸화 혈장 DNA 5 ㎕를 이용하여 30 ㎕ 부피로 반응액을 준비했다. 프라이머 및 가수분해 프로브는 100 nmol/L의 최종 농도로 사용했다. 프라이머, 가수분해 프로브, 및 표적 영역의 앰플리콘의 서열은 하기 표 4에 표시된다.
초기 PCR 반응 조건은 50℃에서의 2분 및 95℃에서의 10분, 및 뒤이은 95℃에서의 15초 및 60℃에서의 1분으로 이루어진 사이클 50회였다. 앰플리콘의 연속 희석에 의해 각 분석에 대한 보정 곡선을 작성했다. 각 시료를 3회 증폭시켰고, 최종 결과는 평균을 반영했다. 농축 계수는 카피/mL로 표현하고, 전술된 바와 같이, 데이터를 카피수로 전환시키기 위해, 6.6 pg의 표준 계수(standard factor)를 사용했다(Am J Hum Genet 1998; 62:768-75).
마커 서열
X2 서열번호 14: 앰플리콘
5'-CCACGTGCACTGAGCGTCTCTTGTTGTTCACCCCAAATAAACTCTGCCGGAACTGGGGCGGGACTCGCAGGGGCGGAGAAGGGGGGAGACGGGCAGAGGGCAGAA-3'
서열번호 7: 정방향 프라이머 5'-CCACGTGCACTGAGCGTCTC-3'
서열번호 8: 역방향 프라이머 5'-TTCTGCCCTCTGCCCGTCTC-3'
서열번호 9: 가수분해 프로브 5'-(FAM) CCCAAATAAACTCTGCCGGA (MGBNFQ)-3'
RASSF1A 서열번호 16: 앰플리콘
5'-AGCTGGCACCCGCTGGGCGCGCTGGGAAGGGCCGCACCCGGCTGGAGCTGCCAACGCGCTGCGCATCGCGCGGGGCACCGCGTGCAACCCCACAC-3'
서열번호 17: 정방향 프라이머 5'-AGCTGGCACCCGCTGG-3'
서열번호 18: 역방향 프라이머 5'-GTGTGGGGTTGCACGCG-3'
서열번호 19: 가수분해 프로브 5'-(FAM) ACCCGGCTGGAGCGT (MGBNFQ)-3'
(4) 통계 분석
실험군은 다운증후군 태아를 임신한 임산부로 구성되었고, 대조군은 정상 태아를 임신한 임산부로 구성되었다. X2와 기준(reference) 마커로 사용된 RASSF1A의 임산부 혈액 내의 양과 X2와 RASSF1A의 비율값은 평균으로 표현되었으며, t-검정을 이용하여 실험군과 대조군 간의 차이의 유의성을 분석하였다.
태아 다운증후군 검출의 정확도는 X2의 혈액 내의 존재량과 X2와 기준 마커로 사용된 RASSF1A와의 비율값에 근거하여 분석하고, 태아의 핵형 분석 결과를 참조하여 결정하였다. 여기서 X2와 RASSF1A와의 비율 값은 하기 식에 의하여 계산되었다.
식 : (X2 임산부 혈액 내 존재량 / RASSF1A 임산부 혈액 내 존재량)
진단 정확성 평가에 있어 민감도, 양성 예측치, 음성 예측치, 위험률은 EpiMax Table Calculator(http://www.healthstrategy.com/epiperl/epiperl.htm)를 이용하여 계산하였다.
전체적인 진단 방법의 정확도는 ROC 곡선 하 면적(the area under the ROC curve, AUC)를 가지고 평가하였다. ROC 곡선 하 면적을 이용한 전체적인 진단 정확도는 X2 임산부 혈액 내의 존재량과 비율값에 대해서 산출하였다.
통계적 분석은 Statistical Package for Social Sciences 10.0(SPSS Inc.)을 사용하였고, 통계적 유의성은 모든 검사에서 P<0.05로 설정했다.
도 3에 도시된 바와 같이, 기준 마커로 사용된 RASSF1A의 임산부 혈액 내의 양은 대조군과 실험군에서 다르지 않았다. 그러나, X2의 임산부 혈액 내 존재량과X2/RASSF1A 비율 값은 실험군에서 대조군에 비해 유의성 있는 차이를 보이며 증가되었다.
X2와 비율 지수의 진단적 정확성 평가를 위해, 각 요소의 절단치는 ROC 분석에 의해 80% 민감도에서 선정되었고 특이도, 양성 예측치, 음성 예측치 및 AUC를 비교하였다. X2의 절단치는 710 카피/mL였으며, 52% 특이도, 40% 양성 예측치, 87% 음성 예측치, 0.716 AUC (95% 신뢰구간: 0.523-0.909)를 보였다. 비율 지수의 절단치는 3.0이었으며, 88% 특이도, 73% 양성 예측치, 92% 음성 예측치, 0.916 AUC (95% 신뢰구간: 0.820-1.012)를 보였다. 각 ROC 곡선 분석 결과는 도 8에 도시된다. 도 8에서 X2는 "UMO"로, 비율 지수는 "RATIO"로 표시된다.
결과적으로 태아 특이적 후성학적 마커인 X2와 기준 마커인 RASSF1A에 대한 다중 q-RT PCR 결과는 태아 특이적 후성학적 마커 X2가 임산부 혈장 중에 존재하는 태아 DNA의 검출을 통해 다운증후군 태아 여부를 판별하기 위해 이용될 수 있다는 것을 보여준다.
<110> CHEIL GENERAL HOSPITAL & WOMEN'S HEALTHCARE CENTER, et al. <120> Fetal Epigenetic Markers and Use thereof <130> PN101107 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 165 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gccgcacatc agagcagtct atggctgtgg gcttcacagc tgaagctggg ccgtgggaaa 60 tgttgagacg agtgagtgca gagcctgaaa gacaatacgg tagaaaaggt tacatccgcg 120 ggggggcgtc tgatggcatc tgccatttat tgaggatggg tgcga 165 <210> 2 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cacaccccac gtgcactgag cgtctcttgt tgttcacccc aaataaactc tgccggaact 60 ggggcgggac tcgcaggggc ggagaagggg ggagacgggc agagggcaga 110 <210> 3 <211> 167 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctggtgcacg caaggagcta tcgtgaacat tgctcccaac tggccgcttg cttgtccccc 60 ggctcccctt ggccccagtg gcggctttgc ctgaattaga gggcgtgaga gccacctgtg 120 tctcagcact gcaattaaag caggaagccc tttcggaagc agccgtg 167 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for marker X1 <400> 4 agctgaagct gggccg 16 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for marker X1 <400> 5 cgcggatgta accttttcta ccg 23 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for marker X1 <400> 6 gagacgagtg agtgcagag 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for marker X2 <400> 7 ccacgtgcac tgagcgtctc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for marker X2 <400> 8 ttctgccctc tgcccgtctc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for marker X2 <400> 9 cccaaataaa ctctgccgga 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for marker X3 <400> 10 cggctttgcc tgaattagag g 21 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for marker X3 <400> 11 tggtgcacac ggctgct 17 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for marker X3 <400> 12 aggaagccct ttcgg 15 <210> 13 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplicon of marker X1 <400> 13 agctgaagct gggccgtggg aaatgttgag acgagtgagt gcagagcctg aaagacaata 60 cggtagaaaa ggttacatcc gcg 83 <210> 14 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplicon of marker X2 <400> 14 ccacgtgcac tgagcgtctc ttgttgttca ccccaaataa actctgccgg aactggggcg 60 ggactcgcag gggcggagaa ggggggagac gggcagaggg cagaa 105 <210> 15 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplicon of marker X3 <400> 15 cggctttgcc tgaattagag ggcgtgagag ccacctgtgt ctcagcactg caattaaagc 60 aggaagccct ttcggaagca gccgtgtgca cca 93 <210> 16 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplicon of marker RASSF1A <400> 16 agctggcacc cgctgggcgc gctgggaagg gccgcacccg gctggagcgt gccaacgcgc 60 tgcgcatcgc gcggggcacc gcgtgcaacc ccacac 96 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RASSF1A <400> 17 agctggcacc cgctgg 16 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RASSF1A <400> 18 gtgtggggtt gcacgcg 17 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for RASSF1A <400> 19 acccggctgg agcgt 15

Claims (13)

  1. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커를 증폭하기 위한 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물로서, 상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커는 임산부 DNA에서는 비메틸화상태이고 태아 DNA에서는 메틸화상태로 존재하는 태아 특이적인 메틸화 마커인 것을 특징으로 하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물은 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 상기 메틸화 마커를 검출하기 위한 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하기 위한 완충액, dNTP, 및 DNA 중합효소를 더 포함하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물.
  4. 임산부 혈액 시료에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계; 및 분리된 메틸화된 DNA에 대해 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 임산부 혈액 중 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 검출방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 임산부 혈액에서 메틸화된 DNA를 물리적으로 분리하는 단계는 메틸화 DNA 특이적 면역 침전 또는 메틸화 부위를 인식하는 메틸-CpG 결합 도메인 단백질(methyl-CpG binding domain capture, MBD)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 존재 여부를 검출하는 단계는 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 실시간 중합효소연쇄반응은 상기 메틸화 마커의 증폭을 위한 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍; 및 상기 메틸화 마커 검출을 위한 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 존재 여부를 검출하는 단계는 분리된 메틸화된 DNA에 대해 상기 메틸화 마커의 존재량을 측정하되, 상기 메틸화 마커의 존재량은 임산부 혈액 시료 중에 존재하는 마커의 카피수를 정량적으로 측정하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커의 존재량은 다운증후군 진단에 필요한 정보를 제공하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 측정된 메틸화 마커의 존재량을 표준화된 기준과 비교하는 단계를 더 포함하는 검출방법으로서, 상기 표준화된 기준은 정상 태아를 임신한 여성의 혈액으로부터 측정된 마커의 존재량 또는 다운증후군 태아를 임신한 여성의 혈액으로부터 측정된 마커의 존재량인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 다운증후군 진단에 필요한 정보는 상기 메틸화 마커의 존재량을 기준 마커의 존재량과 비교하여 21번 염색체에 존재하는 상기 메틸화 마커의 비율적 증가를 확인하는 검출방법으로서, 상기 기준 마커는 21번 염색체를 제외한 정상 염색체 수를 갖는 보통 염색체에 태아 특이적으로 메틸화되어 존재하는 후성학적 메틸화 마커인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 기준 마커는 3번 염색체상의 50378107번에서 50378202번까지의 영역(GeneBank accession no. AP001745; UCSC Genome Browser Assembly: GRCh37/hg19)에 해당하는 RASSF1A인 검출방법으로서, 상기 기준 마커로 사용된 RASSF1A는 임산부 DNA에서는 비메틸화상태이고, 태아 DNA에서는 메틸화상태로 존재하는 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커인 것을 특징으로 하는 검출방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 메틸화 마커의 비율적 증가는, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 태아 특이적인 후성학적 메틸화 마커의 혈액 내 존재량; 및 상기 기준 마커인 RASSF1A의 혈액 내 존재량의 비율값에 근거하여 분석하되, 상기 비율값은 하기의 식에 의하여 계산되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
    식: 메틸화 마커의 임산부 혈액 내 존재량 / RASSF1A의 임산부 혈액 내 존재량
KR1020130112065A 2013-09-17 2013-09-17 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법 KR101519416B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130112065A KR101519416B1 (ko) 2013-09-17 2013-09-17 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130112065A KR101519416B1 (ko) 2013-09-17 2013-09-17 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150032062A KR20150032062A (ko) 2015-03-25
KR101519416B1 true KR101519416B1 (ko) 2015-05-12

Family

ID=53025428

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130112065A KR101519416B1 (ko) 2013-09-17 2013-09-17 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101519416B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109371121A (zh) * 2018-11-30 2019-02-22 成都凡迪医疗器械有限公司 一种用于产前诊断染色体异常的试剂盒

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE1022771B1 (nl) * 2015-10-14 2016-08-31 Multiplicom Nv Werkwijze en systeem om te bepalen of een vrouw zwanger is op basis van een bloedstaal

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Clin. Chem., Vol. 56, No. 1, pp. 90-98 (2010.01.)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109371121A (zh) * 2018-11-30 2019-02-22 成都凡迪医疗器械有限公司 一种用于产前诊断染色体异常的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150032062A (ko) 2015-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11597977B2 (en) Marker for prenatal diagnosis and monitoring
JP6513622B2 (ja) 非侵襲的出生前診断に有用な母体試料由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物
JP2023115354A (ja) 非侵襲性の出生前診断のために有用な、母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく濃縮のためのプロセスおよび組成物
ES2608954T3 (es) Nuevo marcador fetal de metilación
CA2887218C (en) System for amplification of a fetal dna species
CN108977543B (zh) 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂
JP5789605B2 (ja) 染色体異数性の検出方法
US8682594B2 (en) Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
CN106868106B (zh) 使用数字pcr的产前诊断方法
US20150275300A1 (en) Biomarkers for down syndrome prenatal diagnosis
KR101519416B1 (ko) 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법
WO2013129727A1 (en) Analysis method for determining fetal gender and apparatus therefor
Lim et al. Novel epigenetic markers on chromosome 21 for noninvasive prenatal testing of fetal trisomy 21
TWI385252B (zh) 一種癌症篩檢的方法
KR101879497B1 (ko) 태아 특이적 후성유전학적 바이오마커 dscr3 및 이를 포함하는 자간전증 진단용 조성물
KR101546364B1 (ko) 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법
KR101696707B1 (ko) 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법
US11473079B2 (en) Method for prenatal diagnosis using digital PCR
KR101546366B1 (ko) 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법
WO2020119626A1 (zh) 一种无创产前检测胎儿是否患有遗传疾病的方法
KR101879499B1 (ko) 후성유전학적 바이오마커 hyp2 및 이를 포함하는 임신 중 고혈압성 장애 진단용 조성물
RU2642622C2 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ количественного определения фетальной днк в кровотоке беременной женщины на основе анализа гиперметилированных участков днк плода
KR101879498B1 (ko) 바이오마커를 포함하는 임신 중 고혈압성 장애 진단용 조성물
TW201408778A (zh) 一種癌症篩檢的方法ｉｉｉ
KR20180019143A (ko) 디지털 pcr을 이용한 산전진단 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180508

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191106

Year of fee payment: 5